La proteína arginina (R)-metilación es una modificación postraduccional muy extendida que regula múltiples vías biológicas. La espectrometría de masas es la mejor tecnología para perfilar globalmente el R-metil-proteoma, cuando se combina con enfoques bioquímicos para el enriquecimiento peptídico modificado. El flujo de trabajo diseñado para la identificación de alta confianza de la R-metilación global en células humanas se describe aquí.
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Artículo de método
Un enfoque proteómico basado en espectrometría de masas para el análisis global y de alta confianza de la proteína R-metilación
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Resumen
Resumen
La proteína arginina (R)-metilación es una modificación post-traduccional de proteínas (PTM) generalizada involucrada en la regulación de varias vías celulares, incluyendo el procesamiento de ARN, la transducción de señales, la respuesta al daño del ADN, la biogénesis de miARN y la traducción.
En los últimos años, gracias a los avances bioquímicos y analíticos, la proteómica basada en la espectrometría de masas (MS) se ha convertido en la estrategia más efectiva para caracterizar el metilproteoma celular con resolución de sitio único. Sin embargo, la identificación y el perfil in vivo de la proteína R-metilación por EM sigue siendo difícil y propenso a errores, principalmente debido a la naturaleza subestequiométrica de esta modificación y la presencia de varias sustituciones de aminoácidos y metilesterificación química de residuos ácidos que son isobáricos a la metilación. Por lo tanto, se requieren métodos de enriquecimiento para mejorar la identificación de R-metilpéptidos y estrategias de validación ortogonal para reducir las tasas de descubrimiento falso (FDR) en estudios de proteómica de metilo.
Aquí, se describe un protocolo diseñado específicamente para la identificación y cuantificación de péptidos R-metilo de alta confianza a partir de muestras celulares, que combina el etiquetado metabólico de las células con metionina codificada en isótopos pesados (hmSILAC) y la digestión dual de proteasa en solución del extracto de células enteras, seguido del fraccionamiento por cromatografía de fase inversa de alto pH (HpH-RP) fuera de línea y el enriquecimiento de afinidad de R-metilpéptidos utilizando anticuerpos anti-pan-R-metilo. Tras el análisis de MS de alta resolución, los datos sin procesar se procesan primero con el paquete de software MaxQuant y los resultados son analizados por hmSEEKER, un software diseñado para la búsqueda en profundidad de pares de picos de MS correspondientes a péptidos de metilo ligeros y pesados dentro de los archivos de salida de MaxQuant.
Introducción
La arginina (R)-metilación es una modificación postraduccional (PTM) que decora alrededor del 1% del proteoma de mamíferos1. Las proteínas arginina metiltransferasas (PRMT) son las enzimas que catalizan la reacción de R-metilación por la deposición de uno o dos grupos metilo a los átomos de nitrógeno (N) del grupo guanidino de la cadena lateral de R de manera simétrica o asimétrica. En los mamíferos, los PRMT pueden agruparse en tres clases: tipo I, tipo II y tipo III, dependiendo de su capacidad para depositar tanto monometilación (MMA) como dimetilación asimétrica (ADMA), MMA y dimetilación simétrica (SDMA) o solo MMA, respectivamente
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Protocolo
1. Cultivo celular y extracción de proteínas (tiempo: 3 - 4 semanas requeridas)
- Cultivar células HeLa en paralelo en medios suministrados con metionina ligera (L) o pesada (H), respectivamente (ver Tabla 1 para la composición de los medios). Tras al menos ocho divisiones celulares, recoger una alícuota de células de cada canal SILAC y realizar la prueba de incorporación.
NOTA: Para verificar la eficiencia de incorporación, pruebe mediante el análisis LC-MS / MS que el porcentaje de metionina pesada (Met-4) en el canal pesado es lo más cercano posible al 100%. Analice una alícuota de celdas marcadas pesadamente por LC-MS/MS (para la config....
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Resultados
El artículo describe un flujo de trabajo para la identificación de alta confianza de la proteína R-metilación global, que se basa en la combinación de la digestión enzimática del extracto de proteína con dos proteasas distintas en paralelo, seguido del fraccionamiento por cromatografía líquida HpH-RP de péptidos proteolíticos y el enriquecimiento por inmunoafinidad de R-metilpéptidos con anticuerpos anti-pan-R-metilo (Figura 1).
Las células se cultivaron en presen.......
