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Artículo de método

Detección de anticuerpos neutralizantes del SARS-CoV-2 mediante imágenes fluorescentes de alto rendimiento de la infección por pseudovirus

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DOI:

10.3791/62486

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5 de junio de 2021

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1Ottawa Hospital Research Institute, 2Department of Biochemistry, Microbiology and Immunology, University of Ottawa

En este artículo

Resumen

El protocolo descrito aquí describe un método rápido y efectivo para medir anticuerpos neutralizantes contra la proteína espiga del SARS-CoV-2 mediante la evaluación de la capacidad de las muestras de suero convaleciente para inhibir la infección por un virus de estomatitis vesicular marcada con proteína verde fluorescente mejorada pseudotipado con glicoproteína espiga.

Resumen

A medida que la pandemia de COVID-19 causada por el coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV-2) continúa evolucionando, se ha hecho evidente que la presencia de anticuerpos neutralizantes contra el virus puede proporcionar protección contra futuras infecciones. Por lo tanto, a medida que la creación y traducción de vacunas efectivas contra la COVID-19 continúe a una velocidad sin precedentes, el desarrollo de métodos rápidos y efectivos para medir los anticuerpos neutralizantes contra el SARS-CoV-2 será cada vez más importante para determinar la protección a largo plazo contra la infección tanto para las personas previamente infectadas como para las inmunizadas. Este artículo describe un protocolo de alto rendimiento que utiliza el virus de la estomatitis vesicular (VSV) pseudotipado con la proteína espiga del SARS-CoV-2 para medir la presencia de anticuerpos neutralizantes en el suero convaleciente de pacientes que se han recuperado recientemente de COVID-19. El uso de un virus pseudotipado replicante elimina la necesidad de una instalación de contención de nivel 3 requerida para el manejo del SARS-CoV-2, lo que hace que este protocolo sea accesible para prácticamente cualquier laboratorio de contención de nivel 2. El uso de un formato de 96 pozos permite ejecutar muchas muestras al mismo tiempo con un corto tiempo de respuesta de 24 h.

Introducción

En diciembre de 2019, se identificó un nuevo coronavirus, que ahora conocemos como SARS-CoV-2, el agente causal de la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19)1. El SARS-CoV-2 es un betacoronavirus perteneciente a la familia Coronaviridae. Estos virus envueltos comprenden un gran genoma de ARN de sentido positivo y son responsables de infecciones respiratorias e intestinales tanto en humanos como en animales2. Hasta mayo de 2021 se han reportado más de 157 millones de casos de COVID-19 en todo el mundo y más de 3.2 millones de muertes3. El desarrollo de una vacuna eficaz se ha convertido en el objetivo principal de los investigadores de todo el mundo con al menos 77 vacunas preclínicas bajo investigación y 90 actualmente en fase de ensayos clínicos4.

Los coronavirus codifican cuatro proteínas estructurales, incluida la proteína espiga (S), la nucleocápside (N), la proteína de la envoltura (E) y la proteína de membrana (M). La entrada del SARS-CoV-2 requiere la interacción del dominio de unión al receptor (RBD) de S con el receptor del huésped, la enzima convertidor de angiotensina humana 2 (hACE2) y la posterior fusión de la membrana después de la escisión proteolítica por la serina proteasa celular del huésped, la serina serina 2 de la proteasa transmembrana (TMPRSS2)5,6,7,8,9,10 . La inmunodominancia humoral de la proteína S del SARS-CoV se ha informado previamente y ahora se ha demostrado también para el SARS-CoV-211,12,13. De hecho, se han detectado respuestas de anticuerpos neutralizantes contra S en suero convaleciente de pacientes con SARS-CoV 24 meses después de la infección14,destacando su papel crítico en la respuesta inmune a largo plazo. La proteína S ha sido identificada como un objetivo prometedor de la vacuna y, por lo tanto, se ha convertido en un componente clave de la mayoría de las vacunas en desarrollo15,16.

