Artículo de método

Co-cultivo de microglía y neuronas corticales diferenciadas de células madre pluripotentes inducidas humanas

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DOI:

10.3791/62480

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21 de septiembre de 2021

 ,  ,  , 
1Center for Genomic Medicine, Massachusetts General Hospital, 2Chemical Biology Program, Broad Institute of MIT & Harvard, 3Department of Psychiatry, Harvard Medical School, 4Schizophrenia and Bipolar Disorder Program, McLean Hospital, 5Program in Neuroscience, Harvard University, 6Program in Chemical Biology, Harvard University, 7Harvard Stem Cell Institute

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe una metodología para diferenciar la microglía de las iPSC humanas y mantenerlas en cocultivo con neuronas corticales derivadas de iPSC con el fin de estudiar los fundamentos mecanicistas de las interacciones neuroinmunes utilizando neuronas humanas y microglía.

Resumen

La capacidad de generar microglía a partir de células madre pluripotentes inducidas por humanos (iPSC) proporciona nuevas herramientas y vías para investigar el papel de la microglía en la salud y la enfermedad. Además, la microglía derivada de iPSC puede mantenerse en cocultivo con neuronas corticales derivadas de iPSC, lo que permite investigar las interacciones microglía-neurona que se supone que están desreguladas en una serie de trastornos neuropsiquiátricos. Las iPSCs humanas se diferenciaron para generar microglía utilizando una versión adaptada de un protocolo desarrollado por el grupo de Fossati, y la microglía derivada de iPSCs se validó con análisis de marcadores y PCR en tiempo real. Las microglías humanas generadas mediante este protocolo fueron positivas para los marcadores CD11C, IBA1, P2RY12 y TMEM119, y expresaron los genes relacionados con la microglía AIF1, CX3CR1, ITGAM, ITGAX, P2RY12 y TMEM119. Las neuronas corticales humanas derivadas de iPSC que se habían diferenciado durante 30 días se platearon con microglía y se mantuvieron en cocultivo hasta el día 60, cuando se llevaron a cabo los experimentos. La densidad de espinas dendríticas en neuronas corticales en cocultivo con microglía se cuantificó en condiciones basales y en presencia de citocinas proinflamatorias. Con el fin de examinar cómo la microglía modula la función neuronal, se llevaron a cabo experimentos de imágenes de calcio de las neuronas corticales utilizando el indicador de calcio Fluo-4 AM. La actividad de calcio vivo de las neuronas corticales se obtuvo utilizando un microscopio confocal y la intensidad de fluorescencia se cuantificó utilizando ImageJ. Este informe describe cómo el cocultivo de microglía y neuronas corticales derivadas de iPSC humanas proporciona nuevos enfoques para interrogar los efectos de la microglía en las neuronas corticales.

Introducción

En el cerebro humano, las microglías son lasprincipales células inmunitarias innatas. El desarrollo del cerebro está regulado por la microglía a través de dos vías: la liberación de factores difusibles y la fagocitosis1. Los factores difusibles derivados de la microglía ayudan a apoyar la mielinización, la neurogénesis, la formación sináptica, la maduración, la muerte celular y la supervivencia celular1. La microglía también fagocita varios elementos en las sinapsis cerebrales, los axones y en las células vivas y muertas 2,3,4,5,6,7,8. Los receptores de la microglía reconocen marcas como la calreticulina, el ATP y el ácido siálico y regulan la fagocitosis celular 9,10. En el hipocampo, la microglía mantiene la homeostasis de la neurogénesis a través de su papel fagocítico11.

