Artículo de método

Tinción Inmunofluorescente Para La Visualización De Proteínas Asociadas A La Heterocromatina En Las Glándulas Salivales Drosophila

DOI:

10.3791/62408

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21 de agosto de 2021

 ,  , 
1Instituto de Biotecnología, Departamento de Genética del Desarrollo y Fisiología Molecular, Universidad Nacional Autónoma de México

En este artículo

Resumen

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Este protocolo tiene como objetivo visualizar agregados de heterocromatina en células de Politeno de Drosophila.

Resumen

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La visualización de los agregados de la heterocromatina immunostaining puede ser desafiadora. Muchos componentes mamíferos de la cromatina se conservan en Drosophila melanogaster. Por lo tanto, es un excelente modelo para estudiar la formación y el mantenimiento de la heterocromatina. Las células politenizadas, como las que se encuentran en las glándulas salivales de las larvas de D. melanogaster de tercer estadio, proporcionan una excelente herramienta para observar la cromatina amplificada casi mil veces y han permitido a los investigadores estudiar los cambios en la distribución de la heterocromatina en el núcleo. Aunque la observación de los componentes de la heterocromatina se puede llevar a cabo directamente en preparaciones cromosómicas de politeno, la localización de algunas proteínas puede verse alterada por la gravedad del tratamiento. Por lo tanto, la visualización directa de la heterocromatina en las células complementa este tipo de estudio. En este protocolo, describimos las técnicas immunostaining usadas para este tejido, el uso de anticuerpos fluorescentes secundarios, y la microscopia confocal de observar estos agregados de la heterocromatina con mayor precisión y detalle.

Introducción

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Desde los primeros estudios de Emil Heitz1,la heterocromatina ha sido considerada un importante regulador de procesos celulares como la expresión génica, la separación meiótica y mitótica de los cromosomas, y el mantenimiento de la estabilidad del genoma2,3,4.

La heterocromatina se divide principalmente en dos tipos: heterocromatina constitutiva que define característicamente secuencias repetitivas, y elementos transponibles que están presentes en sitios cromosómicos específicos como los telómeros y centrómeros. Este tipo de heterocromatina se define principalmente epigenéticamente por marcas de histonas específicas como la di o tri-metilación de la lisina 9 de la histona H3 (H3K9me3) y la unión de la proteína heterocromatina 1a (HP1a)5,6. Por otro lado, la heterocromatina facultativa se localiza a través de los brazos del cromosoma y consiste principalmente en genes silenciados por el desarrollo7,8. La inmunotinción de bloques de heterocromatina en células metafásicas, o la observación de agregados de heterocromatina en células interfase, ha revelado mucha luz en la comprensión de la formación y función de las regiones heterocromáticas9.

El uso de Drosophila como sistema modelo ha permitido el desarrollo de herramientas esenciales para estudiar la heterocromatina sin el uso de microscopía electrónica10. Desde la descripción de la posición del efecto variegación y el descubrimiento de proteínas asociadas a la heterocromatina, como la HP1a, y las modificaciones postraduccionales de histonas, muchos grupos han desarrollado varias técnicas inmunohistoquímicas que permiten la visualización de estas regiones heterocromáticas10,11.

Estas técnicas se basan en el uso de anticuerpos específicos que reconocen proteínas asociadas a la heterocromatina o marcas de histonas. Para cada tipo de célula y anticuerpo, las condiciones de fijación y permeabilización deben determinarse empíricamente. Además, las condiciones pueden variar si se utilizan procesos mecánicos adicionales como técnicas de aplastamiento. En este protocolo, describimos el uso de las glándulas salivales de Drosophila para estudiar focos heterocromáticos. Las glándulas salivales tienen células politenizadas que contienen más de 1.000 copias del genoma, proporcionando así una vista amplificada de la mayoría de las características de la cromatina, con la excepción del ADN satélite y algunas regiones heterocromáticas que están poco replicadas. Sin embargo, las regiones de la heterocromatina se visualizan fácilmente en preparaciones del cromosoma del politeno, pero las técnicas que aplastan pueden interrumpir a veces los complejos cromatina-limitados característicos o la arquitectura de la cromatina. Por lo tanto, la inmunolocalización de proteínas en el tejido entero de la glándula salival puede superar estos efectos no deseados. Hemos utilizado este protocolo para detectar varias proteínas ligadas a la cromatina, y hemos demostrado que este protocolo combinado con cepas mutantes de Drosophila puede ser utilizado para estudiar la disrupción de la heterocromatina12.