Si bien la detección rápida de anticuerpos neutralizantes es un aspecto crítico del desarrollo de vacunas, también puede arrojar luz sobre la tasa de infección y la vigilancia seroepidemiológica en las áreas afectadas17. Whelan y sus compañeros de trabajodonaronamablemente un vsV de tipo salvaje pseudotipado con la glicoproteína SARS-CoV-2 S, en lugar de la glicoproteína VSV de tipo salvaje, para estudiar la infección por SARS-CoV-2 en entornos de nivel 2 de bioseguridad 2. El pico de expresión de VSV (VSV-S) se utilizará para determinar la respuesta de anticuerpos neutralizantes contra la proteína espiga del SARS-CoV-2. Como el VSV-S utilizado aquí también expresa proteína fluorescente verde mejorada (eGFP), los focos de eGFP pueden detectarse dentro de las 24 h para cuantificar la infección, mientras que la formación de placa puede tardar de 48 a 72 h. Aquí se resume un protocolo simple y efectivo para determinar la capacidad del suero del paciente convaleciente para neutralizar la infección por VSV-S-eGFP. Este método también se puede adaptar fácilmente para interrogar otras terapias potenciales que tienen como objetivo interrumpir la interacción huésped-viral de la proteína SARS-CoV-2 S.

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Protocolo

1. Células de recubrimiento (Día 1) para la producción y cuantificación del pseudovirus SARS-CoV-2

  1. Preparación para el cultivo de tejidos
    1. Solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Warm 1x Dulbecco; El Medio Águila Modificada (DMEM) de Dulbecco que contiene 10% de Suero Fetal Bovino (FBS) y 1% de penicilina/estreptomicina (opcional); y ácido tetraacético de tripsina-etilendiamina (EDTA) al 0,25% a 37 °C en un baño de agua durante aproximadamente 15 min.
    2. Desinfecte una campana de cultivo de tejidos con etanol al 70% y coloque platos de cultivo de tejidos, pipetas Pasteur y pipetas serológicas en la campana de cultivo de tejidos según sea necesario. Retire pbS, DMEM y tripsina del baño de agua y desinfecte con etanol al 70% antes de colocarlo en la campana de cultivo de tejidos.
  2. Recubrimiento y mantenimiento de las células
    1. Cultivar células Vero E6 en DMEM (que contiene 10% de FBS) en matraces de cultivo de tejidos T75 o platos de cultivo de tejidos de 15 cm en una incubadora de 37 °C con 5% de CO2. Pase las células según sea necesario cuando las células son 80-90% confluentes.
    2. Lave las células agregando 10 ml de 1x PBS a cada plato y balanceando suavemente 4-5 veces; aspirar el PBS. Agregue 3 ml de tripsina-EDTA a cada plato, mece el plato para asegurarse de que toda la superficie esté cubierta. Incubar las células a 37 °C con un 5% de CO2 durante aproximadamente 5 min, o hasta que las células se hayan desprendido.
    3. Agregue 7 ml de DMEM (que contiene 10% de FBS) para desactivar la tripsina y resuspenda las células canalizando hacia arriba y hacia abajo varias veces. Gire hacia abajo las células para eliminar la tripsina usando una centrífuga de sobremesa a 500 × g durante 5 min, aspire el medio sin perturbar el gránulo celular y resuspante las células en 10 ml de DMEM (que contiene 10% de FBS). Si se requieren células para futuros experimentos, coloque 1 ml en un plato nuevo que contenga 15 ml de DMEM fresco (que contenga 10% de FBS).
    4. Cuente las células utilizando un contador celular automatizado o hemocitómetro, y agregue aproximadamente 1 × 107 células a cada placa de 15 cm, e incube a 37 ° C con 5% de CO2 hasta que sean 100% confluentes (1-2 días).

