Sobre la base de una matriz peptídica derivada del virus de la hepatitis B (VHB), las respuestas de las células T CD4 específicas del VHB podrían evaluarse en paralelo con la identificación de epítopos de células T CD4 específicas del VHB.
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Artículo de método
Análisis de las respuestas de las células T CD4 específicas del VHB e identificación de epítopos de células T CD4 restringidas por HLA-DR basadas en una matriz peptídica
En este artículo
Resumen
Resumen
Las células T CD4 juegan un papel importante en la patogénesis de la hepatitis B crónica. Como población celular versátil, las células T CD4 se han clasificado como subconjuntos funcionales distintos en función de las citoquinas que secretaron: por ejemplo, IFN-γ para las células CD4 T helper 1, IL-4 e IL-13 para las células CD4 T helper 2, IL-21 para las células auxiliares foliculares CD4 T y LA IL-17 para las células CD4 T helper 17. El análisis de las células T CD4 específicas del virus de la hepatitis B (VHB) basadas en la secreción de citoquinas después de la estimulación de péptidos derivados del VHB podría proporcionar información no solo sobre la magnitud de la respuesta de las células T CD4 específicas del VHB, sino también sobre los subconjuntos funcionales de las células T CD4 específicas del VHB. Los enfoques novedosos, como la transcriptómica y el análisis metabolómico, podrían proporcionar información funcional más detallada sobre las células T CD4 específicas del VHB. Estos enfoques generalmente requieren el aislamiento de células T CD4 viables específicas del VHB basadas en multómeros del complejo II de histocompatibilidad mayor peptídico, mientras que actualmente la información sobre los epítopos de células T CD4 específicas del VHB es limitada. Sobre la base de una matriz peptídica derivada del VHB, se ha desarrollado un método para evaluar las respuestas de las células T CD4 específicas del VHB e identificar epítopos de células T CD4 específicas del VHB simultáneamente utilizando muestras de células mononucleares de sangre periférica de pacientes con infección crónica por VHB.
Introducción
Actualmente, hay 3 enfoques principales para analizar las células T específicas del antígeno. El primer enfoque se basa en la interacción entre el receptor de células T y el péptido (epítopo). Las células T específicas del antígeno podrían teñirse directamente con multómeros del complejo de histocompatibilidad peptídico mayor (MHC). La ventaja de este método es que podría obtener células T viables específicas de antígenos, adecuadas para el análisis transcriptómico / metabolómico posterior. Una limitación de este método es que no pudo proporcionar información sobre toda la respuesta de las células T a un antígeno específico, ya que requiere péptidos de epítopo validad....
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Protocolo
Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de cada paciente incluido en el estudio. El protocolo del estudio se ajusta a las directrices éticas de la Declaración de Helsinki de 1975 reflejadas en la aprobación a priori del comité de ética médica del Southwest Hospital.
1. Diseño de la matriz peptídica derivada del VHB
- Descargue secuencias de aminoácidos del antígeno central del VHB de las bases de datos del NCBI (GenBank: AFY98989.1).
- Compre péptidos derivados del antígeno central del VHB (un panel de 35 péptidos 15-mer superpuestos por 10 residuos, pureza > 90%, 4 mg / péptido) de un proveedor de servicios de sín....
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Resultados
La frecuencia de las células T CD4 secretoras de citoquinas se calcula como la suma de productores simples y productores dobles. Como se demuestra en la Figura 1,la frecuencia de las células T CD4 secretoras de α TNF-y la frecuencia de las células T CD4 secretoras de IFN-γ en el control de fondo (DMSO) son del 0,154% y 0,013% respectivamente. La frecuencia de TNF-α secretando células T CD4 y la frecuencia de IFN-γ secretando células T CD4 específicas para el grupo de péptidos Core11 son 0.20.......
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Discusión
Los pasos más críticos en este protocolo se enumeran a continuación: 1) suficientes PBMC de alta viabilidad para iniciar la expansión de PBMCs; 2) entorno apropiado para la expansión de pbMC; y 3) eliminación completa de grupos de péptidos residuales en cultivo de PBMC antes de la identificación del epítopo.