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Protocolo

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1. Cultivo de larvas de tercer estadio

  1. Preparar 1 litro de medio estándar añadiendo 100 g de levadura, 100 g de azúcar de caña entera sin refinar, 16 g de agar, 10 mL de ácido propiónico y 14 g de gelatina. Disuelva todos los ingredientes excepto la levadura en 800 mL de agua del grifo y luego disuelva la levadura. Autoclave inmediatamente durante 30 minutos.
    1. Después, deje que el medio se enfríe a 60 °C y agregue ácido propiónico a una concentración final al 0.01%. Dejar reposar la botella hasta que se forme la gelatina.
  2. Para optimizar el cultivo de larvas de 3o instar, primero recoja a los adultos mayores de 5 a 10 días y coloque 50 (25 machos y 25 hembras) en una botella de cuello ancho de medios estándar.
  3. Coloque la botella con las moscas en una incubadora de temperatura controlada a 25 °C hasta que el número de huevos puestos sea de 50 (aproximadamente 12 horas para la cepa de tipo salvaje).
  4. Después de que el tiempo de incubación haya terminado, retire los adultos y transfiéralos a una nueva botella para repetir el procedimiento. Dejar que los embriones crezcan a 18 °C durante 72 horas
    NOTA: Para obtener más información sobre las condiciones de mantenimiento de las existencias de Drosophila, consulte Tennessen &Thymmel13.

2. Colección de larvas

  1. Para la recolección de larvas elija las larvas errantes que no tienen espiráculos everted. Después de la eversión de los espiráculos, la larva entra en la etapa prepupal, conservando excelentes cromosomas politeno adecuados para el análisis. Sólo después de 12 horas las células de la glándula salival comienzan a prepararse para la muerte celular programada14,15.
  2. Tome quince larvas de 3° y colótelas en un vaso de reloj para lavarlas. Luego transferirlos a una solución salina helada o PBS (1x PBS: 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4,2 mM KH2PO4,ajustar el pH a 7.4).
  3. Diseccione de 15 a 30 pares de glándulas salivales (o tantas como sea posible en 30 minutos) en PBS frío con inhibidores de la proteasa bajo el microscopio estereoscópico. Transfiera las glándulas salivales a un tubo de 1,5 mL con PBS helado.
  4. Lavar una vez con 1 mL de PBS más inhibidores de la proteasa. Espere a que el tejido llegue a la parte inferior del tubo.
  5. Después del lavado, retire el PBS con una pipeta de 1000 μL. Tenga cuidado de no tocar el tejido.
    1. Alternativamente, diseccione las glándulas salivales en 5 mL de PBS para eliminar la necesidad de esta etapa de lavado y proceda a la etapa 3 transfiriendo las glándulas salivales a 0,5 mL del tampón de fijación de Ruvkun que se describe a continuación.

3. Fijación del tejido de la glándula salival

  1. Después de retirar el PBS del último paso, agregue directamente 0.5 mL de 1x tampón de fijación de Ruvkun, con 50% de metanol (agregue 0.5 mL de metanol) y 2% de formaldehído.
    NOTA: 2x solución de Ruvkun es 160 mM KCl, 40 mM NaCl, 20 mM EGTA, 30 mM TUBERÍAS a pH 7.4.
  2. Incubar durante 2 horas a 4 °C con rotación suave.

4. Lavado de tejido de las glándulas salivales

  1. Realizar un lavado de rotación de 5 minutos con 1 mL de tampón Tris/Tritón (100 mM Tris pH 7,4, 1% Tritón X-100 y 1 mM EDTA).
    NOTA: Espere a que el tejido llegue a la parte inferior del tubo.

5. Permeabilización

  1. Incubar las glándulas salivales en 1 mL de Tris/Triton X-100 (lo mismo que arriba). Para algunas proteínas podría ser necesario añadir un 1% β-mercaptoetanol.
  2. Incubar durante 2 horas a 37°C con temblor leve (300 rpm).