Se ha demostrado que la fagocitosis sináptica en el núcleo geniculado dorsolateral (dLGN) del cerebro de roedor está regulada por la microglía1. En roedores, se ha demostrado que hay dos períodos durante el desarrollo en los que se observa una intensa fagocitosis sináptica microglial. El primer período ocurre durante la formación inicial de sinapsis y el segundo período ocurre cuando las conexiones se están afinando y podando12. Otros factores que están involucrados en la poda sináptica son las proteínas inflamatorias y el complejo mayor de histocompatibilidad de clase I (MHC1, H2-K, b y Db)13,14. Se ha sugerido que C1q (componente del complemento 1q) en la microglía se colocaliza con MHC1, lo que desencadena la poda sináptica15. Además, los estudios en ratones muestran que la interleucina-33 (IL-33) secretada por los astrocitos regula la homeostasis de la sinapsis en el tálamo y la médula espinal a través de sus efectos sobre la microglía, aunque esto aún no se ha investigado en humanos13. La microglía segrega una variedad de citocinas que ayudan a mantener la salud neuronal, como el factor de necrosis tumoral α (TNFα), IL-1β, IL-6, IL-10 e interferón-γ (IFN-γ) y estas citocinas pueden modular la espina dendrítica y la formación de sinapsis 16,17,18. Existen lagunas significativas en nuestro conocimiento de las interacciones neurona-microglía durante el desarrollo del cerebro humano. La mayor parte de nuestro conocimiento proviene de estudios de modelos de roedores, mientras que hay una escasez de información sobre los aspectos temporales y mecánicos de la poda sináptica en la corteza humana. La microglía apoya la supervivencia neuronal en el neocórtex, y otros tipos de células también contribuyen1. No está claro cómo contribuye la microglía a esta preservación y cuál es la interacción entre la microglía y los otros tipos de células. La microglía libera varias citocinas que afectan el desarrollo neuronal y sináptico, pero las bases mecanicistas de sus efectos de estas citocinas en las neuronas son en gran parte desconocidas19,20. Para desarrollar una comprensión más completa de la función de la microglía en el cerebro humano, es fundamental explorar sus interacciones con los diferentes tipos de células que se encuentran en el cerebro humano. Este informe describe un método para el cocultivo de neuronas humanas derivadas de iPSC y microglía generadas a partir del mismo individuo. El establecimiento de esta metodología permitirá realizar investigaciones bien definidas para interrogar la naturaleza de las interacciones microglía-neuronas y desarrollar modelos celulares in vitro robustos para estudiar la disfunción neuroinmune en el contexto de diferentes trastornos neuropsiquiátricos y del neurodesarrollo.

El papel de la microglía en la esquizofrenia
La poda sináptica es un importante proceso del neurodesarrollo que tiene lugar en el cerebro adolescente21,22. Múltiples líneas de evidencia sugieren que la poda sináptica durante este período crítico es anormal en la esquizofrenia (SCZ)23,24,25,26. El SCZ es un trastorno psiquiátrico crónico y debilitante caracterizado por alucinaciones, delirios, procesos de pensamiento alterados y déficits cognitivos23,24. La microglía, los macrófagos residentes en el cerebro, juegan un papel central en la poda sináptica25,26. Los estudios postmortem y de tomografía por emisión de positrones (PET) muestran evidencia de actividad microglial disfuncional en SCZ 25,26,27,28,29,30,31,32. Los cerebros SCZ postmortem muestran diferencias bien replicadas pero sutiles en el cerebro: las neuronas piramidales en la capa cortical III muestran una disminución de la densidad de la espina dendrítica y menos sinapsis 33,34,35. La poda sináptica es un proceso mediante el cual las conexiones sinápticas excitatorias superfluas son eliminadas por la microglía durante la adolescencia, cuando los pacientes con SCZ suelen tener su primer brote psicótico22,36. Los estudios postmortem muestran una asociación entre la SCZ y la activación de la microglía, con un aumento de la densidad de la microglía en los cerebros de las SCZ, así como una mayor expresión de genes proinflamatorios27. Además, los estudios PET de cerebros humanos que utilizan radioligandos para la activación microglial muestran un aumento de los niveles de microglía activada en la corteza 25,26,27,28. Estudios recientes de asociación de genoma completo (GWAS) muestran que la asociación genética más fuerte para SCZ reside en el locus del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC), y esta asociación es el resultado de alelos de los genes del componente del complemento 4 (C4) que están involucrados en la mediación de la poda sináptica postnatal en roedores37. Esta asociación ha proporcionado apoyo adicional para la hipótesis de que la poda aberrante por microglía puede resultar en la disminución de la densidad de la espina dendrítica observada en los cerebros postmortem de SCZ. Las investigaciones de la participación microglial en la poda sináptica en SCZ se han limitado hasta ahora a estudios indirectos con imágenes PET o inferencias de investigaciones de cerebros postmortem.

