SAMHD1 es una trifosfofosfato trifosfohidrolasa desoxinucleósido con funciones críticas en la salud y la enfermedad humanas. Aquí presentamos un ensayo versátil de actividad de SAMHD1 acoplado a enzimas, desplegado en un formato de microplaca de 384 pocillos, que permite la evaluación de moléculas pequeñas y análogos de nucleótidos como sustratos, activadores e inhibidores de SAMHD1.
El motivo alfa estéril y la proteína 1 que contiene el dominio de la EH (SAMHD1) es un regulador fundamental de los grupos intracelulares de trifosfato de desoxinucleósidos (dNTP), ya que esta enzima puede hidrolizar los dNTP en sus correspondientes nucleósidos y trifosfatos inorgánicos. Debido a su papel crítico en el metabolismo de los nucleótidos, su asociación a diversas patologías y su papel en la resistencia a la terapia, actualmente se están llevando a cabo intensas investigaciones para comprender mejor tanto la regulación como la función celular de esta enzima. Por esta razón, es vital el desarrollo de métodos sencillos y económicos de alto rendimiento para sondear la interacción de moléculas pequeñas con SAMHD1, como reguladores alostéricos, sustratos o inhibidores. Para ello, el ensayo verde de malaquita acoplado a enzimas es un ensayo colorimétrico simple y robusto que se puede implementar en un formato de placa de 384 micropocillos que permite la medición indirecta de la actividad de SAMHD1. Como SAMHD1 libera el grupo trifosfato de los sustratos de nucleótidos, podemos acoplar una actividad pirofosfatasa a esta reacción, produciendo así fosfato inorgánico, que puede ser cuantificado por el reactivo verde de malaquita a través de la formación de un complejo verde de malaquita de fosfomolibdato. En este trabajo se muestra la aplicación de esta metodología para caracterizar inhibidores conocidos de SAMHD1 y descifrar los mecanismos implicados en la catálisis de sustratos no canónicos por SAMHD1 y su regulación por activadores alostéricos, ejemplificados por fármacos anticancerígenos basados en nucleósidos. Por lo tanto, el ensayo verde de malaquita acoplado a enzimas es una herramienta poderosa para estudiar SAMHD1 y, además, también podría utilizarse en el estudio de varias enzimas que liberan especies de fosfato.
El motivo alfa estéril y la proteína 1 que contiene el dominio histidina-aspartato (SAMHD1) es un regulador central de la homeostasis de nucleótidos en células de mamíferos1 con muchas funciones en la salud y la enfermedadhumanas 2. Esta enzima es capaz de hidrolizar trifosfatos desoxinucleósidos (dNTPs) en sus moléculas afines de desoxinucleósido y trifosfato inorgánico 3,4, siendo esta actividad regulada alostéricamente por la abundancia de (d)NTP (revisado en la referencia5). Cada monómero SAMHD1 contiene dos sitios alostéricos (AS1 y AS2) y un sitio catalítico, y la formación de la enzima activa requiere el ensamblaje ordenado de un homotetrámero tras la unión de (d)NTP. La dimerización de los monómeros SAMHD1 se desencadena primero a través de la unión de un trifosfato de guanina (GTP o dGTP) a AS1, y la tetramerización posterior se logra cuando una molécula dNTP adicional se une a AS2, lo que permite el acceso del sustrato al sitio catalítico y la posterior hidrólisis.
