Análisis cuantitativo basado en microscopía de escaneo láser confocal de la distribución de conidios de Aspergillus fumigatus en pulmón de ratón ópticamente despejado de montaje entero

Summary

Describimos el método para el análisis cuantitativo de la distribución de Aspergillus fumigatus conidia (3 μm de tamaño) en las vías respiratorias de ratones. El método también se puede utilizar para el análisis de micropartículas y la distribución de aglomerado de nanopartículas en las vías respiratorias en varios modelos de condiciones patológicas.

Abstract

Aspergillus fumigatus conidia son patógenos en el aire que pueden penetrar en las vías respiratorias humanas. Las personas inmunocompetentes sin alergias exhiben resistencia y tolerancia inmunológica, mientras que en pacientes inmunocomprometidos, los conidios pueden colonizar las vías respiratorias y causar trastornos respiratorios invasivos graves. Varias células en diferentes compartimentos de las vías respiratorias están involucradas en la respuesta inmune que previene la invasión de hongos; sin embargo, los aspectos espacio-temporales de la eliminación de patógenos aún no se comprenden completamente. Las imágenes tridimensionales (3D) de órganos de montaje entero limpiados ópticamente, particularmente los pulmones de ratones experimentales, permiten la detección de patógenos etiquetados fluorescentemente en las vías respiratorias en diferentes puntos de tiempo después de la infección. En el presente estudio, describimos una configuración experimental para realizar un análisis cuantitativo de la distribución de A. fumigatus conidia en las vías respiratorias. Utilizando microscopía fluorescente de barrido láser confocal (CLSM), rastreamos la ubicación de los conidios marcados fluorescentemente en las ramas bronquiales y el compartimiento alveolar 6 horas después de la aplicación orofaríngea a ratones. El enfoque descrito aquí se utilizó previamente para la detección de la ubicación precisa del patógeno y la identificación de las células que interactúan con el patógeno en diferentes fases de la respuesta inmune. La configuración experimental se puede utilizar para estimar la cinética de la eliminación del patógeno en diferentes condiciones patológicas.

Introduction

Diariamente, las personas inhalan patógenos en el aire, incluidas las esporas de hongos oportunistas Aspergillus fumigatus (A. fumigatus conidia) que pueden penetrar en el tracto respiratorio¹. El tracto respiratorio de los mamíferos es un sistema de vías respiratorias de diferentes generaciones que se caracterizan por las diferentes estructuras de las paredes de las vías respiratorias^2,3,4. Las paredes traqueobronquiales consisten en varios tipos de células entre las que se encuentran las células ciliadas que proporcionan el aclarami....

Protocol

Todos los métodos relacionados con los animales de laboratorio descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en el Instituto Shemyakin y Ovchinnikov de Química Bioorgánica, Academia de Ciencias de Rusia (número de protocolo 226/2017).

1. Aplicación de A. fumigatus conidia

1. Para obtener A. fumigatus conidia marcado fluorescentemente, fije 5 × 10⁸ conidios agregando 1 ml de paraformaldehído al 3% al pellet de conidios. Incubar en un tubo de ensayo de 50 ml durante 2 h en un agitador a temperatura ambiente.
2. Lavar los conidios con 20 ml de soluc....

Results

Siguiendo el protocolo anterior, se obtuvo la imagen 3D que muestra las vías respiratorias y los conidios de A. fumigatus en el lóbulo pulmonar de un ratón (Figura 1A). La estreptavidina (que se utilizó para la visualización de las vías respiratorias) etiquetó bronquios y bronquiolos¹⁵. Además, los vasos grandes, que son fácilmente distinguibles de las vías respiratorias por su morfología, y la pleura se visualizan en el canal de las vías respiratorias

Discussion

La obtención de imágenes 3D de órganos completos permite obtener los datos sin disección del espécimen, lo que es de gran importancia para investigar los aspectos espaciales de la distribución anatómica del patógeno en el organismo. Existen varias técnicas y modificaciones de limpieza óptica de tejidos que ayudan a superar la dispersión de la luz láser y permiten la obtención de imágenes de todo el órgano^15,16,18,

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 594 NHS Ester	ThermoFisher	A20004
Aspergillus fumigatus conidios	ATCC	46645	La cepa AfS150, un derivado de ATCC 46645
Alcohol bencílico	Panreac	141081.1611	98.0-100 %
Bentoxicación de bencilo	Acros	AC10586-0010	99+%
C57Bl/6 ratones	Pushchino Animal Centro de cría (Rusia)		Macho. 12 - 30 semanas de edad.
Catéter	Venisystems	G715-A01	18G
Cubeta de imagen celularcon fondo de vidrio	Cámara Eppendorf	30742028	de 4 u 8 pocillos con fondo de cubreobjetos
Centrífuga	Eppendorf	5804R	Se puede utilizar cualquier centrífuga suministrada de 1000 g
Microscopio láser de barrido confocal	ZEISS	ZEISS LSM780
Dimetilsulfóxido	Sigma-Aldrich	276855	≥ 99.9%
Paquete de procesamiento de imágenes FIJI	Software libre	FIJI
Pinza	B. Braun Aesculap	BD557R	Pinza dentada
	B. Braun Aesculap	BD321R	Pinza de punta fina
	Bochem	1727	liso
	DURAN 242101304		Con tapa esmerilada
Editor gráfico Photoshop	Adobe Inc		Adobe Photoshop CS
GraphPad Software GraphPad			Prisma 8
Imaris Microscopy Imaging Software	Oxford Instruments		La prueba gratuita está disponible https://imaris.oxinst.com/microscopy-imaging-software-free-trial
Isoflurano	Karizoo
NaHCO3	Panreac	141638
Objetivo	ZEISS	420640-9800-000	Plan-Apocromático, 10 y veces; (NA = 0,3)
Paraformaldehído	Sigma-Aldrich	158127
PBS	Paneco	P060Π
Pipeta	ProLine	722020	5 a 50 μ L
Leche en polvo	Roth	T145.2
Mezclador de muestras	Dynal	MXIC1
Tijeras	B. Braun	BC257R	Agitador romo
	Apexlab	GS-20	50-300 rpm
Skalpel	Bochem	12646
Hilo de seda	B. Braun		3 USP
Estreptavidina, Alexa Fluor 488 conjugado	ThermoFisher	S11223
Tubo	de ensayo SPL Lifesciences	50050	50 mL
Tris (hidroximetilaminometano)	Helicon	H-1702-0.5	Sr. 121.14; Número CAS: 77-86-1
Triton X-100	Amresco	Am-O694-0.1
ZEN software de microscopio	ZEISS	ZEN2012 SP5 https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen.html