Co-cultivo de microglía y neuronas corticales diferenciadas de células madre pluripotentes inducidas humanas

Kara Lopez-Lengowski; Annie Kathuria; Kaia Gerlovin; Rakesh Karmacharya

doi:10.3791/62480

Artículo de método

Co-cultivo de microglía y neuronas corticales diferenciadas de células madre pluripotentes inducidas humanas

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DOI:

10.3791/62480

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21 de septiembre de 2021

Kara Lopez-Lengowski¹^,² , Annie Kathuria¹^,²^,³ , Kaia Gerlovin¹^,² , Rakesh Karmacharya¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷

¹Center for Genomic Medicine, Massachusetts General Hospital, ²Chemical Biology Program, Broad Institute of MIT & Harvard, ³Department of Psychiatry, Harvard Medical School, ⁴Schizophrenia and Bipolar Disorder Program, McLean Hospital, ⁵Program in Neuroscience, Harvard University, ⁶Program in Chemical Biology, Harvard University, ⁷Harvard Stem Cell Institute

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe una metodología para diferenciar la microglía de las iPSC humanas y mantenerlas en cocultivo con neuronas corticales derivadas de iPSC con el fin de estudiar los fundamentos mecanicistas de las interacciones neuroinmunes utilizando neuronas humanas y microglía.

Resumen

La capacidad de generar microglía a partir de células madre pluripotentes inducidas por humanos (iPSC) proporciona nuevas herramientas y vías para investigar el papel de la microglía en la salud y la enfermedad. Además, la microglía derivada de iPSC puede mantenerse en cocultivo con neuronas corticales derivadas de iPSC, lo que permite investigar las interacciones microglía-neurona que se supone que están desreguladas en una serie de trastornos neuropsiquiátricos. Las iPSCs humanas se diferenciaron para generar microglía utilizando una versión adaptada de un protocolo desarrollado por el grupo de Fossati, y la microglía derivada de iPSCs se validó con análisis de marcadores y PCR en tiempo real. Las microglías humanas generadas mediante este protocolo fueron positivas para los marcadores CD11C, IBA1, P2RY12 y TMEM119, y expresaron los genes relacionados con la microglía AIF1, CX3CR1, ITGAM, ITGAX, P2RY12 y TMEM119. Las neuronas corticales humanas derivadas de iPSC que se habían diferenciado durante 30 días se platearon con microglía y se mantuvieron en cocultivo hasta el día 60, cuando se llevaron a cabo los experimentos. La densidad de espinas dendríticas en neuronas corticales en cocultivo con microglía se cuantificó en condiciones basales y en presencia de citocinas proinflamatorias. Con el fin de examinar cómo la microglía modula la función neuronal, se llevaron a cabo experimentos de imágenes de calcio de las neuronas corticales utilizando el indicador de calcio Fluo-4 AM. La actividad de calcio vivo de las neuronas corticales se obtuvo utilizando un microscopio confocal y la intensidad de fluorescencia se cuantificó utilizando ImageJ. Este informe describe cómo el cocultivo de microglía y neuronas corticales derivadas de iPSC humanas proporciona nuevos enfoques para interrogar los efectos de la microglía en las neuronas corticales.

Introducción

En el cerebro humano, las microglías son las^{principales células} inmunitarias innatas. El desarrollo del cerebro está regulado por la microglía a través de dos vías: la liberación de factores difusibles y la fagocitosis¹. Los factores difusibles derivados de la microglía ayudan a apoyar la mielinización, la neurogénesis, la formación sináptica, la maduración, la muerte celular y la supervivencia celular¹. La microglía también fagocita varios elementos en las sinapsis cerebrales, los axones y en las células vivas y muertas 2,3,4,5....