Los sustratos de SAMHD1 incluyen los cuatro dNTPs canónicos 3,4 junto con algunos nucleótidos modificados con base y azúcar, incluyendo los metabolitos trifosfato de varios fármacos basados en nucleósidos utilizados en el tratamiento de infecciones virales y cáncer, varios de los cuales también pueden servir como activadores alostéricos 6,7,8,9,10,11. En consecuencia, SAMHD1 modula la eficacia de muchos de estos compuestos en modelos de enfermedad 7,8,9,10,11,12,13,14,15 y, además, en el caso del análogo de la desoxicitidina citarabina (ara-C), que se ha mantenido como tratamiento estándar para la leucemia mieloide aguda (LMA) durante décadas, en realidad dicta eficacia del tratamiento en esta enfermedad 7,8,16. Por lo tanto, SAMHD1 es un biomarcador potencial y una diana terapéutica para mejorar la eficacia de las terapias basadas en nucleósidos17 y, en consecuencia, nosotros y otros hemos tratado de identificar estrategias para inactivar SAMHD1 en las células. Propusimos el uso de la proteína viral X (Vpx) como inhibidor biológico para dirigirse a SAMHD1 para su degradación dentro de las células cancerosas7, sin embargo, este enfoque tiene una serie de limitaciones (discutidas en la referencia12), y también informamos recientemente un enfoque indirecto para suprimir la actividad de SAMHD1 a través de la inhibición de la ribonucleótido reductasa que demostramos en varios modelos de LMA18. Varios estudios han buscado identificar moléculas pequeñas capaces de inhibir directamente la SAMHD1 y, hasta la fecha, se han reportado varias moléculas de este tipo, sin embargo, solo se ha documentado la inhibición in vitro 6,9,19,20,21,22. En consecuencia, la falta de moléculas pequeñas que inhiban de forma potente la actividad de SAMHD1 en las células, junto con los complejos mecanismos de catálisis de SAMHD1 de las terapias basadas en nucleósidos, subraya la necesidad de seguir investigando. Por lo tanto, los métodos robustos e idealmente de alto rendimiento para sondear la interacción de moléculas pequeñas con SAMHD1 son ideales para identificar sustratos, reguladores alostéricos e inhibidores de esta enzima clínicamente relevante.
Existen varias metodologías que miden directamente la actividad dNTPasa de SAMHD1, como la cromatografía en capa fina (TLC)9,20,23 y la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)9,21, pero no son fácilmente susceptibles de configuraciones de alto rendimiento. Una excepción es el ensayo reportado por Mauney et al., que explota la capacidad de SAMHD1 para hidrolizar bis (4-nitrofenil) fosfato (b4NPP) a p-nitrofenol y p-nitrofenil fosfato cuando se usa Mn2+ como catión activador, lo que resulta en un cambio colorimétrico que se puede medir fácilmente en una placa de micropocillos21. Este ensayo se ha utilizado con éxito para la identificación y caracterización de inhibidores de SAMHD1, pero debe tenerse en cuenta que la hidrólisis se produce en ausencia de activadores de (d)NTP y en presencia de un probable catión activador no fisiológico, siendo ambas advertencias importantes a tener en cuenta. Esto también hace que este ensayo sea menos aplicable al estudio e identificación de reguladores alostéricos de SAMHD1.
En este contexto, un enfoque acoplado a enzimas combinado con el reactivo verde de malaquita, como se detalla en este informe, puede ser un método versátil para medir indirectamente la actividad de la dNTPasa de SAMHD1 y, además, interrogar el impacto de varias moléculas pequeñas sobre ella. El ensayo de verde de malaquita es una técnica colorimétrica robusta y fiable para la detección de fosfato inorgánico libre (Pi), basada en la formación de un complejo de ácido molibdofosfórico que conduce a un cambio colorimétrico medido a 620 nm24. Como la hidrólisis de SAMHD1 libera el grupo trifosfato de los sustratos de nucleótidos, es necesario acoplar esta reacción con una actividad de (piro)fosfatasa, que generará fosfato inorgánico libre, antes de la adición del reactivo verde de malaquita. El ensayo de verde de malaquita es sensible y rentable y se ha utilizado ampliamente para la identificación y caracterización de inhibidores y sustratos para enzimas que liberan grupos fosfato inorgánicos, ya sea en sus reacciones o en presencia de una enzima de acoplamiento. Se ha aplicado ampliamente en la caracterización de las actividades ATPasa de las helicasas 25,26,27, o en el estudio de la actividad enzimática CD73, que media la degradación del AMP a adenosina y fosfato inorgánico28. Además, cuando se acopla, se ha empleado en el descubrimiento de antibióticos dirigidos a la UDP-2,3-diacilglucosamina pirofosfatasa LpxH, una enzima esencial en la mayoría de los patógenos gramnegativos29. Con respecto a la investigación del cáncer, el enfoque acoplado a enzimas se ha desplegado ampliamente contra las hidrolasas NUDIX, una familia de enzimas metabolizadoras de nucleótidos, tanto en la caracterización de sustratos 30,31,32 como en la identificación y desarrollo de fármacos y sondas químicas 33,34,35,36.
