Se ha diseñado un protocolo de extracción de ARN fácil de usar para la identificación de ARN que participan en la interacción directa ARN/ARN con un ARN largo no codificante. El protocolo utiliza el psoraleno como fijador para entrecruzar solo las interacciones ARN/ARN y proporciona todo el interactoma directo de ARN de un ARN largo no codificante cuando se combina con la secuenciación de ARN.
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Artículo de método
Identificación de ARN que participan en la interacción directa ARN-ARN con un ARN largo no codificante
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Resumen
Resumen
El creciente papel que se atribuye hoy en día a los ARN largos no codificantes (lncRNA) en fisiología y fisiopatología hace que sea crucial caracterizar su interactoma mediante la identificación de sus socios moleculares, ADN, proteínas y/o ARN. Estos últimos pueden interactuar con el lncRNA a través de redes que involucran proteínas, pero también pueden participar en interacciones directas de ARN / ARN. Por lo tanto, desarrollamos un procedimiento de extracción de ARN fácil de usar que permitió la identificación de ARN involucrados en la interacción directa de ARN / ARN con un lncRNA utilizando psoraleno, una molécula que se entrecruza solo con interacciones de ARN / ARN. El modelado bioinformático de la estructura secundaria del lncRNA permitió la selección de varias sondas específicas de oligonucleótidos de ADN antisentido con una fuerte afinidad por las regiones que muestran una baja probabilidad de apareamiento interno de bases. Dado que las sondas específicas que se diseñaron se dirigieron a regiones accesibles a lo largo de la longitud del lncRNA, las zonas de interacción del ARN pudieron delinearse en la secuencia del lncRNA. Cuando se combina con una secuenciación de ARN de alto rendimiento, este protocolo se puede utilizar para todos los estudios de interactoma de ARN directo de un lncRNA de interés.
Introducción
Los ARN largos no codificantes (lncRNA) son transcripciones no codificantes de proteínas de más de 200 nucleótidos de longitud. Su número es cada vez mayor, más de 58.000 en humanos. Además, su papel crucial en fisiología y fisiopatología hace que sea esencial caracterizar sus socios moleculares que les permitan implementar sus funciones reguladoras. En realidad, un enfoque para comprender las funciones de los lncRNAs es la detección de los socios moleculares que interactúan de cada lncRNA.
Las dianas moleculares de los lncRNAs pueden ser ADN, proteínas o RNAs, y se han desarrollado diversas técnicas para identificarlas. En este sentido, la identificación de proteínas que interactúan con lncRNAs es el objetivo de varios protocolos, incluyendo diferentes procedimientos de inmunoprecipitación de ARN (RIP) en los que se utiliza un anticuerpo contra la proteína de interés para derribar específicamente lncRNAs (para una revisión1). Otras técnicas como el Análisis de Hibridación por Captura de Dianas de ARN2 (CHART) o el Aislamiento de Cromatina por Purificación de ARN3 (ChIRP) permiten desacoplar los lncRNAs junto con los complejos proteicos asociados. En estas últimas técnicas se utiliza el lncRNA como cebo. CHART y ChIRP también son técnicas poderosas para identificar mapas genómicos que muestran la ocupación de lncRNA 2,3. Además, estos métodos de extracción de ARN permiten identificar los socios de ARN de un lncRNA. Se ha descrito un procedimiento que permite la captura de ARNs diana por un lncRNA. Las sondas de oligonucleótidos biotinilados de ADN antisentido están diseñadas contra regiones de baja probabilidad de apareamiento de bases internas según lo determinado por el modelado bioinformático de la estructura secundaria del lncRNA4. Sin embargo, este procedimiento no discrimina si los socios de ARN interactúan indirectamente a través de una red de proteínas o directamente a través de interacciones directas de ARN/ARN con el lncRNA. Se ha demostrado que la reticulación con derivados del psoraleno es el método de elección para seleccionar interacciones directas ARN/ARN mediadas por apareamiento de bases5. De hecho, los derivados del psoraleno son capaces de intercalarse en ADN o ARN bicatenario y de unirse covalentemente a las pirimidinas después de la irradiación con luz ultravioleta (365 nm)6. El acoplamiento de la reducción del ARN mediante sondas de oligonucleótidos biotinilados con la reticulación con el psoraleno es un procedimiento fácil de usar propuesto aquí para la identificación de los ARN que participan en interacciones directas de ARN/ARN con un lncRNA. Además, este procedimiento puede permitir delinear las zonas de interacción del ARN en la secuencia del lncRNA si se utilizan diferentes sondas de oligonucleótidos diseñadas a lo largo del lncRNA.
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Protocolo
1. Diseño de la sonda
- Genere la estructura secundaria del lncRNA utilizando un software de servidor web gratuito especializado: RNAstructure software7 o Vienna RNA web suite8. Seleccione regiones que muestren una baja probabilidad de apareamiento interno de bases y diseñe sondas de oligonucleótidos antisentido de 25 bases largas para diferentes regiones de este lncRNA.