Generación de microglía humana en el laboratorio
La microglía primaria de ratón cultivada se ha utilizado con frecuencia en el estudio de la microglía, aunque hay varios indicios de que la microglía de roedores puede no ser representativa de la anatomía de la microglía humana y la expresión génica (Tabla 1)38. Varios estudios también han diferenciado la microglía directamente de los monocitos sanguíneos a través de la transdiferenciación 39,40,41,42. Las células similares a la microglía derivadas de monocitos sanguíneos exhiben grandes diferencias con la microglía humana en las respuestas proinflamatorias del perfil de expresión de genes y proteínas, y parecen ser más parecidas a los macrófagos en su biología. Los avances metodológicos recientes permiten ahora la generación de microglía a partir de iPSC humanas, lo que brinda oportunidades para estudiar microglías vivas que se asemejan con mayor precisión a la biología de la microglía que se encuentra en el cerebro humano (Tabla 2). Se ha demostrado que estas células microgliales derivadas de iPSC recapitulan el fenotipo, los perfiles de expresión génica y las propiedades funcionales de la microglía humana primaria 44,45,46,47,48. Este artículo proporciona un método para el cocultivo de neuronas humanas derivadas de iPSC y microglía generadas a partir del mismo individuo con el fin de desarrollar modelos personalizados in vitro de las interacciones neurona-microglía. Para este modelo de cocultivo in vitro, se adaptó un protocolo de diferenciación microglial del grupo de Fossati (Tabla 3) y se combinó con una versión adaptada de un protocolo de generación de neuronas corticales del grupo de Livesey (Tabla 4)49,50.

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Protocolo

Las iPSC humanas utilizadas en este estudio se reprogramaron a partir de fibroblastos que se habían obtenido mediante el consentimiento informado de sujetos de control sanos, con la aprobación de la junta de revisión institucional (IRB). La reprogramación y caracterización de las iPSCs utilizadas en este estudio (ML15, ML27, ML40, ML56, ML141, ML 250, ML292) fueron descritas en un estudio previo51.

1. Mantenimiento de las iPSC

  1. Prepare una dilución 1:50 de la matriz de membrana basal del factor de crecimiento reducido sin LDEV en DMEM/F12 sin rojo fenol y recubra previamente una placa de 6 pocillos con 1 mL de la solución diluida durante al menos 2 h a 37 °C antes de descongelar las existencias de celdas.
  2. Descongele las existencias de iPSC criopreservadas en un baño de agua a 37 °C durante 2 min. Añada las células a un tubo de centrífuga de 15 mL que contenga 5 mL de DMEM/F12. Gira las celdas a 300 x g durante 5 min.
  3. Retire la solución de recubrimiento de la placa de matriz de membrana basal del factor de crecimiento reducido sin LDV prerrevestida y agregue 1 mL de medio de células madre (SCM) con 10 μM de inhibidor de rocas (Y-27632).
  4. Vuelva a suspender el pellet de celda en SCM con 10 μM Y-27632 y agregue a la placa prerrevestida para obtener un volumen final de 2 mL de SCM más Y-27632. Mantener los cultivos celulares de iPSC en este medio durante 24 h en una incubadora a 37 °C.
  5. Reemplace el medio con 2 mL de SCM fresco sin Y-27632 24 h después de la descongelación.
  6. Después de que las iPSC alcancen el 80-90% de confluencia, páselas a matraces de 75 ml recubiertos con una matriz de membrana basal de factor de crecimiento reducido sin LDEV.
    1. Pase las células enjuagándolas primero con HBSS y retírelas después de dejarlas reposar durante 30 s. Añadir 1 mL de reactivo de disociación celular no enzimática e incubar durante 4 min a 37 °C. Prepare la placa con SCM que contenga 10 μM Y-27632.
    2. Aspire el reactivo de disociación de células no enzimáticas y agregue 1 mL de SCM + 10 μM Y-27632 a cada pocillo. Raspe suavemente el pocillo con un elevador de células y obtenga células con una pipeta de 1000 μL.
    3. Deposite las células en un matraz de 75 mm con membrana basal con factor de crecimiento reducido libre de LDEV en un volumen total de 8 mL de SCM + Y-27632.

