Artículo de método

Detección de anticuerpos neutralizantes del SARS-CoV-2 mediante imágenes fluorescentes de alto rendimiento de la infección por pseudovirus

DOI:

10.3791/62486

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5 de junio de 2021

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1Ottawa Hospital Research Institute, 2Department of Biochemistry, Microbiology and Immunology, University of Ottawa

En este artículo

Resumen

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El protocolo descrito aquí describe un método rápido y efectivo para medir anticuerpos neutralizantes contra la proteína espiga del SARS-CoV-2 mediante la evaluación de la capacidad de las muestras de suero convaleciente para inhibir la infección por un virus de estomatitis vesicular marcada con proteína verde fluorescente mejorada pseudotipado con glicoproteína espiga.

Resumen

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A medida que la pandemia de COVID-19 causada por el coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV-2) continúa evolucionando, se ha hecho evidente que la presencia de anticuerpos neutralizantes contra el virus puede proporcionar protección contra futuras infecciones. Por lo tanto, a medida que la creación y traducción de vacunas efectivas contra la COVID-19 continúe a una velocidad sin precedentes, el desarrollo de métodos rápidos y efectivos para medir los anticuerpos neutralizantes contra el SARS-CoV-2 será cada vez más importante para determinar la protección a largo plazo contra la infección tanto para las personas previamente infectadas como para las inmunizadas. Este artículo describe un protocolo de alto rendimiento que utiliza el virus de la estomatitis vesicular (VSV) pseudotipado con la proteína espiga del SARS-CoV-2 para medir la presencia de anticuerpos neutralizantes en el suero convaleciente de pacientes que se han recuperado recientemente de COVID-19. El uso de un virus pseudotipado replicante elimina la necesidad de una instalación de contención de nivel 3 requerida para el manejo del SARS-CoV-2, lo que hace que este protocolo sea accesible para prácticamente cualquier laboratorio de contención de nivel 2. El uso de un formato de 96 pozos permite ejecutar muchas muestras al mismo tiempo con un corto tiempo de respuesta de 24 h.

Introducción

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En diciembre de 2019, se identificó un nuevo coronavirus, que ahora conocemos como SARS-CoV-2, el agente causal de la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19)1. El SARS-CoV-2 es un betacoronavirus perteneciente a la familia Coronaviridae. Estos virus envueltos comprenden un gran genoma de ARN de sentido positivo y son responsables de infecciones respiratorias e intestinales tanto en humanos como en animales2. Hasta mayo de 2021 se han reportado más de 157 millones de casos de COVID-19 en todo el mundo y más de 3.2 millones de muertes3. El desarrollo de una vacuna eficaz se ha convertido....

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Protocolo

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1. Células de recubrimiento (Día 1) para la producción y cuantificación del pseudovirus SARS-CoV-2

  1. Preparación para el cultivo de tejidos
    1. Solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Warm 1x Dulbecco; El Medio Águila Modificada (DMEM) de Dulbecco que contiene 10% de Suero Fetal Bovino (FBS) y 1% de penicilina/estreptomicina (opcional); y ácido tetraacético de tripsina-etilendiamina (EDTA) al 0,25% a 37 °C en un baño de agua durante aproximadamente 15 min.
    2. Desinfecte una campana de cultivo de tejidos con etanol al 70% y coloque platos de cultivo de tejidos, pipetas Pasteur y pipetas serológicas en la campana de cultivo de tejidos según s....

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Resultados

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Este protocolo describe un método rápido y eficaz para detectar anticuerpos neutralizantes contra la proteína SARS-CoV-2 S a través de la inhibición de la infección por pseudovirus VSV-S-eGFP (cuantificable por la pérdida de focos de eGFP detectada). Una representación esquemática del protocolo se representa en la Figura 1. Se recomienda que se utilice un anticuerpo disponible comercialmente como control positivo cada vez que se ejecute el ensayo para garantizar la consistencia del ensayo. A.......

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Discusión

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El método descrito aquí puede adaptarse para adaptarse a diferentes entornos y recursos de laboratorio según sea necesario. Es importante destacar que la principal limitación de este protocolo es la necesidad de un espacio de contención de nivel 2 y una campana de cultivo de tejidos. La aplicación de un virus de ARN replicante pseudotipado con el pico del SARS-CoV-2, como el VSV-S-eGFP, es una alternativa formidable al virus SARS-CoV-2, que requiere un área de trabajo de nivel 3 de contención, pero puede seguir siendo un.......

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Divulgaciones

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Los autores no tienen intereses financieros contrapuestos relacionados con esta publicación.

Agradecimientos

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Nos gustaría agradecer al laboratorio Whelan por proporcionar generosamente el virus VSV-S-eGFP utilizado en este protocolo (descrito en Case et al. 2020). También agradecemos a los dres. Bill Cameron y Juthaporn Cowan (y al equipo) por recolectar las muestras de sangre del paciente (ID de protocolo REB 20200371-01H). Los autores revelan la recepción del siguiente apoyo financiero para la investigación, autoría y / o publicación de este artículo: Este trabajo fue financiado por el generoso apoyo de la Fundación del Hospital de Ottawa y una subvención de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (# 448323) y una subvención rápida de la Fundación Thi....

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0,25% tripsina-EDTA (Gibco)Fisher scientificLS25200114
ArrayScan VTI HCSThermo Fisher ScientificGenerador de imágenes fluorescente automatizado
carboximetilcelulosaSigmaC5678
Águila modificada de Dulbecco Medio (Gibco)Fisher scientific10-013-CV
Águila modificada de Dulbecco's medio (Polvo) (Gibco)Thermo Fisher Scientific12-800-017
Dulbecco' s Solución salina tamponada con fosfato (DPBS)Fisher scientific21-031-CV
HEPESFisher scientificBP-310-500
IgG Isotype Control (ratón)Thermo Fisher Scientific31903
Penicilina/estreptomicinaThermo Fisher Scientific15070063
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Anticuerpo neutralizante de pico, ratón MabSinoBiológico40592-MM57
Celdas Vero E6ATCC  CRL-1586

Referencias

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  1. Hu, B., Guo, H., Zhou, P., Shi, Z. L. Characteristics of SARS-CoV-2 and COVID-19. Nature Reviews Microbiology. 19 (3), 141-154 (2021).
  2. Burrell, C. J., Howard, C. R., Murphy, F. A. Coronaviruses. Fenner and White's Medical Virlogy. , 437-446 (2017).
  3. COVID-19 Map. Johns Hopkins Coronavirus Resource....

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Etiquetas

SARS CoV 2 Neutralizing AntibodiesPseudovirus Neutralization AssayHigh Throughput ImagingFluorescent ImagingVero E6 CellsSpike Protein PseudovirusConvalescent SerumPlaque AssayCrystal Violet StainingAntibody Quantification

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