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Artículo de método

Un modelo quirúrgico modificado de isquemia de la extremidad posterior en ApoE-/- Ratones que usan una incisión en miniatura

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DOI:

10.3791/62402

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13 de mayo de 2021

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1Department of Surgery, Medical Faculty Manheim, Heidelberg University, 2European Center of Angioscience ECAS, Medical Faculty Manheim, Heidelberg University, 3Computer-Assisted Clinical Medicine, Mannheim Institute for Intelligent Systems in Medicine, Medical Faculty Mannheim, Heidelberg University, 4Cooperative Core Facility Animal Scanner ZI, Medical Faculty Mannheim, Heidelberg University

En este artículo

Resumen

Este artículo demuestra un enfoque quirúrgico eficiente para establecer la isquemia aguda en ratones con una pequeña incisión. Este enfoque puede ser aplicado por la mayoría de los grupos de investigación sin ninguna actualización de laboratorio.

Resumen

El propósito de este estudio es introducir y evaluar un enfoque quirúrgico modificado para inducir isquemia aguda en ratones que se puede implementar en la mayoría de los laboratorios de animales. Contrariamente al enfoque convencional para la doble ligadura de la arteria femoral (DLFA), se realizó una incisión más pequeña en la región inguinal derecha para exponer la arteria femoral proximal (FA) para realizar DLFA. Luego, usando una sutura de 7-0, la incisión se arrastró a la región de la rodilla para exponer la FA distal. Se utilizó una resonancia magnética (MRI) en las extremidades posteriores bilaterales para detectar la oclusión de FA después de la cirugía. A los 0, 1, 3, 5 y 7 días después de la cirugía, la recuperación funcional de las extremidades posteriores se evaluó visualmente y se calificó utilizando la escala de Tarlov. La evaluación histológica se realizó después de la eutanasia de los animales 7 días después de DLFA. Los procedimientos se realizaron con éxito en la pierna derecha en diez ratones ApoE-/-, y ningún ratón murió durante la observación posterior. Los tamaños de la incisión en los 10 ratones fueron inferiores a 5 mm (4,2 ± 0,63 mm). Los resultados de la resonancia magnética mostraron que el flujo sanguíneo de FA en el lado isquémico estaba claramente bloqueado. Los resultados de la escala de Tarlov demostraron que la función de la extremidad posterior disminuyó significativamente después del procedimiento y se recuperó lentamente durante los siguientes 7 días. La evaluación histológica mostró una respuesta inflamatoria significativa en el lado isquémico y una densidad microvascular reducida en la extremidad posterior isquémica. En conclusión, este estudio introduce una técnica modificada utilizando una incisión en miniatura para realizar isquemia de las extremidades posteriores (HLI) utilizando DLFA.

Introducción

Existe una necesidad insatisfecha de modelos animales preclínicos para la investigación en enfermedades vasculares como la enfermedad arterial periférica (EAP). A pesar de los avances avanzados en el diagnóstico y el tratamiento, hubo más de 200 millones de pacientes con EAP en 20181, y su número aumenta constantemente. Aunque se han descrito varios enfoques terapéuticos novedosos2,3,4,5,6,7, la traducción exitosa de estas modalidades terapéuticas en la aplicación clínica sigue siendo una tarea desalentadora. Por lo tanto, se requieren modelos experimentales in vivo confiables y relevantes que simulen la condición de la enfermedad humana para investigar el mecanismo potencial y la eficiencia de estos nuevos enfoques terapéuticos para tratar la EAP6,7.

La hiperlipidemia y la aterosclerosis (EA) son los principales factores de riesgo para el desarrollo de la EAP. Los ratones ApoE-/- (con una dieta alta en grasas) muestran un metabolismo anormal de las grasas e hiperlipidemia y posteriormente desarrollan placas ateroscleróticas que convierten a los ratones en ApoE-/- como la mejor opción para simular la EAP clínicamente relevante. Los modelos animales preclínicos de HLI se generan a través de la doble ligadura de la arteria femoral (DLFA), que es el enfoque más utilizado en laboratorios de todo el mundo8,9,10,11, 12,13, 14,15 para simular isquemia aguda sobre crónica. Sin embargo, este enfoque generalmente requiere una incisión relativamente grande e invasiva. Además, conduce inevitablemente a que los animales (especialmente los ratones) sufran un aumento de la lesión por dolor y la inflamación, lo que también influye en los resultados experimentales posteriores5,6,16,17. Este artículo describe un modelo de HLI agudo sobre crónico en ratones APOE-/- mediante el uso de una incisión muy pequeña.