2. Diferenciación de la microglía

NOTA: En la Figura 1A se muestra un esquema que describe el protocolo de diferenciación de la microglía. Los medios se calentaron a temperatura ambiente antes de su uso.

  1. Día 0: Realizar un cambio completo del medio con medio SCM suplementado con 80 ng/mL de BMP-4. Realice cambios diarios de medio con este mismo medio durante los días 1-3, sin ningún lavado entre los cambios de medio.
  2. Día 4: Preparar el medio del día 4-5: Medio hematopoyético (HM), suplementado con 25 ng/mL de FGF, 100 ng/mL de SCF y 80 ng/mL de VEGF. Retire el medio y reemplácelo con el medio del día 4-5 que contenga 5 μM Y-27632.
    NOTA: Las células comienzan a flotar en este punto: aproximadamente la mitad de las células flotan y la otra mitad son adherentes.
  3. Día 6: Preparación Día 6-13 medio: HM suplementado con 50 ng/mL SCF, 50 ng/mL de IL-3, 5 ng/mL de TPO, 50 ng/mL de m-CSF y 50 ng/mL de Flt3-L. Recoja el sobrenadante, agréguelo a un tubo cónico de 15 mL y centrifugue durante 8 min a 300 x g. Vuelva a suspender el pellet en un matraz con 8 mL del medio Día 6-13 suplementado con 5 μM Y-27632.
  4. Día 10: Agregue 8 mL del medio del día 6-13 encima del medio existente.
  5. Día 14: Preparación Día 14+ medio: HM suplementado con 50 ng/mL m-CSF, 50 ng/mL Flt3-L, 50 ng/mL GM-CSF. Recoja el sobrenadante, añádalo a un tubo cónico de 50 ml y gire durante 8 min a 300 x g. Vuelva a suspender el pellet en 8 mL del medio del día 14+ que contenga 5 μM Y-27632 y continúe con el cultivo en este medio.
  6. Día 18: Añadir 8 mL de Day14+ medio.
  7. Día 22: Agregue 8 mL de medio fresco Day14+ sin quitar el medio existente.
  8. Día 25: Mueva las células al paso 2.9 o continúe manteniéndolo en el medio del día 14+ hasta el día 50 de diferenciación.
  9. Después del día 25, recoja el sobrenadante en un tubo cónico de 50 ml y gire durante 8 minutos a 300 x g.
    1. Preparar el medio adherente: RPMI suplementado con 1% de 200 mM de dipéptido L-alanil-L-glutamina en solución de NaCl al 0,85%, 25 ng/mL GM-SCF y 100 ng/mL IL-34.
    2. Vuelva a suspender el pellet en el medio adherente que contiene 5 μM Y-27632.
    3. Células en placa a una densidad de 50.000 células porcm2 en placas de 24 pocillos para diferentes experimentos: placas recubiertas de matriz de membrana basal con factor de crecimiento reducido sin LDEV para monocultivo microglial, placas de imagen de poli-L-ornitina de 10 μg/mL y placas de vidrio recubiertas de laminina de 10 μg/mL para experimentos de imagen.
    4. Diluya la poli-L-ornitina y la laminina en DPBS y agregue 250 μL/pocillo para obtener una placa de imagen de 24 pocillos.
      NOTA: Las células en cultivo ahora son adherentes en la naturaleza (Figura 1C).
  10. Mantener las células en cultivo durante al menos 14 días, con cambios de medio quincenales. Después del día 14 después de la adherencia, las células han alcanzado la maduración y pueden usarse para experimentos.

3. Diferenciación de neuronas corticales

NOTA: En la Figura 1G se muestra un esquema que describe el protocolo de diferenciación de las neuronas corticales.

