Tinción Inmunofluorescente Para La Visualización De Proteínas Asociadas A La Heterocromatina En Las Glándulas Salivales Drosophila

Summary

Este protocolo tiene como objetivo visualizar agregados de heterocromatina en células de Politeno de Drosophila.

Abstract

La visualización de los agregados de la heterocromatina immunostaining puede ser desafiadora. Muchos componentes mamíferos de la cromatina se conservan en Drosophila melanogaster. Por lo tanto, es un excelente modelo para estudiar la formación y el mantenimiento de la heterocromatina. Las células politenizadas, como las que se encuentran en las glándulas salivales de las larvas de D. melanogaster de tercer estadio, proporcionan una excelente herramienta para observar la cromatina amplificada casi mil veces y han permitido a los investigadores estudiar los cambios en la distribución de la heterocromatina en el núcleo. Aunque la observación de los componentes de la heterocromatina se puede llevar a cabo directamente en preparaciones cromosómicas de politeno, la localización de algunas proteínas puede verse alterada por la gravedad del tratamiento. Por lo tanto, la visualización directa de la heterocromatina en las células complementa este tipo de estudio. En este protocolo, describimos las técnicas immunostaining usadas para este tejido, el uso de anticuerpos fluorescentes secundarios, y la microscopia confocal de observar estos agregados de la heterocromatina con mayor precisión y detalle.

Introduction

Desde los primeros estudios de Emil Heitz^1,la heterocromatina ha sido considerada un importante regulador de procesos celulares como la expresión génica, la separación meiótica y mitótica de los cromosomas, y el mantenimiento de la estabilidad del genoma^2,3,4.

La heterocromatina se divide principalmente en dos tipos: heterocromatina constitutiva que define característicamente secuencias repetitivas, y elementos transponibles que están presentes en sitios cromosómicos específicos como los telómeros y centrómeros. Este tipo de....

Protocol

1. Cultivo de larvas de tercer estadio

1. Preparar 1 litro de medio estándar añadiendo 100 g de levadura, 100 g de azúcar de caña entera sin refinar, 16 g de agar, 10 mL de ácido propiónico y 14 g de gelatina. Disuelva todos los ingredientes excepto la levadura en 800 mL de agua del grifo y luego disuelva la levadura. Autoclave inmediatamente durante 30 minutos.
   1. Después, deje que el medio se enfríe a 60 °C y agregue ácido propiónico a una concentración final al 0.01%. Dejar reposar la botella hasta que se forme la gelatina.
2. Para optimizar el cultivo de larvas de 3o instar, primero recoja a los adultos mayores de 5 a 10 días y colo....

Results

Los resultados representativos de la inmunotensión de HP1a en las glándulas salivales de Drosophila se muestran en la Figura 1. Un resultado positivo es observar un punto focal(Figura 1a)(agregado heterocromático o condensado). Un resultado negativo es ninguna señal o una señal dispersa. A veces se puede observar una señal doble, es decir, con un punto doble (Figura 1c), pero por lo general se produce en cantidades más pequ.......

Discussion

La función celular de los organismos eucariotas puede definir la estructura 3D dentro del núcleo, que está respaldada por interacciones entre diferentes proteínas con cromatina y varias moléculas, incluido el ARN. En los últimos tres años, los condensados biológicos que han tenido relevancia, incluida la heterocromatina, han tomado un papel fundamental en la determinación de la separación de fases promoviendo la organización espacial nuclear distinta de la cromatina activa y represiva ^16,

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL	Axygen MCT-150-C	11351904	marca no crítica
16% de formaldehído	Thermo Scientific	28908
AF1 Citifluor	Ted pella	19470	25 mL
BSA, Biología Molecular Grado	Roche	10735078001	marca no crítica
Completo, inhibidores de la proteasa Proteasa ultra libre de EDTA inhibidores Merck		5892953001
Coverslip	Corning	CLS285022-200EA	22x22, marca no crítica
DTT	Sigma	d9779	marca no crítica
EDTA	Sigma	E5134	marca no crítica
Marca EGTA			no crítica
Corredera de vidrio	Sello de oro	marca 3011	no crítica
H3BO3	Baker	0084-01	marca no crítica
H3K9me3	Abcam	8889
HP1a	Hybridoma Bank	C1A9	Forma del producto  Concentrado 0.1 mL
KCl	Marca Baker	3040-01	crítico
Metanol	Marca Baker	9070-03	No crítico
NaCl	Sigma	71376	marca no crítico
Marca NaOH			no crítico
Marca PIPES			no crítico
Rotador	Thermo Scientific	13-687-12Q	Labquake Agitador de tubos
Thermo Mixer C	Eppendorf	13527550	SmartBlock 1.5 mL
Tris	Milipore	648311	marca no crítica
Triton X-100	Sigma	T8787	100 mL, marca no crítica
β-mercaptoetanol	Bio-Rad 1610710		25 mL, marca no crítica