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Protocolo

NOTA: Todos los procedimientos experimentales se realizaron de acuerdo con la directriz CE 2010/63/EU y han sido aprobados por la legislación local alemana (35-9185.81/G[1]239/18). Diez ratones machos ApoE-/- con el fondo C57BL /6J, con un peso de 29.6-38.0 g, fueron alojados en un ciclo de luz / oscuridad de 12 h y alimentados con una dieta occidental (1.25% de colesterol y 21% de grasa) y agua ad libitum durante 12 semanas a partir de la edad de 8 semanas. HLI se realizó en ratones de 20 semanas de edad como se describe a continuación.

1. Inducción de HLI en ratones ApoE-/-

  1. Preparar el equipo y las herramientas necesarias para la cirugía (ver la Tabla de Materiales y la Figura 1). Esterilice los instrumentos quirúrgicos mediante autoclave antes de usarlos y use un esterilizador de cuentas de vidrio durante la operación.
  2. Anestesiar al ratón con una inyección subcutánea (S.C.) de una mezcla de midazolam (5 mg/kg), medetomidina (0,05 mg/ml/kg) y fentanilo (0,5 mg/kg) antes de todos los procedimientos quirúrgicos.
    1. Después del inicio de la anestesia, use el ungüento veterinario en los ojos para prevenir la sequedad y confirme la ausencia del reflejo de extracción del pedal en la extremidad anterior y posterior.
  3. Después, coloque el ratón sobre una almohadilla térmica para mantener la temperatura corporal central a aproximadamente 37 °C. Usando hisopos de algodón y crema depilatoria, elimine cuidadosamente el vello de la piel de la extremidad posterior en el lado derecho.
    NOTA: La crema depilación debe usarse en cantidad suficiente para cubrir la extremidad posterior, especialmente la región inguinal donde se realizará la incisión. La crema depilatoria debe usarse durante menos de 3 minutos y debe eliminarse posteriormente con hisopos de algodón humedecidos de 2 a 3 veces.
  4. Coloque el ratón en posición supina sobre la almohadilla térmica bajo un microscopio de disección. Use un antiséptico para la piel (consulte la Tabla de materiales)para desinfectar la piel del ratón. Después, use pinzas puntiagudas y tijeras quirúrgicas para hacer una incisión de aproximadamente 3-4 mm en el medio de la región inguinal. Consulte la Figura 2 para obtener un esquema del procedimiento.
  5. Retire el tejido graso subcutáneo con cuidado con la ayuda de fórceps puntiagudos finos para exponer el haz neurovascular femoral proximal. Use cuidadosamente las pinzas puntiagudas finas para perforar la membrana de la vaina femoral. Use un hisopo de algodón humedecido con solución salina para mover la arteria femoral (FA) cuidadosamente lejos del nervio femoral (FN) y la vena femoral (FV).
  6. Pase dos suturas absorbibles 7-0 a través del FA proximal y haga nudos dobles usando tijeras de resorte para transectar el FA entre los dos lazos.
  7. Para exponer la FA distal, pase una sutura absorbible 7-0 a través del borde inferior de la incisión y arrastre suavemente la incisión a la región del lado derecho de la rodilla de la extremidad posterior.
  8. Mueva el tejido subcutáneo a un lado con cuidado para exponer el haz neurovascular. Use pinzas puntiagudas finas para perforar la membrana de la vaina femoral y diseccionar el FA del FV y FN.
  9. Pase dos suturas absorbibles 7-0 a través del FA distal y haga nudos dobles. Use tijeras de resorte para transectar el FA entre los dos lazos.
    NOTA: No se realizó ligadura en el miembro izquierdo, que sirvió como control en cada ratón.
  10. Después, use suturas absorbibles 6-0 para coser la incisión. Coloque el ratón en una almohadilla térmica en una jaula limpia y continúe monitoreando sus parámetros vitales hasta la recuperación. Proporcionar analgésicos postoperatorios: Buprenorfina s.c. (0,1 mg/kg de peso corporal cada 8 horas durante 48 h). 48 h después de la operación, administrar metamizol en agua potable (24 mg/5mL de agua corresponde a una dosis de 200 mg/kg 4 veces al día).

2. Resonancia magnética

NOTA: Un día después de DLFA, los ratones deben someterse a resonancias magnéticas para evaluar el bloqueo de FA.