6. Paso de preservación (opcional)

NOTA: Si no procede inmediatamente a la incubación con el anticuerpo, preservar el tejido de la siguiente manera.

  1. Lavar con 1 mL de Tampón BO3 (0.01 M H3BO3 pH 9.2 + 0.01 M NaOH) y luego incubar en BO3/10 mM TDT a 37 °C con agitación leve (300 rpm) durante 15 minutos.
  2. Al final del período de incubación, realice un lavado con 1 mL de BO3 tampón solo.
    NOTA: Espere a que el tejido llegue a la parte inferior del tubo.
  3. Añadir 1 mL de PBS. Conservar el tejido de esta solución a 4 °C durante un hasta 72 horas y luego continuar con el siguiente paso. Este paso es particularmente útil cuando se trabaja con diferentes cepas mutantes que pueden presentar un ciclo de vida retrasado, por lo que la inmunodetección se puede realizar al mismo tiempo junto con los controles.

7. Bloqueo de tejidos

  1. Incubar las glándulas salivales en 1 mL de Buffer B (PBS + 0,1% BSA + 0,5% Triton X-100 + 1 mM EDTA) durante 2 horas a temperatura ambiente con rotación.

8. Inmunosutención

  1. Retire todo el tampón B y agregue el tampón A (PBS + 0.1% BSA) más anticuerpos de interés.
    NOTA: Utilizamos el HP1a C1A9c (anticuerpo concentrado) de Hybridoma Bank hasta 1:3000. Al usar el C1A9s (sobrenadante) hemos intentado de 1:100 a una dilución de 1:500 y cualquier dilución entre este rango funciona bien) durante la noche a 4 oC con rotación. En este punto es importante que la sacudida no levante burbujas que podrían dañar el anticuerpo.

9. Lavado inmunosutensible

  1. Realice lavados de 3 x 15 minutos con tampón B bajo agitación a temperatura ambiente usando 1 mL cada vez.
  2. Transfiera las glándulas al almacenador intermediario B junto con el anticuerpo secundario acoplado a un fluoróforo por 2 horas bajo rotación en 4 oC (el anticuerpo secundario Alexa fluor 568 Invitrogen fue utilizado 1:3000).
    1. Cubra el tubo con papel de aluminio para proteger el anticuerpo secundario de la luz.
  3. Realizar lavados de 2 x 15 minutos a temperatura ambiente mientras se realiza la rotación con 1 mL de Buffer B.
  4. Incubar con un marcador de ADN como Sytox (tomar 2 μL de 5 mM y disolver en 1 mL de Buffer B) o Hoechst (tomar 1 μL de 10 mg/mL de stock y disolver en 1 mL de Buffer B) durante 10 minutos a temperatura ambiente con rotación.
  5. Realice un lavado con Buffer B y una vez con PBS, cada lavado con una duración de 10 minutos mientras gira a temperatura ambiente.
    NOTA: Recuerde protegerlo de la luz.

10. Imágenes

  1. Monte las glándulas salivales en un tobogán, haciendo una piscina con un cubrebocas.
  2. Poner las glándulas salivales en el centro de la piscina y cubrir con AF1 citifluor para evitar la formación de burbujas que extienden el líquido viscoso por todo el lugar. A continuación, selle todos los lados con esmalte de uñas transparente.
  3. Observar bajo un microscopio de fluorescencia o confocal. Si la muestra no se va a observar el mismo día, guárdelo lejos de la luz a 4 °C.
  4. Utilice GraphPad Prism 6 para generar todos los gráficos y análisis estadísticos.
  5. Analice los datos de la distribución de HP1a en glándulas salivales utilizando la prueba de Kruskal-Wallis. La significación estadística se fijó en (p < 0,05*, < 0,01 **, < 0,001***, < 0,0001****).

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Resultados

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Los resultados representativos de la inmunotensión de HP1a en las glándulas salivales de Drosophila se muestran en la Figura 1. Un resultado positivo es observar un punto focal(Figura 1a)(agregado heterocromático o condensado). Un resultado negativo es ninguna señal o una señal dispersa. A veces se puede observar una señal doble, es decir, con un punto doble (Figura 1c), pero por lo general se produce en cantidades más pequ...

