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Artículo de método

Mapeo de R-loops e híbridos de ARN:ADN con métodos de inmunoprecipitación basados en S9.6

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DOI:

10.3791/62455

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24 de agosto de 2021

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1Department of Molecular and Cellular Biology and Genome Center, University of California

En este artículo

Resumen

Los bucles R constituyen una clase prevalente de estructuras de ADN no B impulsadas por la transcripción que se producen en todos los genomas dependiendo de la secuencia de ADN y la favorabilidad topológica. En los últimos años, los bucles R se han implicado en una variedad de roles adaptativos y desadaptativos y se han relacionado con la inestabilidad genómica en el contexto de los trastornos humanos. Como consecuencia, el mapeo preciso de estas estructuras en los genomas es de gran interés para muchos investigadores. Aquí se describe DRIP-seq (inmunoprecipitación de ADN:ARN seguida de secuenciación de alto rendimiento). Es una técnica robusta y reproducible que permite un mapeo preciso y semicuantitativo de los bucles R. También se describe una iteración reciente del método en la que la fragmentación se logra mediante sonicación (sDRIP-seq), que permite el mapeo de bucles R específicos de la hebra y de alta resolución. Por lo tanto, sDRIP-seq aborda algunas de las limitaciones comunes del método DRIP-seq en términos de resolución y varado, lo que lo convierte en un método de elección para el mapeo de bucle R.

Resumen

Los bucles R constituyen una clase prevalente de estructuras de ADN no B impulsadas por la transcripción que se producen en todos los genomas dependiendo de la secuencia de ADN y la favorabilidad topológica. En los últimos años, los bucles R se han implicado en una variedad de roles adaptativos y desadaptativos y se han relacionado con la inestabilidad genómica en el contexto de los trastornos humanos. Como consecuencia, el mapeo preciso de estas estructuras en los genomas es de gran interés para muchos investigadores. Aquí se describe DRIP-seq (inmunoprecipitación de ADN:ARN seguida de secuenciación de alto rendimiento). Es una técnica robusta y reproducible que permite un mapeo preciso y semicuantitativo de los bucles R. También se describe una iteración reciente del método en la que la fragmentación se logra mediante sonicación (sDRIP-seq), que permite el mapeo de bucles R específicos de la hebra y de alta resolución. Por lo tanto, sDRIP-seq aborda algunas de las limitaciones comunes del método DRIP-seq en términos de resolución y varado, lo que lo convierte en un método de elección para el mapeo de bucle R.

Introducción

Los bucles R son estructuras de ácido nucleico tricatenario que se forman principalmente durante la transcripción tras la hibridación de la transcripción de ARN naciente con la cadena de ADN molde. Esto da como resultado la formación de un híbrido ARN:ADN y provoca el desplazamiento de la hebra de ADN no molde en un estado de bucle monocatenario. La reconstitución bioquímica 1,2,3,4 y el modelado matemático5, en combinación con otras mediciones biofísicas 6,7, han establecido que es más probable que ocurran bucles R en regiones que exhiben características favorables específicas. Por ejemplo, las regiones que muestran una asimetría de hebra en la distribución de guaninas (G) y citosinas (C) de modo que el ARN es rico en G, una propiedad llamada sesgo positivo de GC, se ven favorecidas para formar bucles R cuando se transcriben debido a la mayor estabilidad termodinámica del híbrido ADN:ARN en comparación con el dúplex de ADN8. Las regiones que han desarrollado un sesgo positivo de GC, como las primeras porciones de muchos genes eucariotas 4,9,10,11, son propensas a formar bucles R in vitro e in vivo 3,4,12. La tensión superhelicoidal negativa del ADN también favorece en gran medida la formación de estructuras13,14 porque los bucles R absorben eficientemente dichas tensiones topológicas y devuelven la fibra de ADN circundante a un estado relajado favorable 5,15.

Históricamente, se consideraba que las estructuras de bucle R eran el resultado de entrelazamientos raros y espontáneos de ARN con ADN durante la transcripción. Sin embargo, el desarrollo de la inmunoprecipitación ADN:ARN (DRIP) junto con la secuenciación de ADN de alto rendimiento (DRIP-seq) permitió el primer mapeo de todo el genoma de los R-loops y reveló que esas estructuras son mucho más prevalentes de lo esperado en las células humanas 4,16. Los bucles R ocurren en decenas de miles de puntos calientes genéticos conservados y transcritos en los genomas de los mamíferos, con una predilección por las islas CpG sesgadas por GC que se superponen al primer intrón de genes y las regiones terminales denumerosos genes. En general, los bucles R ocupan colectivamente entre el 3% y el 5% del genoma de las células humanas, lo que coincide con las mediciones en otros organismos, como levaduras, plantas, moscas y ratones 18,19,20,21,22.