- Compruebe todos los oligonucleótidos diseñados con el software académico gratuito, AmplifX (https://inp.univ-amu.fr/en/amplifx-manage-test-and-design-your-primers-for-pcr), para obtener información diferente sobre estas sondas y elegir aquellas con los mejores parámetros.
NOTA: Verifique los parámetros óptimos en el software de la siguiente manera. Porcentaje de GC: entre 40 y 60%, 3' estabilidad, complejidad, dímero propio: "bueno". La temperatura de fusión (TM) no es importante porque la afinidad se realiza a temperatura ambiente. - Usando una herramienta de búsqueda de alineación (es decir, Blast, etc.), asegúrese de que las sondas de oligonucleótidos antisentido seleccionadas no reconozcan secuencias de nucleótidos en ningún otro ARN expresado en las células de elección.
- Diseño de una sonda de oligonucleótidos de ADN inespecífico de 25 bases de largo. Asegúrese de que esta sonda no muestre afinidad por el lncRNA de interés ni por ninguna otra secuencia de ARN en el genoma de interés.
- Pida todas las sondas con una modificación de biotina añadida a su extremo 3' junto con un espaciador de trietilenglicerol (TEG). Este espaciador aumenta la distancia entre oligo-biotina para evitar el obstáculo estérico.
NOTA: Para obtener un resultado óptimo y evaluar la especificidad de los resultados del pull-down, diseñe un mínimo de dos sondas de oligonucleótidos antisentido diferentes en la misma región y luego compare su eficiencia experimentalmente.
2. Reticulación
- Células de crecimiento (por ejemplo, células GH4C1 utilizadas en este experimento) hasta la confluencia en placas de cultivo celular de 78,5cm2 . Después de retirar el medio de cultivo celular, enjuague la capa celular con 5 mL de solución salina fría tamponada con fosfato enriquecida con Ca2+ y Mg2+ (PBS+) y agregue 3 mL de solución de molécula derivada del psoraleno (clorhidrato de 4′Aminometiltrioxsalen) preparada en PBS+ a una concentración de 0,1 mg/mL.
- Colocar la placa de cultivo durante 30 min en una incubadora de cultivo de células de mamíferos a 37 °C con 5% de CO2. Después de 30 minutos, retire la tapa, coloque las placas de cultivo en hielo a 2,5 cm de distancia de los tubos UV de 365 nm en un reticulante UV durante 10 minutos. Agite los platos con delicadeza y restablezca la exposición a los rayos UV durante un período adicional de 10 minutos.
- Deseche el medio por aspiración, agregue 1 mL de PBS+ para recolectar células con un raspador de células y transfiéralo a un microtubo. Centrifugar a 4 °C, 400 x g durante 5 min. Retire la mayor cantidad posible de sobrenadante y almacene los pellets a -80 °C.
3. Lisis celular
- Prepare el tampón de proteinasa K añadiendo 100 mM de NaCl, 10 mM de Tris-HCl, pH 7,0, 1 mM de EDTA, 0,5% de SDS y 5 μL/mL de inhibidor de ARNasa.
- Vuelva a suspender los gránulos de celdas en este tampón (aproximadamente 200 μL por 1 x 107 celdas). Añadir proteinasa K hasta una concentración final de 0,1 μg/μL e incubar durante 45 min a 50 °C. A continuación, incubar durante 10 min a 95 °C, para inactivar la proteinasa K.
4. Sonicación
- Distribuir 100 μL de este lisado (correspondiente a 5,106 células) en dos microtubos y añadir 200 μL de tampón de hibridación (700 mM de NaCl, 70 mM de Tris-HCl, pH 7,0, 1 mM de EDTA, 1,25% de SDS, 5 μL/mL de solución inhibidora de la ARNasa y 15% de formamida) en cada tubo.
- Coloque los tubos en el baño de agua a 4 °C de un sonicador e inicie la sonicación con 2 series de impulsos de 30 s (alta intensidad) separadas por 30 s de desconexión.
- Recoja 20 μL de muestras para que sirvan como muestras de control de entrada y almacene a -80 °C.
NOTA: Este procedimiento de sonicación se optimizó previamente para la línea celular GH4C1 con el fin de obtener fragmentos de ARN con un rango de 2.000 nucleótidos9. Para otras líneas celulares, el procedimiento de sonicación debe optimizarse. Cuando esta técnica se realiza para estudiar los ARN asociados de un ARN no codificante muy largo, la etapa de sonicación resulta indispensable para obtener una recuperación adecuada del lncRNA. En este caso, por lo tanto, es necesario diseñar varias sondas con un sitio de unión ubicado cada 4.000 nucleótidos como máximo a lo largo de la longitud del lncRNA. Para recuperar la longitud completa del lncRNA, utilice un grupo de varias sondas específicas. Sin embargo, si el propósito es identificar las regiones del lncRNA involucradas en la unión ARN-ARN, las sondas específicas deben usarse por separado. Además, si se estudian ARN asociados de un lncRNA más pequeño, se deben realizar experimentos para determinar si es necesario el paso de sonicación.