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Discusión
La identificación de alta confianza de la metilación in vivo de proteínas/péptidos mediante proteómica global basada en EM es un desafío, debido al riesgo de FDR alta, con varias sustituciones de aminoácidos y metilesterificación que ocurren durante la preparación de la muestra que son isobáricas a la metilación y pueden causar asignaciones incorrectas en ausencia de estrategias ortogonales de validación de EM. La naturaleza subestequiométrica de este PTM complica aún más la tarea de la metilproteómica global, p.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
MM y EM son estudiantes de doctorado dentro de la Escuela Europea de Medicina Molecular (SEMM). EM recibe una beca FIRC-AIRC de 3 años (Código del proyecto: 22506). Los análisis globales de R-metil-proteomas en el grupo de TB están respaldados por la subvención AIRC IG (Código del proyecto: 21834).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Bicarbonato de amonio (AMBIC) | Sigma-Aldrich | 09830 | |
| Persulfato de amonio (APS) | Sigma-Aldrich | 497363 | |
| C18 Sep-Pak columnas vacc 6cc (1g) | Aguas | WAT036905 | |
| Tinción coloidal de Coomassie Instant | Sigma-Aldrich | ISB1L-1L | |
| cOmplete Mini, sin EDTA | Roche-Sigma Aldrich | 11836170001 | Inhibidor de la proteasa |
| dializado suero fetal bovino (FBS) | GIBCO ThermoFisher | 26400-044 | |
| DL-Ditiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 3483-12-3 | |
| DMEM Medio | GIBCO ThermoFisher | solicitado | con glutamina estable y sin metionina |
| Sistema de cromatografía EASY-nano LC 1200 | ThermoFisher | ||
| EASY-Spray Columnas de HPLC | ThermoFisher | ES907 | |
| Glycerolo | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Celdas HeLa | ATCC | ATCC CCL-2 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Yodoacetamida (IAA) | Sigma-Aldrich | 144-48-9 | |
| Júpiter C12-RP columna | Phenomenex | 00G-4396-E0 | |
| L-Metionina | Sigma-Aldrich | M5308 | Ligero (L) Metionina |
| L-Metionina-(metil-13C,d3) | Sigma-Aldrich | 299154 | Pesado (H) Metionina |
| LysargiNase | Merck Millipore | EMS0008 | |
| Sonda disruptor celular Microtip 250 | Branson | ||
| N,N,N′,N′ -Tetrametiletilendiamina (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Penicilina-Estreptomicina | GIBCO ThermoFisher | 15140122 | |
| PhosSTOP | Roche-Sigma Aldrich 4906837001 | Inhibidor de la fosfatasa | |
| Puntas Pierce C18 | ThermoFisher | 87782 | |
| Pierce 0.1% Ácido fórmico (v/v) en acetonitrilo, grado | LC-MSThermoFisher | 85175 | LC-MS Solvente B |
| Pierce 0.1% Ácido fórmico (v/v) en agua, grado LC-MS | ThermoFisher | 85170 | LC-MS solvente A |
| Pierce Acetonitrilo (ACN), grado LC-MS ThermoFisher | 51101 | ||
| Pierce Agua, grado LC-MS | ThermoFisher | 51140 | |
| Poliacrilamida | Sigma-Aldrich | 92560 | |
| Precision Plus Protein Todos los estándares de proteínas preteñidos azules Anticuerpos | Bio-Rad | 1610373 | |
| PTMScan α-ADMA | Tecnología de señalización celular | 13474 | |
| Anticuerpos PTMScan α-MMA | Tecnología de señalización celular | 12235 | |
| Anticuerpos PTMScan α-SDMA | Tecnología de señalización celular | 13563 | |
| Q Exactive HF Quadrupole Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Espectrómetro | ThermoFisher | ||
| Grado de secuenciación Tripsina modificada | Promega | V5113 | |
| Ácido trifluoroacético | Sigma-Aldrich | T6508 | |
| Ultimate 3000 HPLC | Dionex | ||
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378 | |
| Concentrador de vacío 5301 | Eppendorf | Speed vac |
Referencias
- Bulau, P., et al. Quantitative assessment of arginine methylation in free versus protein-incorporated amino acids in vitro and in vivo using protein hydrolysis and high-performance liquid chromatography. Biotechniques. 40 (3), 305-310 (2006).
- Blanc, R. S., Richard, S.
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Reimpresiones y permisos