El análisis de los puntos calientes formadores de bucle R en células humanas reveló que tales regiones se asocian con firmas específicas de cromatina23. Los bucles R, en general, se encuentran en regiones con menor ocupación de nucleosomas y mayor densidad de ARN polimerasa. En los promotores, los bucles R se asocian con un mayor reclutamiento de dos modificaciones de histonas depositadas cotranscripcionalmente, H3K4me1 y H3K36me317. En los extremos de los genes, los bucles R se asocian con genes estrechamente dispuestos que experimentan una terminación de transcripción eficiente17, lo que concuerda con observaciones previas24. También se demostró que los R-loops participan en el inicio de la replicación del ADN en los orígenes de replicación de los genomas de bacteriófagos, plásmidos, mitocondriales y levaduras 25,26,27,28,29,30,31. Además, el 76% de los promotores de islas CpG humanos propensos a los bucles R funcionan como orígenes de replicación constitutivos tempranos 32,33,34,35, lo que refuerza aún más las conexiones entre los bucles R y los orígenes de replicación. En conjunto, estos estudios sugieren que los bucles R representan un nuevo tipo de señal biológica que puede desencadenar salidas biológicas específicas de una manera dependiente del contexto23.

Al principio, se demostró que se formaban bucles R en las secuencias de cambio de clase durante el proceso de recombinación de interruptores de clase de inmunoglobulinas 3,36,37. Se cree que estos bucles R programados inician la recombinación de cambios de clase mediante la introducción de roturas de ADN bicatenario38. Desde entonces, la formación dañina de R-loops, generalmente entendida como el resultado de una formación excesiva de R-loops, se ha relacionado con la inestabilidad genómica y procesos como la hiperrecombinación, las colisiones transcripción-replicación, la replicación y el estrés transcripcional (para revisión 39,40,41,42,43). Como consecuencia, el mapeo mejorado de las estructuras del bucle R representa un desafío emocionante y esencial para descifrar mejor la distribución y la función de estas estructuras en la salud y la enfermedad.

La inmunoprecipitación ADN:ARN (DRIP) se basa en la alta afinidad del anticuerpo monoclonal S9.6 para los híbridos ADN:ARN44. DRIP-seq permite un perfil robusto de todo el genoma de la formación de bucles R 4,45. Si bien es útil, esta técnica sufre de una resolución limitada debido al hecho de que se utilizan enzimas de restricción para lograr una fragmentación suave del ADN. Además, DRIP-seq no proporciona información sobre la direccionalidad de la formación de R-loop. Aquí, reportamos una variante de DRIP-seq que permite el mapeo de R-loops a alta resolución de una manera específica para cada cadena. Este método se basa en la sonicación para fragmentar el genoma antes de la inmunoprecipitación y, por lo tanto, el método se denomina sDRIP-seq (inmunoprecipitación de ADN por ARN en sonicación junto con secuenciación de alto rendimiento) (Figura 1). El uso de la sonicación permite una mayor resolución y limita los sesgos de fragmentación ligados a enzimas de restricción observados en los enfoques de DRIP-seq46. sDRIP-seq produce mapas de bucle R que concuerdan fuertemente con los resultados tanto de DRIP-seq como del método DRIPc-seq de alta resolución descrito anteriormente, en el que las bibliotecas de secuenciación se construyen a partir de las hebras de ARN de estructuras de bucle R inmunoprecipitadas45.