5. Extracción de ARN
- Día 1 - Paso de hibridación
- Añadir 150 pmol (1,5 μL de una solución madre de 100 μM) de una sonda biotinilada específica o inespecífica a cada tubo de muestra. Incubar durante 4 h bajo agitación en un rotor de tubo a temperatura ambiente (RT) (aproximadamente 30 rpm).
- Tome el volumen necesario de perlas magnéticas (es decir, 40 μL de perlas por 150 pmol de reacción de hibridación de sondas). Utilice el soporte magnético para separar las cuentas de los medios comerciales. Deseche el sobrenadante y lave las perlas con 900 μL del tampón de hibridación. Una vez hecho esto, resuspenda las perlas magnéticas en el mismo volumen del tampón de hibridación.
- Agregue perlas magnéticas en cada tubo de muestra (40 μL de perlas por 150 pmol de reacción de hibridación de sondas). Incubar durante la noche bajo agitación en un rotor de tubo a RT (aproximadamente 30 rpm).
- Día 2 - Paso de aislamiento de ARN
- Separe las perlas del lisado celular con un soporte magnético (2-3 min). Deseche el sobrenadante y lave las perlas con 900 μL del tampón de lavado (0,5% SDS, 2x SSC) con 5 min de incubación bajo agitación en el rotador a RT. Repita este lavado 5 veces.
- Después de retirar el último lavado, agregue 95 μL de tampón de proteinasa K en las perlas. Descongele las muestras de entrada y añada 75 μL de tampón de proteinasa K. Añadir 5 μL de proteinasa K hasta una concentración final de 1 μg/μL en todos los tubos (muestras y muestras de entrada). Incubar a 45 °C durante 45 min y luego a 95 °C durante 10 min.
- Mantenga la muestra en hielo. Utilice un soporte magnético para separar las perlas de los ARN presentes en el sobrenadante. Purifique los ARN con un kit de purificación de ARN que incluye un paso de digestión de la DNasa. Almacene los ARN purificados a -80 °C.
NOTA: El ARN eluido puede someterse a RT-qPCR o secuenciación de ARN de alto rendimiento para detectar transcripciones enriquecidas. Para el análisis de secuenciación de ARN, las lecturas se pueden alinear con el genoma de interés utilizando software libre, como STAR10 o HISAT211, y la cuantificación se puede realizar utilizando FeatureCounts12 o HTSeq count13.
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Resultados
La elucidación del interactoma de lncRNA, es decir, los componentes celulares que interactúan con lncRNAs, proteínas, ARN y ADN, es de vital importancia para comprender las funciones de los lncRNAs. Se han desarrollado varias técnicas para caracterizar el interactoma de lncRNA, incluyendo RIP, CHART, ChIRP y RNA pull-down. Si bien se ha demostrado que este último es poderoso para identificar objetivos de ARN de lncRNA, estos procedimientos no indican si los socios de ARN interactúan indirectamente a través de una red de ...
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Discusión
Numerosos lncRNAs llevan a cabo su función a través del apareamiento de bases complementarias a los ARNm. Por lo tanto, es importante desarrollar procedimientos que permitan caracterizar el interactoma de ARN directo de los lncRNAs. Por lo tanto, se desarrolló un procedimiento que combina el uso de psoraleno como reactivo de reticulación con la técnica de extracción de ARN.
En el protocolo pull-down de ARN descrito, el diseño y la selección de las sondas de ol...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo contó con el apoyo de la Universidad de Aix-Marseille y el Centre National Recherche Scientifique y financiado por una subvención de los Laboratorios Sandoz.
Financiación de la tarifa de acceso abierto: Universidad de Aix-Marseille y Centre National Recherche Scientifique
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 4′-Clorhidrato de aminometiltrioxsalen | Sigma | A4330 | Reactivo de reticulación |
| Bioruptor Plus | Diagenode | B01020001 | Sonicator |
| Sondas biotiniladas | IDT | Sondas de oligonucleótidos | |
| CFX96 Sistema en tiempo real | BioRad | 4351107 | aparato de qPCR |
| ADN Olignucleótidos | IDT | Imprimadores para qPCR | |
| Dynabeads My One | Thermo-Fisher | 65001 | Perlas magnéticas de estreptavidina |
| Formamida | Thermo-Fisher | 15515-026 | Formamida |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | BioRad | 1725124 | reactivo qPCR |
| Proteinasa K | Sigma | P2308 | Proteinasa K |
| ARN a ADN | Thermo-Fisher | 4387405 | Kit de transcripción inversa |
| Kit de purificación de ARN XS | Macherey-Nagel | 740902 | kit de purificación de ARN |
| RNAseOUT | Thermo-Fisher | 10777-019 | Inhibidor de ARNasa |
| Rotador de tubo | Stuart | SB2 | Eppendorf Rotador de tubo |
| UV Stratalinker 1800 | Stratagene | #400072 | Reticulante UV |
Referencias
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