  1. Día 0:
    1. Una vez que las iPSC confluyan en las placas recubiertas de matriz de membrana basal con factor de crecimiento reducido sin LDEV, cambie de SCM a una mezcla 50/50 de medio N2/B27 suplementado con 10 μM de SB431542, 1 μM de dorsomorfina, 100 nM LDN193189.
      NOTA: El medio N2 consiste en medio basal suplementado con un 1% de suplemento de N-2, un 1% de 200 mM de L-alanil-L-glutamina dipéptido en una solución de NaCl al 0,85%, pluma/estreptococo al 1%. El medio B27 consiste en DMEM/F12 suplementado con un 2% de suplemento de B-27, un 1% de 200 mM de dipéptido de L-alanil-L-glutamina en una solución de NaCl al 0,85%, pluma/estreptococo al 1%.
    2. Cambie el medio con los suplementos anteriores agregados diariamente durante 7 días.
  2. Día 7:
    1. Pre-recapa las placas en matriz de membrana basal de factor de crecimiento reducido sin LDEV durante al menos 2 h.
    2. Pase las celdas 1:1 a placas prerrevestidas. Enjuague las células con HBSS de 1 mL/pocillo y retírelas después de dejarlas reposar durante 30 s. Añadir 1 mL/pocillo de medio de desprendimiento de células (por ejemplo, Accutase) e incubar durante 4-5 min a 37 °C. Durante la incubación, prepare tubos cónicos de 15 mL con 5 mL de DMEM.
    3. Pipetea suavemente el agente de disociación enzimática para eliminar las células de la placa con una pipeta P1000. Recoja el agente de disociación enzimática y la mezcla celular en el tubo cónico de 15 mL que contiene 5 mL de DMEM.
    4. Centrifugar los tubos durante 5 min a 300 x g. Vuelva a suspender el pellet en 1 mL de medio N2/B27 que contenga 10 μM Y-27632. Continúe la alimentación diaria con el medio N2/B27 sin ningún suplemento.
  3. Día 12: Pase las celdas 1:1 utilizando los métodos descritos en 3.2.2. Continúe con la alimentación diaria con el medio N2/B27.
  4. Día 15/16: Pase las celdas 1:2 utilizando los métodos descritos en 3.2.2. Continúe con la alimentación diaria con el medio N2/B27.
  5. Día 18/19: Paso de las celdas 1:3 utilizando los métodos descritos en 3.2.2. Continúe la alimentación diaria con medio N2/B27 hasta el día 25.
  6. Día 25: Alimentar las células con medio N2/B27 suplementado con 10 μM de DAPT.
  7. Día 28: Alimente las células con medio N2/B27 fresco y sin tratar.
  8. Día 30: Pasar las células utilizando los métodos descritos en el punto 3.2 a las placas de cultivo de microglía y mantenerlas en medio BrainPhys suplementado con un suplemento de B-27 al 1%.

4. Cocultivos de microglía/neurona

  1. Placa Día 30 neuronas corticales sobre cultivos microgliales a una densidad de 50.000 células porcm2. Suplementar el medio con laminina 1 μg/mL para mejorar la adherencia celular.
  2. Mantener los cultivos en una mezcla de 50% de medio adherente y 50% de medio Brainohys suplementado con 1% de suplemento de B-27. Realizar cambio de medio medio quincenal hasta la experimentación.
  3. Realiza experimentos después de que las neuronas alcancen el día 60.

5. Tratamiento con γ de interferón

  1. Prepare un medio fresco suplementado con 100 ng/mL de IFN-γ. Añadimos el medio y dejamos incubar durante 24 h. Retire el medio y proceda a la experimentación.