Frente a una gran cantidad de métodos para elegir, los usuarios pueden preguntarse qué enfoque particular basado en DRIP es preferible para sus necesidades. Te ofrecemos los siguientes consejos. DRIP-seq, a pesar de sus limitaciones, es técnicamente más fácil y es el más robusto (rendimientos más altos) de los tres métodos discutidos aquí; Por lo tanto, sigue siendo ampliamente útil. Se han publicado numerosos conjuntos de datos DRIP-seq, que proporcionan un punto de comparación útil para nuevos conjuntos de datos. Por último, la canalización de análisis bioinformático es más sencilla ya que los datos no están varados. Se recomienda que los nuevos usuarios comiencen a perfeccionar sus habilidades de mapeo de bucle R con DRIP, seguido de la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) y DRIP-seq. sDRIP-seq representa un grado ligeramente mayor de dificultad técnica: los rendimientos se reducen ligeramente debido a la sonicación (comentada más adelante) y el proceso de la biblioteca de secuenciación es ligeramente más complejo. Sin embargo, la ganancia de varado y mayor resolución es invaluable. Se observa que sDRIP-seq capturará tanto híbridos de ARN:ADN de dos cadenas como bucles R de tres cadenas. Debido a los pasos de construcción de la biblioteca, DRIP-seq no capturará híbridos de ARN:ADN de dos cadenas. DRIPc-seq es el más exigente técnicamente y requiere una mayor cantidad de materiales de partida. A cambio, ofrece la mayor resolución y varado. Debido a que las bibliotecas de secuenciación se construyen a partir de la fracción de ARN de R-loops o híbridos, DRIPc-seq puede sufrir una posible contaminación por ARN, especialmente porque S9.6 posee afinidad residual por dsRNA 19,47,48. sDRIP-seq permite el mapeo de alta resolución específico de la cadena sin preocuparse por la contaminación del ARN, ya que las bibliotecas de secuenciación se derivan de las cadenas de ADN. En general, estos tres métodos siguen siendo útiles y presentan diferentes grados de complejidad y advertencias ligeramente diferentes. Los tres, sin embargo, producen conjuntos de datos altamente congruentes48 y son altamente sensibles al pretratamiento de RNasa H, lo que representa un control esencial para garantizar la especificidad de la señal45,49. Se observa que, dada la selección de tamaño impuesta a las bibliotecas de secuenciación, se excluirán los híbridos pequeños (estimados <75 pb), como los que se forman transitoriamente alrededor de los sitios de cebado de replicación del ADN de hebras rezagadas (cebadores de Okazaki). Del mismo modo, dado que todos los métodos de goteo implican la fragmentación del ADN,se perderán los bucles R inestables que requieren un superenrollamiento negativo del ADN para su estabilidad. Por lo tanto, los enfoques de DRIP pueden subestimar las cargas de los bucles R, especialmente para los bucles R cortos e inestables que pueden capturarse mejor utilizando enfoques in vivo 45,48. Se observa que los bucles R también se pueden perfilar de manera independiente de S9.6 con cobertura profunda, alta resolución y de manera específica de la cadena en moléculas individuales de ADN después del tratamiento con bisulfito de sodio12. Además, se han empleado estrategias que utilizan una enzima RNasa H1 catalíticamente inactiva para mapear los bucles R nativos in vivo, destacando los bucles R cortos e inestables que se forman principalmente en los promotores en pausa 50,51,52.

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Protocolo

El siguiente protocolo está optimizado para la línea celular humana Ntera-2 cultivada, pero se ha adaptado con éxito sin modificaciones a una serie de otras líneas celulares humanas (HEK293, K562, HeLa, U2OS), células primarias (fibroblastos, células B), así como en otros organismos con pequeñas modificaciones (ratones, moscas).

1. Recolección y lisis celular

  1. Cultivo de células Ntera-2 con una confluencia del 75%-85%. Asegúrese de que el recuento óptimo de células sea de 5 a 6 millones de células con recuentos viables del >90% para iniciar cualquier procedimiento de goteo.
  2. Lavar las células una vez con 1x PBS, añadir 1,5 mL de tripsina-EDTA 1x y, a continuación, incubar durante 2 min a 37 °C hasta que las células se disocien de la placa.
  3. Agregue 5 mL de medio tibio y pipetee bien para resuspender las células en una suspensión de una sola célula. Transfiera el contenido a un nuevo tubo de 15 ml y granule suavemente las células a 300 x g durante 3 minutos.
  4. Lave las células una vez con 5 mL de 1x PBS y granule suavemente las células a 300 x g durante 3 min.
  5. Vuelva a suspender completamente las células en 1,6 mL de tampón TE (10 mM de Tris-Cl pH 7,5, 1 mM EDTA pH 8,0). Añadir 5 μL de proteinasa K (20 mg/ml de solución madre) y 50 μL de SDS (20% de solución madre) e invertir suavemente los tubos cinco veces hasta que la solución se vuelva viscosa. No intente pipetear la solución, solo mezcle por inversión.
  6. Incubar los tubos durante la noche a 37 °C.

