Detección de péptidos que activan MRGPRX2 utilizando células HEK modificadas

Shammy Raj; Lei Lu; Larry  D. Unsworth

doi:10.3791/62448

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Artículo de método

Detección de péptidos que activan MRGPRX2 utilizando células HEK modificadas

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DOI:

10.3791/62448

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6 de noviembre de 2021

Shammy Raj¹ , Lei Lu² , Larry D. Unsworth¹

¹Department of Chemical and Materials Engineering, Donadeo Innovation Centre for Engineering, University of Alberta, ²School of Life Science and Engineering, Southwest Jiaotong University

En este artículo

Resumen

Se describen técnicas para generar una biblioteca de péptidos cortos que pueden activar los mastocitos a través del receptor MRGPRX2. Las técnicas asociadas son fáciles, económicas y se pueden extender a otros receptores celulares.

Resumen

La identificación de ligandos específicos para receptores celulares terapéuticamente significativos es crucial para muchas aplicaciones, incluido el diseño y desarrollo de nuevas terapias. Mas relacionado con el receptor de proteína G-X2 (MRGPRX2) es un receptor importante que regula la activación de los mastocitos y, por lo tanto, dirige la respuesta inmune general. Se han identificado numerosos ligandos para MRGPRX2 e incluyen péptidos endógenos como PAMPs, defensinas, LL-37 y otros fragmentos de proteínas (es decir, albúmina degradada). La identificación adicional de ligandos específicos de MRGPRX2 requiere la detección de un gran número de péptidos (es decir, biblioteca de péptidos); sin embargo, los mastocitos son difíciles y costosos de mantener in vitro y, por lo tanto, no son económicos de usar para el cribado de un gran número de moléculas. El presente artículo demuestra un método para diseñar, desarrollar y examinar una biblioteca de moléculas peptídicas pequeñas utilizando células HEK que expresan MRGPRX2. Esta línea celular es relativamente fácil y económica de mantener y se puede utilizar para el análisis in vitro de alto rendimiento. Se utilizó un colorante fluorescente Fura-2 sensible al calcio para marcar el flujo de calcio intracelular tras la activación para monitorear la activación. Para calcular la concentración de calcio se utilizó la relación entre la intensidad de fluorescencia de Fura-2 a 510 nm frente a longitudes de onda de excitación de 340 y 380 nm. La biblioteca de péptidos utilizada para verificar este sistema se basó en el secretagogo endógeno proadrenomedulina N-terminal 12 (PAMP-12), que se sabe que se une a MRGPRX2 con alta especificidad y afinidad. Los péptidos posteriores se generaron a través de técnicas de truncamiento de aminoácidos y escaneo de alanina aplicadas a PAMP-12. El método descrito aquí es simple y económico pero robusto para la detección de una gran biblioteca de compuestos para identificar dominios de unión y otros parámetros importantes que juegan un papel importante en la activación del receptor.

Introducción

Los mastocitos son una parte integral del sistema inmunológico y desempeñan un papel crucial en las respuestas inmunes innatas y adaptativas. Los mastocitos se activan principalmente por la unión de un antígeno al complejo receptor de inmunoglobulina E (IgE) - FcεRI, o por el recientemente descubierto receptor de proteína G relacionado con mas-X2 (MRGPRX2)¹. La activación de MRGPRX2 se ha relacionado con varias enfermedades inmunes e inflamatorias, y por lo tanto, es importante comprender el mecanismo de unión del receptor a sus ligandos². Para hacerlo, se desarrolló una biblioteca de pequeñas moléculas peptídicas y se c....