  1. Coloque el ratón en una cámara de inducción transparente y anestesia al ratón con 1,5-2% de isoflurano en el aire ambiente hasta la pérdida del reflejo de enderezamiento.
  2. Coloque el ratón en una cama de animal calentada equipada con un soporte de mordida y colocada hacia el imán con un sistema controlado por láser. Mantener la temperatura corporal a 37±1 °C.
  3. Durante la adquisición de imágenes, mantenga la anestesia con 1.5-2% de isoflurano en el aire ambiente y controle la respiración con una sonda de presión.
  4. Adquirir imágenes en la orientación de corte transversal utilizando una secuencia de angiografía tridimensional (3D) de tiempo de vuelo (TOF) con parámetro de tiempo de eco (TE)/tiempo de repetición (TR)/ángulo de volteo (FA) = 2 ms/12 ms/13°, cuatro promedios, una matriz de adquisición de 178 x 144 reconstruida a 256 x 192 y 121 cortes, resultando en una resolución isotrópica de 0.15 mm3. Para suprimir la señal de las venas, coloque una rebanada de saturación distalmente a las extremidades posteriores.

3. Evaluación clínica y seguimiento

  1. Estimar la recuperación funcional en los días1º,3º,5ºy 7º después de la cirugíamediante el uso de la puntuación funcional escala de Tarlov18,19 (Tabla 1).

4. Evaluación histológica

  1. Siete días después de la cirugía, aplique la inyección de pentobarbital (115 mg / kg) para sacrificar a los ratones.
  2. Solución salina tamponada con fosfato de perfusa (PBS) que contiene paraformaldehído al 1% (PFA) a través del ventrículo cardíaco izquierdo (100 ml por ratón). Fijar el gastrocnemio bilateral (Gm) de los ratones en PFA al 4% durante la noche a 4 °C.
  3. Incrustar la muestra en parafina de acuerdo con el protocolo descrito anteriormente20.
    1. Corte secciones de 4-5 μm de espesor del bloque de tejido incrustado en parafina en un microtomo. Con la ayuda de un pincel redondo, coloque las secciones de tejido cortado en el baño de agua mantenido a 42 ° C.
    2. Inserte el portaobjetos del microscopio en el agua en un ángulo de 45° y colóquelo cuidadosamente debajo del grupo de secciones que se van a recoger.
    3. Levante con cuidado el tobogán del agua y permita que las secciones se adhieran al tobogán y se sequen durante la noche en la incubadora de sobremesa a 37 ° C.
  4. Realizar tinción de hematoxilina/eosina (HE) de las secciones de parafina.
    1. Coloque las diapositivas que contienen las secciones en soportes deslizantes. Prepare 3 recipientes de xileno fresco y coloque las diapositivas en cada recipiente durante 5 minutos para desparafinar las secciones.
    2. Rehidrate las secciones sumergiendo las rodajas sucesivamente en 96%, 80%, 70%, 50%, 30% de etanol y agua desionizada durante 5 min cada una.
    3. Tinción en solución de hematoxilina durante 10 min.
    4. Transfiera las rodajas a un recipiente con agua desionizada y enjuague colocándolas debajo del agua corriente del grifo durante 5 minutos.
    5. Con un microscopio, verifique la intensidad de la tinción de hematoxilina. Si la tinción permite la identificación de los núcleos celulares claramente, continúe con el siguiente paso. Si la intensidad de la tinción no facilita la identificación de los núcleos celulares o si la intensidad de la tinción es débil, coloque el portaobjetos en la solución de hematoxilina durante 1 min, repita el lavado con agua (paso 4.4.4) y luego verifique nuevamente.
    6. Contratinción en solución eosin-Y durante 5 min.
    7. Deshidrate las secciones sumergiendo las rodajas sucesivamente en recipientes que contengan agua desionizada y 30%, 50%, 70%, 80% y 96% de etanol sucesivamente durante una duración de 10 s cada uno. A continuación, coloque las secciones secuencialmente en tres recipientes de xileno fresco durante 10 s cada uno.
    8. Coloque las diapositivas horizontalmente en mapas de almacenamiento de diapositivas microscópicas con las secciones hacia arriba. Agregue suficiente medio de montaje en la diapositiva y monte las diapositivas con fundas.
  5. Realizar la tinción inmunohistoquímica (IHC) de las secciones de parafina.
    1. Repita los pasos de desparafinación y rehidratación 4.4.1-4.4.2. Luego, sumerja las secciones en un recipiente con tampón de citrato de sodio de 10 mM, pH 6, y lleve la muestra a ebullición en un microondas.
      NOTA: Como el sobrecalentamiento o el subcalentamiento de las muestras puede causar manchas inconsistentes, mantenga la temperatura justo por debajo del punto de ebullición durante 10 minutos.
    2. A continuación, enfríe las secciones en una mesa de trabajo durante 30 minutos. A partir de entonces, lave las secciones en PBS tres veces durante 5 min. Seque cuidadosamente el área alrededor de la muestra y dibuje un círculo grande alrededor de la muestra con una pluma hidrofóbica. .
      NOTA: Nunca toque la muestra. El marcado con una pluma hidrofóbica crea un límite hidrofóbico, lo que facilita el uso de un volumen menor de solución de anticuerpos.
    3. Apague la actividad de la peroxidasa endógena colocando la sección en 0.3% H2O2 en PBS durante 10 min. Secciones de bloque con 400 μL de tampón de bloque (PBS contiene 3% de albúmina sérica bovina y 0,3% de detergente no iónico) durante 1 h a temperatura ambiente en una cámara humidificada.
    4. Lave las secciones en PBS durante 5 min. A continuación, agregue 100-400 μL de anticuerpo anti-CD31 diluido (1:250) suficiente para cubrir la sección. Después de esto, incubar las secciones durante la noche a 4 ° C en una cámara humidificada.
      NOTA: Asegúrese de que la sección esté completamente cubierta con la solución de anticuerpos.
    5. Retire el anticuerpo primario y lave las secciones tres veces en PBS durante 5 minutos cada una.
    6. Prepare la mezcla de 3, 3'-diaminobenzidina (DAB) agregando 1 gota del concentrado dab a 1 ml del diluyente DAB y mezcle bien. Después, agregue 100-400 μL de mezcla dab a las secciones y monitoree de cerca a ojo durante 2 minutos hasta que se observe una intensidad de tinción aceptable.
      NOTA: Asegúrese de que la sección esté completamente cubierta con la mezcla DAB.
    7. Después, enjuague con agua corriente del grifo durante 5 min. Realice la tinción de hematoxilina como se describe en los pasos 4.4.3-4.4.5.
    8. Realice la tinción de eosina-Y descrita en el paso 4.4.6. Realice los pasos de deshidratación descritos en el paso 4.4.7.
    9. Montaje de las secciones con fundas utilizando medio de montaje. Utilice ImageJ para estimar el porcentaje de área cd31 positiva (%) en 5 campos seleccionados al azar (40x) que pueden considerarse como densidad microvascular como se describió anteriormente21.

