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Research Article
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Se proporcionó un protocolo detallado de métodos de análisis de expresión diferencial para la secuenciación de ARN: limma, EdgeR, DESeq2.
La secuenciación de ARN (RNA-seq) es una de las tecnologías más utilizadas en transcriptómica, ya que puede revelar la relación entre la alteración genética y los procesos biológicos complejos y tiene un gran valor en el diagnóstico, pronóstico y terapéutica de tumores. El análisis diferencial de los datos de RNA-seq es crucial para identificar transcripciones aberrantes, y limma, EdgeR y DESeq2 son herramientas eficientes para el análisis diferencial. Sin embargo, el análisis diferencial RNA-seq requiere ciertas habilidades con el lenguaje R y la capacidad de elegir un método apropiado, que falta en el currículo de la educación médica.
Aquí, proporcionamos el protocolo detallado para identificar genes expresados diferencialmente (DEG) entre el colangiocarcinoma (CHOL) y los tejidos normales a través de limma, DESeq2 y EdgeR, respectivamente, y los resultados se muestran en gráficos de volcanes y diagramas de Venn. Los tres protocolos de limma, DESeq2 y EdgeR son similares pero tienen diferentes pasos entre los procesos del análisis. Por ejemplo, se utiliza un modelo lineal para la estadística en limma, mientras que la distribución binomial negativa se utiliza en edgeR y DESeq2. Además, los datos de recuento normalizado de RNA-seq son necesarios para EdgeR y limma, pero no son necesarios para DESeq2.
Aquí, proporcionamos un protocolo detallado para tres métodos de análisis diferencial: limma, EdgeR y DESeq2. Los resultados de los tres métodos se superponen en parte. Los tres métodos tienen sus propias ventajas, y la elección del método solo depende de los datos.
La secuenciación de ARN (RNA-seq) es una de las tecnologías más utilizadas en transcriptómica con muchas ventajas (por ejemplo, alta reproducibilidad de datos), y ha aumentado drásticamente nuestra comprensión de las funciones y dinámicas de procesos biológicos complejos1,2. La identificación de transcripciones aberrantes bajo diferentes contextos biológicos, que también se conocen como genes expresados diferencialmente (DEG), es un paso clave en el análisis de ARN-seq. RNA-seq permite obtener una comprensión profunda de los mecanismos moleculares relacionados con la patogénesis y las funciones biológicas. Por lo tanto, el análisis diferencial ha sido considerado como valioso para el diagnóstico, pronóstico y terapéutica de tumores3,4,5. Actualmente, se han desarrollado más paquetes R/Bioconductor de código abierto para el análisis de expresión diferencial RNA-seq, particularmente limma, DESeq2 y EdgeR1,6,7. Sin embargo, el análisis diferencial requiere ciertas habilidades con el lenguaje R y la capacidad de elegir el método apropiado, que falta en el plan de estudios de la educación médica.
En este protocolo, basado en los datos de conteo de ARN-seq de colangiocarcinoma (CHOL) extraídos del Atlas del Genoma del Cáncer (TCGA), se llevaron a cabo tres de los métodos más conocidos (limma8,EdgeR9 y DESeq210),respectivamente, por el programa R11 para identificar los DEG entre CHOL y tejidos normales. Los tres protocolos de limma, EdgeR y DESeq2 son similares pero tienen diferentes pasos entre los procesos del análisis. Por ejemplo, los datos de recuento normalizado de RNA-seq son necesarios para EdgeR y limma8,9, mientras que DESeq2 utiliza sus propias discrepancias de biblioteca para corregir datos en lugar de la normalización10. Además, edgeR es específicamente adecuado para datos de RNA-seq, mientras que el limma se utiliza para microarrays y RNA-seq. Limma adopta un modelo lineal para evaluar los DEGs12,mientras que las estadísticas en edgeR se basan en las distribuciones binomiales negativas, incluyendo estimación empírica de Bayes, pruebas exactas, modelos lineales generalizados y pruebas de cuasi-verosimilitud9.
En resumen, proporcionamos los protocolos detallados de análisis de expresión diferencial RNA-seq mediante el uso de limma, DESeq2 y EdgeR, respectivamente. Al consultar este artículo, los usuarios pueden realizar fácilmente el análisis diferencial RNA-seq y elegir los métodos de análisis diferencial apropiados para sus datos.
NOTA: Abra el programa R-studio y cargue el archivo R "DEGs.R", el archivo se puede adquirir desde Archivos suplementarios / Scripts.
1. Descarga y preprocesamiento de datos
2. Análisis de expresión diferencial a través de "limma"
3. Análisis de expresión diferencial a través de "edgeR"
4. Análisis de expresión diferencial a través de "DESeq2"
5. Diagrama de Venn
Existen diversos enfoques para visualizar el resultado del análisis de expresión diferencial, entre los que se utilizan particularmente la gráfica del volcán y el diagrama de Venn. limma identificó 3323 DEGs entre el CHOL y los tejidos normales con el |logFC|≥2 y adj. P.Val <0,05 como umbrales, entre los cuales 1880 fueron regulados a la baja en los tejidos CHOL y 1443 fueron regulados al pie(Figura 1a). Mientras tanto, edgeR identificó los 1578 DEG regulados a la baja y 3121 DEG regulados al límite(Figura 1b); DESeq2 identificó los 1616 DEG regulados a la baja y 2938 DEG regulados al día(Figura 1c). Comparando los resultados de estos tres métodos, se superpusieron 1431 DEG regulados al día y 1531 DEG regulados a la baja (Figura 2).
Figura 1. Identificación de genes expresados diferencialmente (DEGs) entre CHOL y tejidos normales. (a-c) Las gráficas de volcanes de todos los genes adquiridos por limma, edgeR y DESeq2, respectivamente, el valor de adj p (-log10) se traza contra el cambio de pliegue (log2), los puntos rojos representan los DEG regulados al up (valor de p ajustado<0.05 y log | FC|> 2) y los puntos verdes representan los DEG regulados a la baja (valor p ajustado< 0,05 y log | FC|< 2). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Los diagramas de Venn muestran superposición entre los resultados derivados de limma, edgeR y DESeq2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Expedientes complementarios. Haga clic aquí para descargar este archivo.
El manuscrito no ha sido publicado antes y no está siendo considerado para su publicación en otro lugar. Todos los autores han contribuido a la creación de este manuscrito para un contenido intelectual importante y han leído y aprobado el manuscrito final. Declaramos que no hay conflicto de intereses.
Se proporcionó un protocolo detallado de métodos de análisis de expresión diferencial para la secuenciación de ARN: limma, EdgeR, DESeq2.
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Subvención No. 81860276) y los Proyectos clave del Fondo Especial del Programa Nacional de I + D Clave (Subvención No. 2018YFC1003200).
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