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Discusión

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La función celular de los organismos eucariotas puede definir la estructura 3D dentro del núcleo, que está respaldada por interacciones entre diferentes proteínas con cromatina y varias moléculas, incluido el ARN. En los últimos tres años, los condensados biológicos que han tenido relevancia, incluida la heterocromatina, han tomado un papel fundamental en la determinación de la separación de fases promoviendo la organización espacial nuclear distinta de la cromatina activa y represiva 16,

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Divulgaciones

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Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.

Agradecimientos

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Agradecemos a Marco Antonio Rosales Vega y Abel Segura por tomar algunas de las imágenes confocales, a Carmen Muñoz por la preparación de los medios y al Dr. Arturo Pimentel, M.C. Andrés Saralegui y al Dr. Chris Wood del LMNA por el asesoramiento sobre el uso de los microscopios.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tubos de microcentrífuga de 1,5 mLAxygen MCT-150-C11351904marca no crítica
16% de formaldehídoThermo Scientific28908
AF1 CitifluorTed pella1947025 mL
BSA, Biología Molecular GradoRoche10735078001marca no crítica
Completo, inhibidores de la proteasa Proteasa ultra libre de EDTA
inhibidores Merck		5892953001
CoverslipCorningCLS285022-200EA22x22, marca no crítica
DTTSigmad9779marca no crítica
EDTASigmaE5134marca no crítica
Marca EGTAno crítica
Corredera de vidrioSello de oromarca 3011no crítica
H3BO3Baker0084-01marca no crítica
H3K9me3Abcam8889
HP1aHybridoma BankC1A9Forma del producto  Concentrado 0.1 mL
KClMarca Baker3040-01crítico
MetanolMarca Baker9070-03No crítico
NaClSigma71376marca no crítico
Marca NaOHno crítico
Marca PIPESno crítico
RotadorThermo Scientific13-687-12Q  Labquake Agitador de tubos
Thermo Mixer CEppendorf13527550SmartBlock 1.5 mL
TrisMilipore648311marca no crítica
Triton X-100SigmaT8787100 mL, marca no crítica
β-mercaptoetanolBio-Rad 161071025 mL, marca no crítica
No