5. Análisis estadístico

  1. Utilice un software de análisis estadístico para expresar los resultados como media ± desviación estándar y para realizar una prueba tno emparejada en las comparaciones. Considere que P < 0,05 es estadísticamente significativo.

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Resultados

Características de los ratones ApoE-/-
Las cirugías DLFA se realizaron con éxito en 10 ratones para establecer el modelo HLI, y ninguno de los ratones murió después del procedimiento. Para seguir los cambios en el peso corporal, los ratones fueron pesados antes del procedimiento DLFA (Pre-DLFA) y 7 días después de la cirugía DLFA (Post-DLFA). Los pesos pre-DLFA variaron de 29,6 a 38,0 g (media 34,74 ± 2,47 g), y los pesos post-DLFA variaron de 26,5 a 34,1...

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Discusión

Este estudio informa un enfoque modificado, simplificado y quirúrgicamente eficiente para establecer un modelo de HLI en ratones ApoE-/- utilizando doble ligadura en las regiones proximal y distal de la FA a través de una incisión de 3-4 mm sin ninguna actualización de laboratorio requerida. La principal característica de este método es el menor tamaño de la incisión en comparación con los estudios previamente informados que describen modelos de HLI deratón 8,

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Divulgaciones

Los autores declaran que el contenido del artículo fue compuesto en ausencia de cualquier relación comercial o financiera que pueda interpretarse como un posible conflicto de intereses.