2. Preparación del pseudovirus VSV-S-EGFP

  1. Infección
    1. Infectar células a multiplicidad de infección (MOI) 0.01 con virus de stock VSV-S-eGFP en 12 ml de DMEM libre de suero durante 1 h a 37 ° C con 5% de CO2, ocasionalmente balanceando las placas. Reemplace el inóculo con DMEM fresco (que contiene 2% fbs y 20 mM HEPES, pH 7.7), y pase a una incubadora configurada a 34 ° C con 5% de CO2.
      NOTA: Se requiere una temperatura de 34 °C para la propagación de VSV-S-eGFP en cultivo celular.
    2. Recolectar sobrenadantes celulares tras la observación de efecto citopático extenso (CPE) y desprendimiento celular, aproximadamente 48 h después de la infección. Utilice un microscopio fluorescente para visualizar la expresión extensa de eGFP por las células infectadas a partir de las 24 horas posteriores a la infección.
  2. Colección
    1. Centrifugar los sobrenadantes utilizando una centrífuga de sobremesa durante 5 min a 1.000 × g a 4 °C para eliminar los restos de la celda. Alícuota el sobrenadante para evitar múltiples ciclos de congelación-descongelación, y guárdalo a -80 °C.

3. Titulación del pseudovirus VSV-S-eGFP

  1. Dilución en serie para determinar el título viral
    1. Placa Vero E6 células en placas de 6 pozos a una densidad de siembra de 6 × 105 células por pozo en DMEM (con 10% FBS), e incuban durante la noche a 37 °C con 5% co2.
      NOTA: También se pueden utilizar células Vero que sobreexpresan TMPRSS2 y hACE2.
    2. Configure una serie de dilución en serie de 10 veces del virus VSV-S-eGFP en DMEM sin suero frío colocando 900 μL de medios en siete tubos de microcentrífuga. Etiquete los tubos del 1 al 7. Agregue 100 μL de la culata viral al primer tubo y vórtice brevemente. Transferir 100 μL de virus diluido del tubo 1 al tubo 2 y vórtice brevemente; continuar hasta el tubo 7.
    3. Aspire el medio de todos los pozos de la placa de 6 pozos que contiene células Vero E6, y reemplace con 500 μL de diluciones de 10-2 a 10-7. Incubar las placas durante 45 min a 37 °C con 5% de CO2,balanceando suavemente cada 15 min.
    4. Aspirar el inóculo y reemplazar con una superposición que contenga una mezcla 1: 1 de 2x DMEM y 6% de carboximetilcelulosa (CMC), concentración final de 3% cmC, complementada con 10% fbS; incubar a 34 °C con 5% de CO2 durante 48 h.
      NOTA: Precalente la mezcla superpuesta en un baño de agua a 37 °C durante 15 minutos durante la etapa de infección. Se puede usar una mezcla 1: 1 de agarosa al 1% con 2x DMEM suplementado con 10% fbS en lugar de CMC. Para superponer con agarosa, hierva agarosa al 1% (en dH2O) y mezcle con 2x DMEM frío. Asegúrese de que la mezcla esté a una temperatura adecuada antes de agregarla a la monocapa de celda (aproximadamente 37-40 °C). Si se utiliza agarosa para la superposición, las células deben fijarse incubando en 2 ml de metanol 3:1:ácido acético durante al menos una hora antes de la tinción.
  2. Tinción y cálculo del título viral
    1. Visualizar placas mediante tinción con cristal violeta o visualización directa de eGFP bajo un microscopio fluorescente.
    2. Para teñir las placas, aspire la superposición, lave una vez con PBS, luego agregue 2 ml de violeta cristalina al 0.1% (en 80% de metanol y dH2O) a cada pozo. Coloque en un balancín de placa durante aproximadamente 20 minutos a temperatura ambiente antes de desmancharse. Retire el cristal violeta y lave suavemente cada pozo dos veces con dH2O o PBS.
      NOTA: Los pasos de lavado y tinción deben realizarse suavemente mediante pipeteos lentamente hacia el lado de cada pozo para garantizar que la monocapa celular permanezca intacta durante todo el procedimiento.
    3. Deje que las placas se sequen durante al menos 1 h antes de contar las placas. Asegúrese de que los recuentos de placas se obtengan de pozos que contengan de 20 a 200 placas. Para calcular el título del virus en unidades formadoras de placa (UFCP) por ml, multiplique el factor de dilución del pozo contado con el volumen de infección y divida este número de las placas presentes en el pozo respectivo.
      figure-protocol-1

4. Células de recubrimiento (Día 1) para la medición de la neutralización del pseudovirus SARS-CoV-2 por anticuerpos disponibles comercialmente y suero de paciente convaleciente