2. Extracción de ADN

  1. Vierta el lisado de ADN en un tubo de gel de bloqueo de fase de alta densidad de 15 mL prehilado y agregue 1 volumen (1,6 mL) de alcohol isoamílico de fenol/cloroformo (25:24:1). Invierta suavemente cinco veces y gire a 1.500 x g durante 5 minutos.
  2. Agregue 1/10 de volumen de acetato de sodio (NaOAc) 3 M (pH 5.2) y 2.5 volúmenes de etanol al 100% a un nuevo tubo de 15 mL. Vierta en la fase acuosa superior del tubo de gel de bloqueo de fase e invierta suavemente hasta que el ADN esté completamente precipitado (hasta 10 minutos).
  3. Enrolle los hilos de ADN con una punta de 1.000 μL de diámetro ancho y transfiéralos a un tubo limpio de 2 mL teniendo cuidado de no arrastrar el sobrenadante residual.
  4. Lave el ADN añadiendo 1,5 ml de etanol al 80% e invierta suavemente el tubo cinco veces. Incubar durante 10 min.
  5. Repita el paso anterior dos veces. No centrifugar durante los pasos de lavado. Retire con cuidado la mayor cantidad de etanol posible pipeteando después del último lavado mientras intenta no alterar el ADN.
  6. Deje que el ADN se seque completamente al aire mientras invierte el tubo. Este paso puede durar entre 30 min y 1 h dependiendo de la cantidad de ADN.
  7. Añadir 125 μL de tampón TE directamente sobre la pastilla de ADN para fragmentar el ADN mediante la digestión de la enzima de restricción o 100 μL de tampón TE para cizallar el ADN mediante sonicación. Mantener en hielo durante 1 h y resuspender suavemente el ADN pipeteando varias veces con una punta de 200 μL de diámetro ancho. Dejar actuar en hielo durante 1 h antes de iniciar la etapa de fragmentación.

3. Fragmentación del ADN

NOTA: Para DRIP-seq basado en enzimas de restricción, siga el paso 3.1. Para el DRIP-seq basado en sonicación, vaya al paso 3.2.