Con respecto a la dNTPasa SAMHD1, este enfoque se ha utilizado en varios informes. Utilizando la exopolifosfatasa Ppx1 de Saccharomyces cerevisiae como enzima de acoplamiento, este ensayo se utilizó para probar varios análogos de nucleótidos como sustratos, activadores o inhibidores de SAMHD1, y dio como resultado la identificación del metabolito trifosfato del fármaco antileucémico clofarabina como activador y sustrato6. Además, con pirofosfatasa inorgánica de Escherichia coli como enzima de acoplamiento, se ha empleado en el cribado de una biblioteca de compuestos clínicamente aprobados contra SAMHD1 para identificar inhibidores20. En nuestra investigación, utilizamos este enfoque para demostrar que ara-CTP, el metabolito activo de ara-C, es un sustrato de SAMHD1 pero no un activador alostérico7 y, posteriormente, utilizamos este ensayo para demostrar que varias moléculas pequeñas que podían sensibilizar modelos de LMA a ara-C de una manera dependiente de SAMHD1, en realidad no inhibían directamente SAMHD118. En este informe, detallaremos este método versátil y demostraremos su aplicabilidad, en una configuración de alto rendimiento, para la identificación de inhibidores, activadores y sustratos de SAMHD1.
El ensayo de actividad acoplada a enzimas que se detalla aquí es un ensayo colorimétrico de alto rendimiento que permite la medición indirecta de la hidrólisis de dNTP mediante SAMHD1. Este método aprovecha la capacidad de la PPasa inorgánica de E. coli, que cuando se incluye en exceso en la mezcla de reacción, convierte cada trifosfato inorgánico generado por SAMHD1 en tres fosfatos libres individuales que se pueden cuantificar utilizando el reactivo verde de malaquita simple y económico. Proporcionamos este ensayo en un formato de placa de 384 micropocillos, que es ideal para el cribado de bibliotecas de compuestos, y demostramos la aplicabilidad y versatilidad de esta técnica en la identificación y caracterización de inhibidores, activadores y sustratos de SAMHD1.
Al igual que con todos los ensayos de cribado bioquímico in vitro , hay una serie de pasos críticos y consideraciones importantes, y muchos de ellos se analizan en profundidad en el Manual de orientación de ensayos39, disponible gratuitamente. La integridad de las enzimas recombinantes purificadas, tanto SAMHD1 como la enzima acoplada PPasa inorgánica, es extremadamente importante y debe confirmarse antes de establecer el ensayo. Y, en consecuencia, cada nueva purificación de estas enzimas debe estar sujeta a cierto nivel de pruebas por lotes, ya que las variabilidades de un lote a otro podrían introducir inconsistencias en los resultados. Idealmente, se debe utilizar un ensayo directo ortogonal, como la HPLC, que permite la detección tanto del sustrato como del producto de reacción, para verificar la actividad de la trifosfohidrolasa dNTP de la SAMHD1 recombinante purificada que se está utilizando.
En cuanto a las limitaciones de este ensayo, la principal es que mide la actividad dNTPasa de SAMHD1 de manera indirecta, explotando la actividad de la PPasa inorgánica, lo que tiene una serie de implicaciones. Es importante confirmar que la PPasa posee poca o ninguna actividad hacia los nucleótidos utilizados en el ensayo y, del mismo modo, que las pequeñas moléculas inhibidoras identificadas no poseen actividad hacia la PPasa. Por lo tanto, con respecto a la detección, una contradetección contra PPase puede ser una consideración importante. La presencia de PPasa en la reacción también hace que sea fundamental utilizar un ensayo ortogonal para confirmar los hallazgos. Con respecto a los ensayos de actividad directa, hasta la fecha se han descrito varios de ellos, incluidos TLC 9,20,23 y HPLC 9,21, que detectan con precisión el agotamiento del sustrato y la formación de productos. Además, el ensayo b4NPP21, que también es de alto rendimiento, podría utilizarse para probar posibles inhibidores; Sin embargo, no es ideal para probar sustratos o activadores alostéricos. Los ensayos biofísicos, como la fluorimetría diferencial de barrido (DSF), de la que hemos informado previamente con SAMHD118, también pueden ser especialmente potentes para identificar y caracterizar ligandos. Otra limitación del ensayo, específicamente como se muestra en la configuración aquí para identificar sustratos y activadores, es el uso del análogo dGTP no hidrolizable dGTPαS como activador de AS1 y AS2. Si bien esto permite la activación de SAMHD1 sin actividad observable en el ensayo, dGTPαS es un inhibidor competitivo de SAMHD1 y, por lo tanto, el uso de altas concentraciones inactivará la enzima. A medida que avanza nuestra comprensión de SAMHD1, los estudios futuros podrían utilizar moléculas que ocupen exclusivamente cada sitio de SAMHD1, negando así este problema potencial.