  1. Preparación para el cultivo de tejidos
    1. Preparar el medio y la campana de cultivo de tejidos como se describe en la sección 1. Además, prepare el número necesario de 96 placas de pozo para acomodar un mínimo de 2 réplicas por muestra (es decir, 1 placa por 6 muestras); agregue réplicas adicionales si el volumen de muestra lo permite.
  2. Recubrimiento y mantenimiento de las células
    1. Cultivar y mantener las células Vero E6 como se describe en la sección 1. Preparar al menos 10 ml de suspensión celular por placa de 96 pozos a una concentración de 2 × 105 células por ml (placa 1,5 × 105 células por ml para ensayos realizados después de 48 h, si es necesario). Añadir 100 μL de suspensión celular a cada pozo de una placa de 96 pozos utilizando una pipeta multicanal, e incubar durante 24 h a 37 °C con un 5% de CO2.
      NOTA: Mezcle bien la suspensión celular y meca cada placa suavemente en todas las direcciones para garantizar una distribución uniforme de las células.

5. Diluciones e infecciones por anticuerpos o suero (Día 2)

NOTA: Este protocolo se puede aplicar para medir la neutralización de VSV-S-eGFP tanto por anticuerpos disponibles comercialmente como por suero de paciente, así como suero recolectado de animales para estudios preclínicos de desarrollo de vacunas. *Tome nota de los pasos adicionales enumerados al manipular muestras de suero de pacientes / animales.

  1. Serie de dilución en serie
    1. Antes de diluir las muestras de suero, inactivar térmicamente cada muestra en un baño de agua a 56 °C durante 30 min para inactivar el complemento. Garantizar que se tomen las precauciones de seguridad necesarias al manipular muestras de pacientes; solo abra los recipientes de muestra cuando esté en la campana de cultivo de tejidos y asegúrese de que se use el equipo de protección personal de nivel 2 de contención adecuado.
    2. Configure la serie de dilución en una placa vacía de 96 pozos (Placa 1).
    3. Comience todas las diluciones en la fila A de la placa de 96 púas en 80 μL. *Para muestras de pacientes, comience la serie de dilución en 1 en 10 colocando 8 μL de suero en 72 μL de DMEM sin suero (con 1% de penicilina / estreptomicina).
      NOTA: La concentración de anticuerpos neutralizantes utilizada dependerá de la actividad predicha por el fabricante. Para el anticuerpo neutralizante del pico del SARS-CoV-2 utilizado aquí (consulte la Tabla de materiales),comience con 5 μg / ml para observar al menos un 50% de neutralización.
    4. Añadir 40 μL de DMEM sin suero (con penicilina/estreptomicina al 1%) a las filas B a G, y 80 μL a la fila H. No agregue virus a la fila H, ya que sirve como un control solo para células.
    5. Usando una pipeta multicanal de 12 quibulos, mezcle y transfiera 40 μL de suero o anticuerpo diluido de la fila A a la fila B. Mezcle y repita hasta la fila F, deseche 40 μL de la fila F. No agregue suero a la fila G, ya que representa la fila de control solo para virus.
  2. Infección y superposición
    1. Prepare un volumen apropiado de VSV-S-eGFP diluido para tratar cada pozo a MOI 0.05 (o 2000 pfu). (Al completar este cálculo, tenga en cuenta que solo 60 μL del volumen total de 80 μL se moverán a las células; por lo tanto, asegúrese de multiplicar el volumen del virus por 1.33 para mantener 2000 pfu).
      NOTA: Como VSV-S-eGFP es sensible a la temperatura, asegúrese de que las existencias virales permanezcan en hielo siempre que no estén en uso y evite múltiples ciclos de congelación-descongelación, ya que los títulos diferirán después de la congelación repetida.
    2. Agregue 40 μL de virus diluido a cada pozo en las filas A a G de la placa 1 y mezcle mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo 4-5 veces. Incubar la placa durante 1 h a 37 °C con 5% de CO2.
    3. Retire la placa que contiene las células de la incubadora (Placa 2) y aspire cuidadosamente los medios de todos los pozos. Transfiera 60 μL de mezcla de anticuerpos/virus de la Placa 1 a la Placa 2, e incube durante 1 h a 37 °C con 5% de CO2,balanceando la placa cada 20 min.
    4. Rellene cada pozo con 140 μL de superposición que contenga CMC en DMEM para una concentración final de 3% de CMC (con 10% de FBS y 1% de penicilina/estreptomicina). Coloque la placa 2 en una incubadora a 34 °C con un 5% de CO2 durante aproximadamente 24 horas antes de la obtención de imágenes.
      NOTA: Precalente la mezcla superpuesta en un baño de agua a 37 °C durante 15 minutos durante la etapa de infección.