  1. Fragmentación de la enzima de restricción (RE)
    1. Digiera el ADN genómico resuspendido (muy viscoso) utilizando un cóctel de REs de acuerdo con las instrucciones del proveedor.
      1. Añadir 0,1 mM de espermidina a la reacción final. Utilice un cóctel de 4-5 enzimas con 30 U de cada enzima en un volumen total de 150 μL.
        NOTA: El cóctel inicial para DRIP-seq (HindIII, SspI, EcoRI, BsrGI, XbaI)4 se desarrolló para generar una longitud promedio de fragmento de 5 kilobases. Evite cualquier interferencia con la metilación de CpG y evite las regiones ricas en GC del genoma. Otros cócteles también son posibles16). Estos cócteles son adecuados tanto para el genoma humano como para el del ratón, pero se pueden ajustar según sea necesario.
      2. Incubar la mezcla de reacción durante la noche a 37 °C.
        NOTA: La mezcla de ADN después de la digestión ya no debe ser viscosa. Cualquier viscosidad restante en este paso es indicativa de una digestión incompleta.
      3. Si se observa, agregue 10 U adicionales de cada enzima e incube durante otras 2-4 h a 37 °C.
        NOTA: Es posible que los usuarios no digieran todo el pellet en caso de que hayan cosechado más células de las recomendadas aquí.
    2. Pipetear suavemente el ADN digerido durante la noche (150 μL) en un tubo de luz de gel de bloqueo de fase de 2 ml prehilado. Añadir 100 μL de agua y un volumen (250 μL) de fenol/cloroformo alcohol isoamílico (25:24:1). Invierta suavemente cinco veces y gire hacia abajo a 16,000 x g durante 10 minutos.
    3. Añadir 1,5 μL de glucógeno, 1/10 de volumen de 3 M de NaOAc (pH 5,2) y 2,5 volúmenes de etanol 100% a un nuevo tubo de 1,5 mL. Pipetear el ADN del tubo de gel de bloqueo de fase y mezclar invirtiendo cinco veces. Incubar durante 1 h a -20 °C.
    4. Centrifugar a 16.000 x g durante 35 min a 4 °C. Lavar el ADN con 200 μL de etanol al 80% y centrifugar a 16.000 x g durante 10 min a 4 °C.
    5. Seque el pellet al aire y añada 50 μL de tampón TE al pellet. Deje el tubo en hielo durante 30 minutos y vuelva a suspender suavemente el ADN.
    6. Mida la concentración (OD260) del ADN fragmentado utilizando un espectrofotómetro.
    7. Opcional pero recomendado: Cargue 1 μg de ADN digerido en un gel de agarosa al 0,8% junto con un marcador de tamaño para verificar que la digestión se ha completado. Deje correr el gel durante una hora a 100 V.
      NOTA: Si está incompleto, se puede agregar una enzima adicional. La digestión incompleta puede llevar a la pérdida de resolución después de la inmunoprecipitación.
    8. Después de este paso, tratar 10 μg de ADN digerido con 4 μL de ribonucleasa H (RNasa H) durante 1-2 h a 37 °C para asegurarse de que la señal recuperada tras la inmunoprecipitación se deriva de híbridos de ADN:ARN. A continuación, proceda a la inmunoprecipitación de S9.6 (paso 4).
      NOTA: El ADN digerido puede mantenerse congelado a -80 °C durante un máximo de un mes sin pérdida significativa de rendimiento.
  2. Sonicación
    1. Sonicar todo o parte del ADN extraído en un tubo de microcentrífuga de 0,5 mL en un volumen total de 100 μL. Realice 15-20 ciclos de 30 s ON / 30 s OFF en un sonicador (gire después de 5, 10 y 15 ciclos para garantizar una sonicación homogénea).
    2. Mida la concentración (OD260) de ADN sonicado en un espectrofotómetro.
      NOTA: En este paso, la viscosidad del ADN debería haber desaparecido.
    3. Ejecute un gel de agarosa para confirmar la distribución del tamaño del ADN sonicado (300-500 pb).
      NOTA: La sobresonicación del ADN puede provocar una reducción significativa del rendimiento derivada de la rotura y disociación de las estructuras del bucle R.
    4. Después de este paso, tratar 10 μg de ADN sonicado con 4 μL de ARNasa H durante 1-2 h a 37 °C para asegurarse de que la señal recuperada tras la inmunoprecipitación se deriva de híbridos de ADN:ARN. A continuación, proceda a la inmunoprecipitación de S9.6 (paso 4).

4. Inmunoprecipitación S9.6

NOTA: Los pasos de inmunoprecipitación son similares independientemente de si el ADN se fragmentó a través de ER o sonicación.

  1. Prepare tres tubos y una alícuota de 4,4 μg de ADN fragmentado en un volumen final de 500 μL de tampón TE por tubo. Guarde 50 μL (1/10 del volumen) de cada tubo para usarlo más tarde como ADN de entrada.
  2. Añadir 50 μL de tampón de unión 10x (100 mM de NaPO4 pH 7, 1,4 M de NaCl, 0,5% de Triton X-100) y 10 μL de anticuerpo S9.6 (1 mg/mL) a los 450 μL del ADN diluido.
  3. Incubar durante la noche a 4 °C en un rotor de minitubos a 7-10 rpm.
  4. Para cada tubo, lavar 50 μL de lechada de perlas de agarosa Protein A/G con 700 μL de tampón de unión 1x invirtiendo los tubos en un mini-rotador a 7-10 rpm a temperatura ambiente durante 10 min. Gire las cuentas a 1.100 x g durante 1 minuto y deseche el sobrenadante. Repita este paso una vez.
  5. Añadir el ADN del paso 4.3 a los 50 μL de perlas e incubar durante 2 h a 4 °C mientras se invierte a 7-10 rpm en un mini-rotador.
  6. Girar las perlas durante 1 minuto a 1.100 x g y desechar el sobrenadante.
  7. Lave las perlas con 750 μL de tampón de unión 1x invirtiendo a 7-10 rpm en un mini-rotador durante 15 min. Girar durante 1 minuto a 1.100 x g y desechar el sobrenadante. Repita este paso una vez.
  8. Añadir 250 μL del tampón de elución (50 mM de Tris-Cl pH 8, 10 mM de EDTA pH 8, 0,5% SDS) y 7 μL de proteinasa K (20 mg/mL de caldo) a las perlas e incubar con rotación a 55 °C (12 rpm) durante 45 min.
  9. Girar las cuentas durante 1 minuto a 1.100 x g. Transfiera el sobrenadante a un tubo de luz de gel de bloqueo de fase de 2 mL prehilado y agregue un volumen (250 μL) de alcohol isoamílico fenol/cloroformo (25:24:1). Invierta los tubos cinco veces y gírelos durante 10 minutos a 16.000 x g a temperatura ambiente.
  10. Añadir 1,5 μL de glucógeno, 1/10 de volumen de NaOAc 3M (pH 5,2) y 2,5 volúmenes de etanol al 100% a un nuevo tubo de 1,5 mL. Pipetear el ADN del tubo de gel de bloqueo de fase y mezclar invirtiendo cinco veces. Incubar durante 1 h a -20 °C.
  11. Centrifugar a 16.000 x g durante 35 min a 4 °C. Lavar el ADN con 200 μL de etanol al 80% y centrifugar a 16.000 x g durante 10 min a 4 °C.
  12. Secar al aire los pellets y añadir 15 μL de 10 mM de Tris-Cl (pH 8) en cada tubo. Deje los tubos en hielo durante 20 minutos y vuelva a suspenderlos suavemente. Combine el contenido de los tres tubos en un solo tubo (45 μL).
  13. Compruebe la eficiencia del goteo mediante qPCR utilizando 5 μL de los 45 μL de ADN resuspendido (ver Resultados representativos). Diluir los 5 μL en 10 μL de agua y utilizar 2 μL por reacción.