Todo el análisis en este protocolo depende de la proliferación robusta de células T CD4. En general, el número de PBMC después de la expansión de 10 días será de 2 a 3 veces el número inic.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81930061), la Fundación de Ciencias Naturales de Chongqing (cstc2019jcyj-bshX0039, cstc2019jcyj-zdxmX0004) y Chinese Key
Proyecto Especializado en Enfermedades Infecciosas (2018ZX10723203).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Albúmina Bovina V (BSA) | Beyotime | ST023 | |
| APC-conjugado Anti-humano TNF-α | eBioscience | 17-7349-82 | Manténgase protegido de la luz |
| Benzonase nucleasa | Sigma-Aldrich | E1014 | Límite de aglomeración de células |
| B líneas celulares linfoblastoides B (BLCL) | CENTRO DE INVESTIGACIÓN DEL CÁNCER FRED HUTCHINSON | HLA-DRB1*0803 homocigoto | |
| Líneas celulares linfoblastoides B (BLCL) | CENTRO DE INVESTIGACIÓN DEL CÁNCER FRED HUTCHINSON | HLA-DRB1*1202 homocigoto | |
| Matraz de cultivo celular (T75) | Corning | 430641 | |
| placa de cultivo celular (96 pocillos, fondo plano) | Corning | 3599 | |
| Placa de cultivo celular de fondo plano (96 pocillos, fondo redondo) | Corning | 3799 | Colador |
| Corning | CLS431751 | tamaño de poro 70 μ m, blanco, estéril | |
| Tubo de centrífuga (15 mL) | KIRGEN | KG2611 | Tubo |
| centrífuga estéril (50 mL) | Corning | 430829 | Centrífuga estéril |
| , refrigerada | Centrífuga Eppendorf | 5804R | |
| , centrífuga | refrigerada Thermo | ST16R | |
| , refrigerada | Thermo Legend | Micro 21R | |
| Kit Cytofix/Cytoperm (Conjunto de tampones de factores de transcripción) | BD Biosciences | 562574 Prepare la solución antes de usar | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | Mantener a temperatura ambiente para evitar la cristalización |
| Dulbecco' s Preparado de solución salina | ddH2O (1000 ml) que contiene NaCl (8000 mg), KCl (200 mg), KH2PO4 (200 mg) y Na2HPO4.7H2O (2160 mg). Ajuste el PH a 7.4. Esterilizar en autoclave. | ||
| Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare | 17-5442-03 | |
| Puntas de filtro (0.5-10) | Kirgen | KG5131 | Puntas de filtro estériles |
| (100-1000) | Kirgen | KG5333 | Puntas de filtro estériles |
| (1-200) | Kirgen | KG5233 | Estéril |
| conjugado con FITC Anti-humano CD4 | BioLegend | 300506 | Manténgalo protegido de la luz |
| Colorante de viabilidad fijable eFluor780 | eBioscience | 65-0865-14 | Manténgalo protegido de la luz |
| GolgiStop Inhibidor del transporte de proteínas (que contiene monensina) | BD Biosciences | 554724 | Inhibidor del transporte de proteínas |
| Hemocitómetro | Marca | 718620 | |
| Péptidos derivados del antígeno central del VHB | ChinaPéptidos | ||
| HEPES | Gibco | 15630080 | 100 ml |
| Suero Humano AB | Gemini Bio-Productos | 100-51 | 100 ml |
| Ionomicina | Sigma-Aldrich | I0634 | |
| KCl | Sangon Biotech | A100395-0500 | |
| KH2PO4 | Sangon Biotech | A100781-0500 | |
| LSRFortessa Citómetro de Flujo | BD | ||
| L-glutamina | Gibco | 25030081 | 100 ml |
| (1,5 ml) | Corning | MCT-150-C | Esterilización en autoclave antes de usar |
| Agitadores de microplacas Scientific | Industries MicroPlate Genie | ||
| Mitomicina C | Roche | 10107409001 | |
| Na2HPO4.7H2O | Sangon Biotech | A100348-0500 | |
| NaCl | Sangon Biotech | A100241-0500 | |
| Tubos de PCR (0,2 mL) | Kirgen | KG2331 | |
| PE/Cy7-conjugado Anti-humano CD8 | BioLegend | 300914 | Mantener protegido de la luz |
| Conjugado PE-PE-Anti-humano IFN-γ | eBioscience | 12-7319-42 | Mantener protegido de la luz |
| Penicilina Estreptomicina | Gibco | 15140122 | 100 ml |
| PerCP-Cy5.5-conjugado Anti-humano CD3 | eBioscience | 45-0037-42 | Mantener protegido de la luz |
| Forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| IL-2 humano recombinante | PeproTech | 200-02 | |
| Humano recombinante IL-7 | PeproTech | 200-07 | |
| RPMI Medio 1640 | Gibco | C11875500BT | 500 ml |
| Piruvato de sodio,100mM | Gibco | 15360070 | |
| Tinte azul de tripán (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Ultra-LEAF Purificado Anti-humano HLA-DR | BioLegend | 307648 | |
| Wizard ADN genómico Kit de purificación | Promega | A1125 |
Referencias
- Desmond, C. P., Bartholomeusz, A., Gaudieri, S., Revill, P. A., Lewin, S. R. A systematic review of T-cell epitopes in hepatitis B virus: identification, genotypic variation and relevance to antiviral therapeutics. Antiviral Therapy. 13, 161-175 (2008).
- Mizukoshi, E., et al.
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Reimpresiones y permisos
