Aislamiento De Células De La Válvula Intersticial De Ratón Para Estudiar La Calcificación De La Válvula Aórtica In Vitro

Resumen

Este artículo describe el aislamiento de las células de la válvula aórtica del ratón por un procedimiento de dos pasos de la colagenasa. Las células aisladas de la válvula de ratón son importantes para realizar diferentes ensayos, como este ensayo de calcificación in vitro, y para investigar las vías moleculares que conducen a la mineralización de la válvula aórtica.

Resumen

La calcificación de las células de la válvula aórtica es el sello de la estenosis aórtica y se asocia a fibrosis de la cúspide de la válvula. Las células intersticiales valvulares (VIC) juegan un papel importante en el proceso de calcificación en la estenosis aórtica a través de la activación de su programa de desdiferenciación a células osteoblasto-similares. Los VICs de ratón son una buena herramienta in vitro para la elucidación de las vías de señalización que impulsan la mineralización de la célula de la válvula aórtica. El método descrito aquí, utilizado con éxito por estos autores, explica cómo obtener células recién aisladas. Un procedimiento de dos pasos de la colagenasa fue realizado con 1 mg/mL y 4.5 mg/mL. El primer paso es crucial para eliminar la capa de células endoteliales y evitar cualquier contaminación. La segunda incubación de colagenasa es para facilitar la migración de los VIC del tejido a la placa. Además, un procedimiento de coloración de la inmunofluorescencia para la caracterización del fenotipo de las células aisladas de la válvula del ratón se discute. Además, el análisis de la calcificación fue realizado in vitro usando el procedimiento de la medida del reactivo del calcio y la coloración roja del alizarin. El uso del cultivo primario de células de válvulas de ratón es esencial para probar nuevas dianas farmacológicas para inhibir la mineralización celular in vitro.

Introducción

La valvulidad aórtica calcificada (CAVD) es la cardiopatía valvular más prevalente en poblaciones occidentales, afectando a casi el 2,5% de los ancianos mayores de 65 años^1. CAVD afecta a sobre seis millones de americanos y se asocia a los cambios en las propiedades mecánicas de los prospectos que empeoran la sangre normal fluir-a través^1,2. Actualmente, no existe ningún tratamiento farmacológico para detener la progresión de la enfermedad o para activar la regresión mineral. La única terapia eficaz para tratar la CAVD es el reemplazo de la válvula aórtica por cirugía o el reemplazo de ....

Protocolo

NOTA: Todos los procedimientos animales descritos aquí han sido aprobados por la Escuela de Medicina Icahn en el núcleo institucional y el comité de uso de Mount Sinai.

1. Preparación antes del aislamiento de células valvulares de ratones adultos

1. Limpiar y esterilizar todos los instrumentos quirúrgicos mostrados en la Figura 1A utilizando etanol al 70% v/v y posteriormente autoclavándolos durante 30 min.
2. Añadir 500 μL de penicilina-estreptomicina a 50 mL de HEPES de 10 mm. Preparar una alícuota de 50 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Mantenga las soluciones en el hielo.
....

Resultados

Como las válvulas aórticas murinas tienen típicamente 1 mm de diámetro, se deben agrupar al menos tres válvulas para recolectar un millón de células viables para diferentes procedimientos experimentales. Los diferentes pasos del proceso de aislamiento de VIC se muestran en la Figura 1 y la Figura 2. Como es difícil raspar manualmente el tejido de la válvula, es preferible utilizar la tensión de cizallamiento creada por el vórtice para eliminar los VÉS. De hecho,.......

Discusión

Este artículo presenta un protocolo detallado del aislamiento de la célula de la válvula del ratón para la cultura primaria. Tres válvulas aórticas de ratones de 8 semanas de edad se agruparon para obtener un número adecuado de células. Además, este protocolo describe la caracterización del fenotipo VIC y el ensayo de mineralización in vitro. El método fue adaptado del protocolo previamente descrito de Mathieu et al.^7.

Durante el aislamiento de las vá.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tijera de corte de 3 mm	F.S.T	15000-00
Anti-alfa músculo liso anticuerpo de actina	abcam
Anti-ratón, Alexa Fluor 488 conjugado	Cell Signaling	4412
Arsenazo-III set de reactivos	POINT SCIENTIFIC	C7529-500	A Kit para medir la concentración de calcio
Tijeras Bonn	F.S.T	14184-09
Hidróxido de calcio	SIGMA -Aldrich 31219	31219
CD31	Novusbio
Colagenasa tipo I  (125 unidades/mg)	Thermofisher Scientific 17018029
DMEM	Tthermofisher 11965092
Pinza de graefe extrafina	F.S.T	11150-10
FBS	Gibco 16000044
Pinza fina	F.S.T Dumont
HCl	SIGMA-ALDRICH	H1758
HEPES 1 M solución	STEMCELLS TECNOLOGÍAS
L-Glutamina 100x	Thermofisher Scientific	A2916801
Mycozap	Lanza	VZA-2011	Reactivo de eliminación de micoplasmas
PBS 10x	SIGMA-ALDRICH
penicilina estreptomicina 100x	Thermofisher Scientific	10378016
Piruvato de sodio 100 mM	Thermofisher Scientific
Pinzas de patrón estándar	F.S.T	11000-12
Tijeras quirúrgicas - Afiladas-romas	F.S.T	14008-14
Tripsina 0.05%	Thermofisher Scientific	25300054
Vimentin	abcam