5. Paso previo a la biblioteca solo para ADN sonicado

NOTA: La sonicación hace que la hebra desplazada de ssDNA de los bucles R se rompa. Así, las estructuras de bucle R de tres cadenas se convierten en híbridos de ADN:ARN de dos cadenas tras la sonicación. Como resultado, estos híbridos ADN:ARN deben convertirse de nuevo en ADN bicatenario antes de la construcción de la biblioteca. Aquí, se emplea un segundo paso de síntesis de hebras. Un enfoque alternativo que se ha utilizado con éxito es realizar una ligadura de ADN monocatenario seguida de una síntesis de segunda cadena53.

  1. A los 40 μL de ADN DRIP del paso 4.12, agregue 20 μL de tampón de segunda cadena 5x (200 mM de Tris pH 7, 22 mM MgCl2, 425 mM KCl), 10 mM de mezcla de dNTP (dATP, dCTP, dGTP y dTTT o dUTP si el usuario planea lograr una secuenciación de DRIP específica de la cadena), 1 μL 16 mM de NAD, y 32 μL de agua. Mezclar bien e incubar durante 5 min en hielo.
  2. Añadir 1 μL de ADN polimerasa I (10 unidades), 0,3 μL de RNasa H (1,6 unidades) y 0,5 μL de ADN ligasa de E. coli . Mezclar e incubar a 16 °C durante 30 min.
  3. Limpie inmediatamente la reacción utilizando perlas paramagnéticas con una proporción de 1,6x. Eluir el ADN en 40 μL de Tris-Cl de 10 mM (pH 8).

6. Paso de sonicación previa a la biblioteca solo para RE DNA

NOTA: El goteo conduce a la recuperación de fragmentos de RE que a menudo tienen kilobases de longitud y, por lo tanto, no son adecuados para la construcción inmediata de bibliotecas.

  1. Para reducir el tamaño del material para la construcción de bibliotecas, sonicar el ADN inmunoprecipitado en un tubo de microcentrífuga de 0,5 mL. Realice 12 ciclos de 15 s ON / 60 s OFF en un sonicador (gire después de seis ciclos para garantizar una sonicación homogénea). Continúe con el paso 7.
    NOTA: El material inmunoprecipitado sigue llevando los bucles R de tres hebras que responden a la sonicación de forma diferente a la del ADN bicatenario que flanquea.
  2. Paso opcional: Para igualar los perfiles de goteo, tratar el material inmunoprecipitado con 1 μL de RNasa H en 1x tampón de RNasa H durante 1 h a 37 °C antes de la sonicación.

