El medio de esputo sintético para fibrosis quística (SCFM2) se puede utilizar en combinación con microscopía de barrido láser confocal y clasificación celular activada por fluorescencia para observar agregados bacterianos a alta resolución. Este documento detalla los métodos para evaluar las poblaciones agregadas durante el tratamiento antimicrobiano como plataforma para futuros estudios.
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Artículo de método
Herramientas para la evaluación en tiempo real de un modelo de infección por Pseudomonas aeruginosa
En este artículo
Resumen
Resumen
Pseudomonas aeruginosa (Pa) es uno de los patógenos oportunistas más comunes asociados con la fibrosis quística (FQ). Una vez que se establece la colonización por Pa, una gran proporción de las bacterias infectantes forman biopelículas dentro del esputo de las vías respiratorias. Se ha demostrado que las biopelículas de Pa aisladas del esputo de FQ crecen en agregados pequeños y densos de ~ 10-1,000 células que están organizadas espacialmente y exhiben fenotipos clínicamente relevantes, como la tolerancia a los antimicrobianos. Uno de los mayores desafíos para estudiar cómo los agregados de Pa responden al entorno cambiante del esputo es la falta de sistemas nutricionalmente relevantes y robustos que promuevan la formación de agregados. Utilizando un medio sintético de esputo CF (SCFM2), se puede observar la historia de vida de los agregados de Pa utilizando microscopía de escaneo láser confocal (CLSM) y análisis de imágenes a la resolución de una sola célula. Este sistema in vitro permite la observación de miles de agregados de tamaño variable en tiempo real, tres dimensiones y a escala de micras. A nivel individual y poblacional, tener la capacidad de agrupar agregados por fenotipo y posición facilita la observación de agregados en diferentes etapas de desarrollo y su respuesta a cambios en el microambiente, como el tratamiento antibiótico, para diferenciarlos con precisión.
Introducción
Pseudomonas aeruginosa (Pa) es un patógeno oportunista que establece infecciones crónicas en individuos inmunocomprometidos. Para aquellos con la enfermedad genética fibrosis quística (FQ), estas infecciones pueden abarcar el curso de toda la vida. La FQ causa la acumulación de un esputo viscoso y rico en nutrientes en las vías respiratorias, que se coloniza por una variedad de patógenos microbianos con el tiempo. Pa es uno de los patógenos de la FQ más prevalentes, colonizando las vías respiratorias en la primera infancia y estableciendo infecciones difíciles de tratar1. La PA sigue siendo un problema clínico signifi....
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Protocolo
1. Preparar un medio sintético de fibrosis quística (SCFM2)
NOTA: La preparación de SCFM2 comprende tres etapas principales que se describen a continuación(Figura 2). Para más detalles y referencias, véase9,10,12.
Figura 2: Preparación e inoculación del medio SCFM2. (A) La base t....
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Resultados
Este trabajo detalla métodos para observar agregados de Pa a alta resolución y en un ambiente similar al de la infección crónica de la FQ pulmonar9,10,12. SCFM2 proporciona un sistema in vitro que promueve la agregación natural de células Pa en tamaños similares a los observados durante la infección real10. La adaptabilidad de SCFM2 como medio definido se puede aprovechar para a.......
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Discusión
Este trabajo ha introducido metodologías que se pueden combinar para estudiar poblaciones agregadas bacterianas en presencia y ausencia de tratamiento antibiótico. El CLSM de alta resolución permite la visualización de los cambios en la biomasa agregada y la orientación estructural de los agregados en tiempo real cuando se exponen a antibióticos. Además, se pueden cuantificar las características físicas y estructurales de la biomasa que quedan después del tratamiento con antibióticos, con el objetivo de correlacionar est.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses.