Referencias

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  1. Berger, F. Emil Heitz, a true epigenetics pioneer. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 572(2019).
  2. Irick, H. A new function for heterochromatin. Chromosoma. 103 (1), 1-3 (1994).
  3. Kasinathan, B., et al. Innovation of heterochromatin functions drives rapid evolution of essential ZAD-ZNF genes in Drosophila. Elife. , 1-31 (2020).
  4. Lifschytz, E., Hareven, D. Heterochromatin markers: Arrangement of obligatory heterochromatin, histone genes and multisite gene families in the interphase nucleus of D. melanogaster. Chromosoma. 86 (4), 443-455 (1982).
  5. Eissenberg, J. C., Elgin, S. C. R. HP1a: A structural chromosomal protein regulating transcription. Trends in Genetics. 30 (3), 103-110 (2014).
  6. Lee, Y. C. G., et al. Pericentromeric heterochromatin is hierarchically organized and spatially contacts H3K9me2 islands in euchromatin. PLoS Genetics. 16 (3), 1-27 (2020).
  7. Koryakov, D. E., et al. The SUUR protein is involved in binding of SU (VAR)3-9 and methylation of H3K9 and H3K27 in chromosomes of Drosophila melanogaster. Chromosome Research. 19 (2), 235-249 (2011).
  8. Cao, R., et al. Role of Histone H3 Lysine 27 Methylation in Polycomb-Group Silencing. Science. 298 (5595), 1039(2002).
  9. Hines, K. A., et al. Domains of heterochromatin protein 1 required for Drosophila melanogaster heterochromatin spreading. Genetics. 182 (4), 967-977 (2009).
  10. Elgin, S. C. R., Reuter, G. Position-effect variegation, heterochromatin formation, and gene silencing in Drosophila. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (8), 1-26 (2013).
  11. Eissenberg, J. C., Elgin, S. C. R. HP1a: A structural chromosomal protein regulating transcription. Trends in Genetics. 30 (3), 103-110 (2014).
  12. Meyer-Nava, S., Torres, A., Zurita, M., Valadez-graham, V. Molecular effects of dADD1 misexpression in chromatin organization and transcription. BMC Molecular and Cell Biology. 2, 1-17 (2020).
  13. Tennessen, J. M., Thummel, C. S. Coordinating growth and maturation - Insights from drosophila. Current Biology. 21 (18), 750-757 (2011).
  14. Cai, W., Jin, Y., Girton, J., Johansen, J., Johansen, K. M. Preparation of drosophila polytene chromosome squashes for antibody labeling. Journal of Visualized Experiments. (36), 1-4 (2010).
  15. Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 66 (1967), 57-80 (1981).
  16. Larson, A. G., et al. Liquid droplet formation by HP1α suggests a role for phase separation in heterochromatin. Nature. 547 (7662), 236-240 (2017).
  17. Larson, A. G., Narlikar, G. J. The Role of Phase Separation in Heterochromatin Formation, Function, and Regulation. Biochemistry. 57 (17), 2540-2548 (2018).
  18. Keenen, M. M., Larson, A. G., Narlikar, G. J. Visualization and Quantitation of Phase-Separated Droplet Formation by Human HP1α. Methods in Enzymology. , (2018).
  19. Lu, B. Y., Emtage, P. C., Duyf, B. J., Hilliker, aJ., Eissenberg, J. C. Heterochromatin protein 1 is required for the normal expression of two heterochromatin genes in Drosophila. Genetics. 155 (2), 699-708 (2000).
  20. Marsano, R. M., Giordano, E., Messina, G., Dimitri, P. A New Portrait of Constitutive Heterochromatin: Lessons from Drosophila melanogaster. Trends in Genetics. , (2019).
  21. Strom, A. R., et al. Phase separation drives heterochromatin domain formation. Nature. 547 (7662), 241-245 (2017).
  22. Sanulli, S., et al. HP1 reshapes nucleosome core to promote phase separation of heterochromatin. Nature. 575 (7782), 390-394 (2019).
  23. Dialynas, G., Delabaere, L., Chiolo, I. Arp2/3 and Unc45 maintain heterochromatin stability in Drosophila polytene chromosomes. Experimental Biology and Medicine. 244 (15), 1362-1371 (2019).
  24. Kolesnikova, T. D., et al. Induced decondensation of heterochromatin in drosophila melanogaster polytene chromosomes under condition of ectopic expression of the supressor of underreplication gene. Fly. 5 (3), Austin. 181-190 (2011).
  25. Bettinger, J. C., Lee, K., Rougvie, A. E. Stage-specific accumulation of the terminal differentiation factor LIN-29 during Caenorhabditis elegans development. Development. 122 (8), 2517-2527 (1996).
  26. Messina, G., et al. Yeti, an essential Drosophila melanogaster gene, encodes a protein required for chromatin organization. Journal of Cell Science. 127 (11), 2577-2588 (2014).
  27. Aguilar-Fuentes, J., et al. p8/TTDA overexpression enhances UV-irradiation resistance and suppresses TFIIH mutations in a Drosophila trichothiodystrophy model. PLOS Genetics. 4 (11), 1-9 (2008).
  28. Reynaud, E., Lomeli, H., Vazquez, M., Zurita, M. The Drosophila melanogaster Homologue of the Xeroderma Pigmentosum D Gene Product Is Located in Euchromatic Regions and Has a Dynamic Response to UV Light-induced Lesions in Polytene Chromosomes. Molecular Biology of the Cell. 10 (4), 1191-1203 (1999).
  29. Farkaš, R., Mechler, B. M. The timing of Drosophila salivary gland apoptosis displays an I (2)gl-dose response. Cell Death & Differentiation. 7 (1), 89-101 (2000).
  30. Zhang, P., Spradling, A. C. The Drosophila salivary gland chromocenter contains highly polytenized subdomains of mitotic heterochromatin. Genetics. 139 (2), 659-670 (1995).
  31. Stormo, B. M., Fox, D. T. Polyteny: still a giant player in chromosome research. Chromosome Research. 25 (3-4), 201-214 (2017).

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