7. Construcción de la biblioteca

  1. Realice la reparación del extremo añadiendo a los 40 μL del paso 4.12 (fragmentación de RE) o del paso 5.3 (cizallamiento por sonicación) 5 μL de tampón del módulo de reparación de extremos 10x, 2,5 μL de ATP de 10 mM y 2,5 μL de enzima del módulo de reparación de extremos (50 μL en total). Mezclar bien e incubar durante 30 min a temperatura ambiente. Incluya 1 μg de ADN de entrada RE-digerido y sonicado (DRIP) o sonicado (sDRIP) para crear bibliotecas de secuenciación de control correspondientes al ADN de entrada.
  2. Limpie la reacción utilizando perlas paramagnéticas (relación 1,6x) y eluya en 34 μL de 10 mM de Tris-Cl (pH 8).
  3. Realice la cola A añadiendo 5 μL de tampón 2, 10 μL de 1 mM de dATP y 1 μL de Klenow exo- (50 μL en total). Mezclar bien e incubar la mezcla durante 30 min a 37 °C.
  4. Limpie la reacción utilizando perlas paramagnéticas (relación 1,6x) y eluya en 12 μL de 10 mM de Tris-Cl (pH 8).
  5. Ligate adaptadores añadiendo 15 μL de tampón de ligadura rápida 2x, 1 μL de adaptadores de 15 μM y 2 μL de ligasa rápida (30 μL en total). Mezclar bien e incubar durante 20 min a temperatura ambiente.
  6. Limpie la reacción utilizando perlas paramagnéticas (relación 1x) y eluya en 20 μL de 10 mM de Tris-Cl (pH 8).
  7. Si se ha realizado un cizallamiento por sonicación y se ha utilizado dUTP en el paso 5.1, añadir 1,5 μL (1,5 U) de uracilo N-glicosilasa e incubar durante 30 min a 37 °C para obtener un DRIP específico de la cadena.
  8. La PCR amplifica 10 μL de la biblioteca desde el paso 6.6 o 6.7. Agregue 1 μL de cebador de PCR 1.0 P5 (ver Tabla de Materiales), 1 μL de cebador de PCR 2.0 P7 (ver Tabla de Materiales), 15 μL de mezcla maestra y 3 μL de agua. Mezclar bien.
  9. En un termociclador, ejecute el programa como se muestra en la Tabla 1.
  10. Proceda a una limpieza de dos pasos de la biblioteca utilizando perlas paramagnéticas. En primer lugar, utilice una relación de 0,65x para eliminar fragmentos de más de 500 pb. Conserva el sobrenadante. Proceda a una proporción de 1x en el sobrenadante para eliminar los fragmentos por debajo de 200 pb. Eluir en 12 μL de 10 mM de Tris-HCl (pH 8).

8. Control de calidad

  1. Para comprobar el enriquecimiento del bucle R con qPCR en dos loci negativos y tres positivos utilizando el método Pfaffl, utilice 1 μL de la biblioteca de limpieza del paso 6.10. Diluir 1 μL de la biblioteca en 10 μL de agua y utilizar 2 μL por locus.
  2. Compruebe la distribución de tamaños de la biblioteca limpiada del paso 6.10 utilizando un kit de ADN de alta sensibilidad.

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Resultados

Tanto el DRIP como el sDRIP pueden analizarse mediante qPCR (Figura 2A) y/o secuenciación (Figura 2B). Después de la etapa de inmunoprecipitación, la calidad del experimento debe confirmarse primero mediante qPCR en loci de control positivos y negativos, así como con controles tratados con RNasa H. En la Tabla 2 se proporcionan cebadores correspondientes a loci de uso frecuente en múltiples líneas celulares humanas. Los resultados de la qPCR deb...

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Discusión

Aquí se describen dos protocolos para mapear las estructuras del bucle R en potencialmente cualquier organismo que utilice el anticuerpo S9.6. DRIP-seq representa la primera técnica de mapeo de bucle R de todo el genoma desarrollada. Es una técnica fácil, robusta y reproducible que permite mapear la distribución de los bucles R a lo largo de cualquier genoma. La segunda técnica, denominada sDRIP-seq, también es robusta y reproducible, pero logra una mayor resolución y especificidad de he...

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Divulgaciones

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Agradecimientos

El trabajo en el laboratorio de Chedin está respaldado por una subvención de los Institutos Nacionales de Salud (R01 GM120607).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tubo de 15 mL Gel de bloqueo de fase Maxtract de alta densidadQiagen129065
Tubo de 2 mL gel de bloqueo de faseligero VWR10847-800
Abalorios de agarosa A/GThermoFisher Scientific20421
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S9.6 AnticuerpoKerafastENH001Estos tres las fuentes son
equivalentes S9.6 AnticuerpoMillipore/SigmaMABE1095
S9.6 AnticuerpoAbcamab234957
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Referencias

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