Agradecimientos
S.E.D cuenta con el apoyo de fondos iniciales proporcionados por el Departamento de Medicina Molecular de la Universidad del Sur de Florida, así como una subvención de investigación CFF (DARCH19G0), el N.I.H (5R21AI147654 - 02 (PI, Chen)) y el Instituto de Microbiomas de la USF. Agradecemos al laboratorio de Whiteley por la colaboración continua que involucra conjuntos de datos relacionados con este manuscrito. Agradecemos al Dr. Charles Szekeres por facilitar la clasificación de FACS. Las figuras fueron creadas por A.D.G y S.E.D utilizando Biorender.com.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Aminoácidos Alanina | |||
| Acros Organics | 56-41-7 | ||
| Arginina HCl | MP | 1119-34-2 | |
| Asparagina | Acros Organics | 56-84-8 | Preparado en 0,5 M NaOH |
| Cistina HCl | Alfa Aesar | L06328 | |
| Ácido glutámico HCl | Acros Organics | 138-15-8 | |
| Glicina | Acros Organics | 56-40-6 | |
| Histidina HCl H2O | Alfa Aesar | A17627 | |
| Isoleucina | Acros Organics | 73-32-5 | |
| Leucina | Alfa Aesar | A12311 | |
| Lisina HCl | Alfa Aesar | J62099 | |
| Metionina | Acros Organics | 63-68-3 | |
| Ornitina HCl | Alfa Aesar | A12111 | |
| Fenilalanina | Acros Organics | 63-91-2 | |
| Prolina | Alfa Aesar | A10199 | |
| Serina | Alfa Aesar | A11179 | |
| Treonina | Acros Organics | 72-19-5 | |
| Triptófano | Acros Organics | 73-22-3 | Preparado en 0,2 m NaOH |
| Tirosina | Alfa Aesar | A11141 | Preparado en 1.0 M NaOH |
| Valina | Acros Organics | 72-18-4 | |
| Antibiótico | |||
| Carbenicillina | Alfa Aesar | J6194903 | |
| Existencias | |||
| CaCl2 * 2H2 | O Fisher Chemical | C79-500 | |
| Dextrosa (D-glucosa) | Fisher Chemical | 50-99-7 | |
| 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC) | Fisher (Avanti Polar Lipids) | 4235-95-4 | agitar 15-20 min a 37 & deg; C para evaporar el cloroformo |
| FeSO4 * 7H2O | Acros Organics | 7782-63-0 | este stock equivale a 1 mg/mL, DEBE hacer |
| ácido L-láctico | Alfa Aesar | L13242 | pH stock a 7 con NaOH |
| MgCl2 * 6H2O | Acros Organics | 7791-18-6 | |
| N-acetilglucosamina | TCI | A0092 | |
| Sólidos | |||
| Mucina porcina | Sigma | M1778-100G | Esterilización UV |
| Esperma de salmón DNA | Invitrogen | 15632-011 | |
| Tinción | |||
| Yoduro de propidio | Alfa Aesar | J66764MC | |
| Sales K | |||
| 2SO4 | Alfa Aesar | A13975 | |
| KCl | Alfa Aesar | J64189 | añadir sólido directamente a la base tamponada |
| KNO3 | Acros Organics | 7757-79-1 | |
| MOPS | Alfa Aesar | A12914 | añadir sólido directamente a la base tamponada |
| NaCl | Fisher Chemical | S271-500 | añadir sólido directamente a la base amortiguada |
| Na2HPO4 | RPI | S23100-500.0 | |
| NaH2PO4 | RPI | S23120-500.0 | |
| NH4Cl | Acros Organics | 12125-02-9 | añadir sólido directamente a la base tamponada |
| Consumibles | |||
| Tubos cónicos (15 mL) | Olympus plastics | 28-101 | |
| Tubos cónicos (50 mL) | Olympus plastics | 28-106 | |
| Tubos de cultivo con tapón de flujo | de aire Olympus plastics | 21-129 | |
| 35 mm plato de cuatro cámaras con fondo de vidrio | CellVis | NC0600518 | |
| Luria Bertani (LB) caldo | Genessee Scientific | 11-118 | |
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS) | Fisher Bioreagents | BP2944100 | |
| Puntas de pipeta (p200) | Olympus plastics | 23-150RL | |
| Pipetas de pipeta (p1000) | Olympus plastics | 23-165RL | |
| Pipetas serológicas (5 mL) | Olympus plastics | 12-102 | |
| Pipetas serológicas (25 mL) | Olympus plastics | 12-106 | |
| Pipetas serológicas (50 mL) | Olympus plastics | 12-107 | |
| Agua ultrapura (libre de RNasa/DNasa); agua nanopura | Genessee Scientific | 18-194 | Agua nanopura utilizada para la preparación de soluciones en la Tabla 1 |
| Jeringas (10 mL) | BD | 794412 | |
| Jeringas (50 mL) | BD | 309653 | |
| 0,22 mm Filtro de jeringa PES | Olympus plastics | 25-244 | |
| PS cubeta semi-mico | Olympus plastics | 91-408 | |
| Software | |||
| Biorender | Para preparar las figuras | ||
| FacsDiva6.1.3 | Becton Dickinson, San José, CA | ||
| Imaris | Bitplane | versión 9.6 | |
| Zen Negro | |||
| Equipo | |||
| FacsAriallu | Becton Dickinson, San José, CA | ||
| LSM 880 microscopio de barrido láser confocal | Zeiss |
Referencias
- Ramsay, K. A., et al. The changing prevalence of pulmonary infection in with fibrosis: A longitudinal analysis. Journal of Cystic Fibrosis. 16 (1), 70-77 (2017).
- Bessonova, L., et al. Data....
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Reimpresiones y permisos