6. Inmunocitoquímica

  1. Fije las células en la placa de cultivo con 100 μL de paraformaldehído al 4% a temperatura ambiente durante 20 min.
  2. Enjuague las células en 1 mL de PBS tres veces durante 5 minutos cada una.
  3. Agregue 1 mL de PBST (PBS + 0.1% Triton X) durante 10 min.
  4. Añadir tampón bloqueante: 1 mL de PBS más un 5% de suero de cabra durante 1 h.
  5. Añadir anticuerpo primario diluido en 100 μL de PBS + 1% de suero de cabra - toda la noche a 4 °C. Optimice todos los anticuerpos primarios en consecuencia.
  6. Enjuague las células en 1 mL de PBS tres veces durante 5 minutos cada una.
  7. Añadir anticuerpo secundario, diluido en 100 μL de PBS más suero de cabra al 1%, durante 1 h a temperatura ambiente.

7. Análisis de la columna vertebral

  1. Obtenga imágenes en un microscopio confocal con un aumento de 60x.
  2. Utilice la función ImageJNeuronJ 52 para analizar imágenes.
  3. Obtenga mediciones de la longitud de las neuritas, la longitud de la columna vertebral y el recuento de la columna vertebral a través de NeuronJ.

8. Imágenes de calcio

  1. Prepare un medio fresco con 3 μM de colorante Fluo-4AM. Incubar los cocultivos en este medio durante 30 min a 37 °C. A continuación, enjuague las células con PBS, añada una solución de imágenes de células vivas a las células y proceda a la obtención de imágenes.
  2. Utilizando un microscopio confocal equipado para la obtención de imágenes de células vivas, obtenga imágenes de lapso de tiempo a 40x durante 2 minutos. La actividad se puede registrar al inicio, con exposición a 15 mM de glutamato, o en el ajuste de despolarización con 5 mM de cloruro de potasio.
  3. Con ImageJ, mida la intensidad de la fluorescencia a lo largo del tiempo para cuerpos celulares individuales. Con la herramienta de selección, seleccione la región de interés (ROI) individual que rodea cada cuerpo de celda. Abra el Administrador de ROI y presione Agregar para seleccionar. Continúe agregando nuevas selecciones al administrador de ROI.
  4. Utilice la herramienta Establecer medidas para medir el área gris media. Cuando se haya agregado el número de cuerpos de celda deseados al administrador de ROI, selecciónelos todos y luego use la herramienta Multi-Measure . Esto proporcionará una lectura del área gris media para cada uno a lo largo del tiempo del archivo de video. Los datos exportados darán la intensidad de fluorescencia media para la región de interés para cada fotograma.
  5. Determine la relación de intensidad de fluorescencia, F/F0, donde F es la intensidad de fluorescencia en un momento dado y F0 es la intensidad de fluorescencia inicial. F/F0 se puede graficar a lo largo del tiempo para examinar la actividad espontánea en las neuronas o examinarse a la máxima intensidad fluorescente en el entorno de la estimulación.

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Resultados

Validación de protocolo
La microglía derivada de iPSC se generó a partir de siete líneas de iPSC en tres rondas diferentes de diferenciación. Se utilizaron las líneas de iPSC de control ML27, ML56, ML292 y ML364 y las líneas de iPSC para esquizofrenia ML40, ML141 y ML250. La caracterización de estas líneas de iPSC ha sido descrita previamente51. Estas microglías derivadas de iPSC se validaron mediante ICC y qPCR. La microglía generada a partir del protocolo adaptado exhibió una...