Como hemos mostrado aquí, este método es versátil y se puede utilizar para abordar una serie de cuestiones bioquímicas. Hemos descrito dos variaciones de este ensayo, una para la identificación de reguladores alostéricos y sustratos de SAMHD1, y otra para la caracterización de inhibidores, pero se pueden hacer más adaptaciones. Con respecto a los inhibidores potenciales, este ensayo, al estar basado en placas de micropocillos, lo hace muy adecuado para estudios posteriores de mecanismos de acción39,40. Del mismo modo, para una mayor caracterización de sustratos y reguladores alostéricos, esta técnica puede ser utilizada para determinar parámetros cinéticos de catálisis, como hicimos para el metabolito activo de citarabina y clofarabina7. Sin embargo, un inconveniente es que el ensayo acoplado a enzimas que se informa aquí es un ensayo de criterio de valoración y, por lo tanto, aunque es adecuado para el cribado, un ensayo continuo sería más adecuado para algunos estudios mecanicistas. Arnold et al. informaron de un ensayo continuo acoplado a enzimas que utiliza el biosensor MDCC-PBP6, que se basa en el uso de la proteína de unión al fosfato periplásmico (PBP) marcada con fluoróforo de maleimida de cumarina (MDCC) que puede unirse a un grupo fosfato libre. MDCC-PBP es muy sensible y permite la cuantificación de concentraciones de fosfato muy bajas, con un tiempo de respuesta del sensor de milisegundos a segundos.
SAMHD1 desempeña una serie de funciones importantes en la salud y la enfermedadhumanas 2 , muchas de las cuales podrían estar relacionadas con su papel central en el mantenimiento de los niveles intracelulares de dNTP1. Por lo tanto, la identificación de una sonda química de alta calidad hacia la actividad dNTPasa de SAMHD1 sería una herramienta poderosa para definir estos enlaces, y el ensayo acoplado a enzimas reportado aquí podría emplearse fácilmente para identificar tales sondas. Además, dado que los fármacos basados en nucleósidos, muchos de los cuales están modulados por SAMHD1, constituyen un grupo diverso e importante de fármacos terapéuticos41; Las sondas químicas podrían convertirse en fármacos dirigidos a SAMHD1 en el entorno clínico, con el objetivo de mejorar la eficacia de estas terapias. También es fundamental comprender el alcance total de la interacción de estos compuestos basados en nucleósidos con SAMHD1, una cuestión que también puede abordarse utilizando este ensayo acoplado a enzimas. En conjunto, el ensayo de actividad SAMHD1 acoplado a enzimas, como se informa aquí, es un ensayo de bajo costo, versátil y de alto rendimiento que se puede utilizar para ampliar nuestra comprensión de esta importante enzima.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a Thomas Lundbäck y a los miembros del laboratorio de Thomas Helliday por su asesoramiento y apoyo. Parte de este trabajo fue facilitado por el Centro de Ciencias de las Proteínas del Instituto Karolinska/SciLifeLab (http://ki.se/psf), y agradecemos al Instituto Nacional del Cáncer (NCI), a la División de Tratamiento y Diagnóstico del Cáncer (DCTD) y al Programa de Terapias del Desarrollo (DTP) (http://dtp.cancer.gov) por proporcionar un compuesto. La financiación provino de subvenciones otorgadas a S.G.R. por el Consejo Sueco de Investigación (2018-02114), la Sociedad Sueca del Cáncer (19-0056-JIA, 20-0879-PJ), el Fondo Sueco de Cáncer Infantil (PR2019-0014) y el Instituto Karolinska.