6. Imagen y cuantificación (Día 3)

  1. Placas de imagen que utilizan un imager fluorescente automatizado (utilizando un filtro de isotiocianato de fluoresceína (FITC) o un filtro alternativo con una longitud de onda de excitación de 488 nm). Cuantificar la infección viral mediante la creación de un protocolo que identifica y cuenta automáticamente los focos individuales de eGFP. Si no hay disponible una función de conteo automático, utilice el software ImageJ para cuantificar el número de focos de eGFP.

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Resultados

Este protocolo describe un método rápido y eficaz para detectar anticuerpos neutralizantes contra la proteína SARS-CoV-2 S a través de la inhibición de la infección por pseudovirus VSV-S-eGFP (cuantificable por la pérdida de focos de eGFP detectada). Una representación esquemática del protocolo se representa en la Figura 1. Se recomienda que se utilice un anticuerpo disponible comercialmente como control positivo cada vez que se ejecute el ensayo para garantizar la consistencia del ensayo. A...

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Discusión

El método descrito aquí puede adaptarse para adaptarse a diferentes entornos y recursos de laboratorio según sea necesario. Es importante destacar que la principal limitación de este protocolo es la necesidad de un espacio de contención de nivel 2 y una campana de cultivo de tejidos. La aplicación de un virus de ARN replicante pseudotipado con el pico del SARS-CoV-2, como el VSV-S-eGFP, es una alternativa formidable al virus SARS-CoV-2, que requiere un área de trabajo de nivel 3 de contención, pero puede seguir siendo un...

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Divulgaciones

Los autores no tienen intereses financieros contrapuestos relacionados con esta publicación.

Agradecimientos

Nos gustaría agradecer al laboratorio Whelan por proporcionar generosamente el virus VSV-S-eGFP utilizado en este protocolo (descrito en Case et al. 2020). También agradecemos a los dres. Bill Cameron y Juthaporn Cowan (y al equipo) por recolectar las muestras de sangre del paciente (ID de protocolo REB 20200371-01H). Los autores revelan la recepción del siguiente apoyo financiero para la investigación, autoría y / o publicación de este artículo: Este trabajo fue financiado por el generoso apoyo de la Fundación del Hospital de Ottawa y una subvención de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (# 448323) y una subvención rápida de la Fundación Thistledown para la Ciencia COVID-19 a C.S.I. T.R.J. está financiada por una beca de posgrado de Ontario y una beca Mitacs del clúster. JP está financiado por una beca Mitacs del clúster. T.A. está financiado por una beca de banting del CIHR. También nos gustaría agradecer a todas las personas que participaron y donaron sus muestras de sangre para este estudio.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0,25% tripsina-EDTA (Gibco)Fisher scientificLS25200114
ArrayScan VTI HCSThermo Fisher ScientificGenerador de imágenes fluorescente automatizado
carboximetilcelulosaSigmaC5678
Águila modificada de Dulbecco Medio (Gibco)Fisher scientific10-013-CV
Águila modificada de Dulbecco's medio (Polvo) (Gibco)Thermo Fisher Scientific12-800-017
Dulbecco' s Solución salina tamponada con fosfato (DPBS)Fisher scientific21-031-CV
HEPESFisher scientificBP-310-500
IgG Isotype Control (ratón)Thermo Fisher Scientific31903
Penicilina/estreptomicinaThermo Fisher Scientific15070063
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Anticuerpo neutralizante de pico, ratón MabSinoBiológico40592-MM57
Celdas Vero E6ATCC  CRL-1586

Referencias

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