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Discusión

El desarrollo de métodos de diferenciación a lo largo de diferentes trayectorias para las células madre pluripotentes ha abierto muchas vías para la investigación de la función cerebral y los procesos de enfermedad 53,54,55. Los estudios iniciales se habían centrado en el desarrollo de tipos específicos de células neuronales que se hipotetizaba que eran importantes en trastornos cerebrales espec...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por un Premio de Investigación Bioconductual del Instituto Nacional de Salud Mental para Nuevos Científicos Innovadores (BRAINS) R01MH113858 (a R.K.), el Premio al Desarrollo de Científicos Clínicos del Instituto Nacional de Salud Mental K08MH086846 (a R.K.), el Premio al Desarrollo de Científicos Clínicos de la Fundación Benéfica Doris Duke (a R.K.), la Fundación Bipolar Ryan Licht Sang (a R.K.), la Fundación de la Familia Jeanne Marie Lee-Osterhaus y el Premio NARSAD al Investigador Joven de la Fundación de Investigación del Cerebro y el Comportamiento (a A.K.), la Fundación Phyllis y Jerome Lyle Rappaport (a R.K.), el Instituto de Células Madre de Harvard (a R.K.) y por Steve Willis y Elissa Freud (a R.K.). Nos gustaría agradecer al Dr. Bruce M. Cohen y a la Dra. Donna McPhie de la Facultad de Medicina de Harvard y el Hospital McLean por proporcionarnos los fibroblastos utilizados en el estudio.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
AccutaseSigma-AldrichA6964
B-27 suplementoGibco17504044
b-FGFPeprotech100-18B
BMP-4Peprotech120-05ET
BrainphysStemCell Technologies5790
CD11C anticuerpo Biolegend337207Dilución 1:200
Placas de cultivo celular de fondo plano CostarCorning07-200-83
Anticuerpo Ctip2Abcamab18465
Anticuerpo monoclonal CUTL1AbnovaH00001523-M01
DMEM/F-12, sin rojo fenolGibco21041025
dorsomorfinaSigma-AldrichP5499
DPBS, sin calcio, sin magnesioGibco14190144
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Sigma-AldrichD6421
EasYFlask Matraces de cultivo celularNunc156499
Fisherbrand Cell LiftersFisher Scientific08-100-240
Flt3-LigandPeprotech300-19
Fluo4-AMLife TechnologiesF-14201
Geltrex LDEV Free RGF BME 1 MLThermoFisher ScientificA1413201
GlutamaxThermoFisher Scientific35050061
GM-CSFPeprotech300-03
Cabra Anti Pollo- IgG H& L (Alexa Fluor 488)Abcamab150169Dilución 1:1000
Cabra Anti ratón- IgG H& L (Alexa Fluor 568)InvitrogenA-11004Dilución 1:1000
Cabra Anti Ratas- IgG H& L (Alexa Fluor 405)Abcamab175670Dilución 1:1000
Cabra Anti-cobaya IgG H& L (Alexa Fluor 405)Abcamab175678Dilución 1:1000
Suero de cabraSigma-AldrichG9023
HBSSInvitrogen14170120
anticuerpo IBA1Abcamab5076Dilución 1:500
IL-34Peprotech200-34
INF-yPeprotech300-02
KiCqStart Imprimaciones verdes SYBRSigma-AldrichKSPQ12012
LamininaSigma-AldrichL2020
LDN193189Sigma-AldrichSML0599
imagen de células vivasInvitrogenA14291DJ
MAP2 anticuerpo SynapticSystems188 004
M-CSFPeprotech300-25
Suplemento N-2Gibco17502001
Medio neurobasalLife Technologies21103049
NutriStem hPSC XF MedioBiological Industries01-0005
P2RY12 anticuerpoBiolegend848002
Paraformaldehído 16%Fisher Scientific50-980-488
Penicilina-estreptomicinaGibco15140122
Poly-L-OrdininaSigma-AldrichP3655
SATB2 anticuerpoAbcamab51502
SB431542 Sigma-AldrichS4317
SCFStemcell Technologies78062
SensoPlate 24-Pocillos Placa con fondo de vidrioGreiner-Bio662892
VástagoPro-34 SFM (1X)Gibco10639011
TMEM119 anticuerpoAbcamab185333Dilución 1:1000
TPOPeprotech300-18
Triton-XSigma-Aldrich9002-93-1
VEGFPeprotech100-20
VerseneThermoFisher Scientific15040066
Y-27632 diclorhidrato (inhibidor de ROCK)Tocris1254
solución de

Referencias

  1. Lenz, K. M., Nelson, L. H. Microglia and beyond: Innate immune cells as regulators of brain development and behavioral function. Frontiers in Immunology. 9, 698(2018).
  2. Hoshiko, M., Arnoux, I., Avignone, E., Yamamoto, N., Audinat, E. Deficiency of the microglial receptor CX3CR1 impairs postnatal functional development of thalamocortical synapses in the barrel cortex. Journal of Neuroscience. 32 (43), 15106-15111 (2012).
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