2'-deoxyadenosine-5'-triphosphate (dATP) | Jena bioscience | NU-1001 | Compound tested in SAMHD1 activator/substrate assay |
2'-deoxycytidine-5'-triphosphate (dCTP) | Jena bioscience | NU-1002 | Compound tested in SAMHD1 activator/substrate assay |
2'-Deoxyguanosine-5'-(α-thio)-triphosphate (dGTPαS) | Jena bioscience | NU-424 | Non-hydrolyzable dGTP analogue for SAMHD1 activator/substrate assay |
2'-deoxyguanosine-5'-triphosphate (dGTP) | GE Healthcare | 27-1870-04 | SAMHD1 allosteric activator and substrate used in inhibition assay and activator/substrate assay |
2'-Deoxythymidine-5'-[(α,β)-imido]triphosphate (dTMPNPP) | Jena bioscience | NU-907-1 | Compound tested in SAMHD1 inhibition assay |
2'-deoxythymidine-5'-triphosphate (dTTP) | Jena bioscience | NU-1004 | Compound tested in SAMHD1 activator/substrate assay |
2'Deoxyguanosine mohohydrate (dGuo) | Sigma-Aldrich | D0901 | Compound tested in SAMHD1 inhibition assay |
384 well clear flat-bottom microplate | Thermo Fisher Scientific | 262160 | Assay plate |
96 well clear U-bottom polypropylene microplate | Thermo Fisher Scientific | 267245 | Compound dilution plate |
Ammonium heptamolybdate tetrahydrate | Sigma-Aldrich | A1343 | Reagent required for malachite green working reagent |
ara-Cytidine-5'-triphosphate (ara-CTP) | Jena bioscience | NU-1170 | Compound tested in SAMHD1 activator/substrate assay |
Clofarabine-5'-triphosphate (Cl-F-ara-ATP) | Jena bioscience | NU-874 | Compound tested in SAMHD1 activator/substrate assay |
Dimethyl sulphoxide (DMSO) | VWR | 23486.297 | Solvent |
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma-Aldrich | E5134 | EDTA stop solution component |
Gemcitabine-5'-triphosphate (dF-dCTP) | Jena bioscience | NU-1607 | Compound tested in SAMHD1 activator/substrate assay |
GraphPad Prism | GraphPad Software | Prism 8 | Data analysis and visualisation |
Guanosine 5′-triphosphate (GTP) sodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G8877 | Allosteric activator for SAMHD1 activator/substrate assay |
His-tagged E. coli inorganic pyrophosphatase (PPase) | Generated in house using Protein Science Facility, Karolinska Institutet | – | Recombinant PPase protein, hydrolises inorganic triphosphate and pyrophosphate to orthophosphate so it can form complex with malachite green |
His-tagged human SAMHD1 | Generated in house using Protein Science Facility, Karolinska Institutet | – | Recombinant SAMHD1 protein, hydrolizes dNTPs into its corresponding nucleoside and inorganic triphosphate |
Hydroxyurea | Sigma-Aldrich | H8627 | Compound tested in SAMHD1 inhibition assay |
Lomofungin | National Cancer Institute (NCI)/Division of Cancer Treatment and Diagnosis (DCTD)/Developmental Therapeutics Program (DTP) | NSC106995 | Compound tested in SAMHD1 inhibition assay |
Magnesium Chloride hexahydrate (MgCl<sub>2</sub>) | Sigma-Aldrich | M2670 | SAMHD1 reaction buffer component |
Malachite green Carbinol hydrochloride | Sigma-Aldrich | 213020 | Malachite green stock component |
Microplate Reader | Hidex | Hidex Sense Microplate reader | Data acquisition, absorption read at 630 nm wavelength |
Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | 31434 | SAMHD1 reaction buffer component |
Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 567530 | SAMHD1 reaction buffer component |
Sodium phosphate (Na<sub>3</sub>PO<sub>4</sub>) | Sigma-Aldrich | 342483 | Required for phosphate standard curve |
Sulphuric acid 95-97% | Sigma-Aldrich | 84720 | Malachite green stock component |
Tris-Acetate salt | Sigma-Aldrich | T1258 | SAMHD1 reaction buffer component |
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) | Sigma-Aldrich | C4706 | SAMHD1 reaction buffer component |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | SAMHD1 reaction buffer and malachite green working reagent component |