Agradecimientos

Los autores agradecen a Viktoria Skude, Alexander Schlund y Felix Hörner por el excelente soporte técnico.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
10x Tampón de fosfato salinoRoth9143.1Se utiliza para la tinción de hematoxilina y eosina y la tinción inmunohistoquímica
30% H2O2Roth9681.2Se utiliza para la tinción inmunohistoquímica
6-0 suturas absorbiblesPROLENE8776HSe utiliza para suturar la piel
6-0 sutura absorbiblePROLENEEP8706Utilizado en Cirugía
7-0 suturas reabsorbiblesPROLENEEH8021ESe utiliza para ligar la arteria
7-0 sutura absorbiblePROLENEEP8755Utilizado en cirugía
Ácido acéticoRoth6755.1Se utiliza para la tinción de hematoxilina y eosina
Albúmina Fraktion VRoth8076.2Se utiliza para la tinción de inmunohistoquímica
AutoclaveSystec GmbHSystec VX-150Se utiliza para la esterilización del instrumental quirúrgico
Microscopio Axio vert A1Carl ZeissZEISS Axio Vert.A1Se utiliza para ver y tomar imágenes de la tinción de hematoxilina y eosina y la tinción de inmunohistoquímica
Bruker BioSpec 94/20 AVIIIBruker Biospin MRI GmbHN/AEscanear la obstrucción de la arteria femoral
Buprenovet Sine 0,3mg/mlBayer AG2542 (WDT)Se utiliza en el tratamiento del dolor postoperatorio. Dosis: 0,1 mg/kg de peso corporal cada 8 horas durante 48 h después de la operación
Anticuerpo CD31Abcamab28364Se utiliza para la tinción inmunohistoquímica
Solución de eosina Y al 0,5 % en aguaRothX883.1Se utiliza para la tinción de hematoxilina y eosina
Solución de recuperación de epítopos pH 6Leica Biosystems6046945Se utiliza para la tinción inmunohistoquímica
Etanol ≥ 99,5 %Roth5054.1Se utiliza para la tinción de hematoxilina y eosina y la tinción inmunohistoquímica
FentaniloCayman Chemical437-38-7Se utiliza para la anestesia
Pinzas de punta finaMedixplus93-4505SSe utiliza para separar la arteria del nervio y la vena
Esterilizador de perlas de vidrioSimon KellerTipo 250Se utiliza para la esterilización del instrumental quirúrgico
Iris de Graefe pinza curvadaVUBUVUBU-02-72207Se utiliza para la separación roma de la piel y el tejido subcutáneo
Crema depiladora, Veet (con aloe vera)Reckitt Benckiser108972Eliminar el pelo de las extremidades traseras de los ratones
Placa calefactoraSTÖ RK-TRONIC7042092Mantener la temperatura de satélite de los ratones
HematoxilinaRothT865.2Se utiliza para la tinción de hematoxilina y eosina y la tinción inmunohistoquímica
Microscopio quirúrgicoLeica LeicaM651Amplíe el campo de visión para facilitar la operación
DAB líquido + sustrato Sistema de cromógenoDakoK3468Se utiliza para la tinción
inmunohistoquímicaRatones machos ApoE-/-Charles River LaboratoriesN/ASe utiliza para establecer el modelo de ratones de enfermedad arterial periférica
MedetomidinaCayman Chemical128366-50-7Utilizado para la anestesia
Micro Needle HolderBlack & Negro QuirúrgicoB3B-18-8Sosteniendo la aguja
Pinza de atado de micro suturaLife Saver Surgical IndustriesPS-MSF-145Se utiliza para ayudar en el anudado durante la cirugía
MicrotomoBiobaseBk-MT268mSe utiliza para el corte de tejidos
MidazolamRatiopharm44856.01.00Se utiliza para la anestesia
de control y compuerta de animales pequeños compatible con RM Modelo 1025SA InstrumentsN/amonitoreo de los signos vitales del animal durante la resonancia magnética
Octeniderm farblosSchü LKE & Mayr GmbH180212utiliza para la desinfección de la piel
Pomada para los ojos y la narizBayer AG1578675Mantener los ojos húmedos bajo anestesia
ParaformaldehídoRoth0335.1Se utiliza para la fijación del tejido
PentobarbitalNembutal76-74-4Utilizado para la anestesia
Solución salinaDeltaSelect1299.99.99Utilizado para anestesia
Tijeras de mango de resorte con puntas finas y afiladasBlack & Quirúrgico NegroB66167Se utiliza para cortar la arteria
Tijeras SuperCutNegro & Negro QuirúrgicoB55992Utilizado para cortar la piel
Triton X-100Roth9002-93-1Utilizado para la tinción de inmunohistoquímica
occidental, 1.25% Colesterolssniff Spezialdiä ten GmbHE15723-34Dieta para ratones
XilenoRoth4436.3Se utiliza para la tinción de hematoxilina y eosina y la tinción inmunohistoquímica
Sistema dieta

Referencias

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Ligadura de la arteria femoralratones knockout para ApoEcirug a de incisi n miniaturat cnica de doble ligaduraresonancia magn ticaevaluaci n mediante la escala de Tarlovdensidad microvascularlesi n por isquemia reperfusi nevaluaci n histol gica
Un modelo quirúrgico modificado de isquemia de la extremidad posterior en ApoE-/- Ratones que usan una incisión en miniatura
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