Desarrollo de tejido cardíaco humano organizado en 3D dentro de una plataforma microfluídica

Resumen

El objetivo de este protocolo es explicar y demostrar el desarrollo de un modelo microfluídico tridimensional (3D) de tejido cardíaco humano altamente alineado, compuesto por cardiomiocitos derivados de células madre co-cultivados con fibroblastos cardíacos (CF) dentro de un hidrogel biomimético a base de colágeno, para aplicaciones en ingeniería de tejido cardíaco, detección de fármacos y modelado de enfermedades.

Resumen

La principal causa de muerte en todo el mundo persiste como la enfermedad cardiovascular (ECV). Sin embargo, modelar la complejidad fisiológica y biológica del músculo cardíaco, el miocardio, es notoriamente difícil de lograr in vitro. Principalmente, los obstáculos se encuentran en la necesidad de cardiomiocitos humanos (MC) que son adultos o exhiben fenotipos similares a los adultos y pueden replicar con éxito la complejidad celular del miocardio y la intrincada arquitectura 3D. Desafortunadamente, debido a las preocupaciones éticas y a la carencia del tejido cardiaco humano paciente-derivado primario disponible, combinado con la proliferación mínima de CMs, el abastecimiento de CMs humanos viables ha sido un paso limitador para la ingeniería cardiaca del tejido. Con este fin, la mayoría de las investigaciones han hecho la transición hacia la diferenciación cardíaca de las células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSCs) como la fuente primaria de los MC humanos, lo que resulta en la amplia incorporación de hiPSC-CMs dentro de los ensayos in vitro para el modelado de tejido cardíaco.

Aquí en este trabajo, demostramos un protocolo para el desarrollo de un tejido cardíaco humano derivado de células madre maduras 3D dentro de un dispositivo microfluídico. Específicamente se explica y demostrar visualmente la producción de un modelo de tejido cardíaco anisotrópico in vitro en 3D en un chip de CMs derivados de hiPSC. Se describe principalmente un protocolo de purificación para seleccionar para CMs, el co-cultivo de células con una relación definida a través de la mezcla de CMs con CFs humanos (hCFs), y la suspensión de este co-cultivo dentro del hidrogel a base de colágeno. Además, demostrar la inyección de hidrogel cargado de células dentro de nuestro dispositivo microfluídico bien definido, incrustado con micropostes elípticos escalonados que sirven como topografía de la superficie para inducir un alto grado de alineación de las células circundantes y la matriz de hidrogel, imitando la arquitectura del miocardio nativo. Imaginamos que el modelo de tejido cardíaco anisotrópico en chip propuesto en 3D es adecuado para estudios de biología fundamental, modelado de enfermedades y, a través de su uso como herramienta de detección, pruebas farmacéuticas.

Introducción

Los enfoques de ingeniería de tejidos han sido ampliamente explorados, en los últimos años, para acompañar los hallazgos clínicos in vivo en la medicina regenerativa y el modelado de enfermedades^1,2. Se ha puesto un énfasis significativo particularmente en el modelado de tejido cardíaco in vitro debido a las dificultades inherentes en el abastecimiento de tejido cardíaco primario humano y la producción de sustitutos in vitro fisiológicamente relevantes, lo que limita la comprensión fundamental de los complejos mecanismos de las enfermedades cardiovasculares (ECV)^1,<....

Protocolo

Realice toda la manipulación celular y la preparación de reactivos dentro de un gabinete de bioseguridad. Asegúrese de que todas las superficies, materiales y equipos que entren en contacto con las células sean estériles (es decir, rocíe con etanol al 70%). Las células deben cultivarse en una incubadora humidificada de 37 °C, 5% de CO_2. Todo el cultivo y diferenciación hiPSC se realiza en placas de 6 pocillos.

1. Creación de dispositivos microfluídicos (duración aproximada: 1 semana)

1. fotolitografía
   NOTA: La máscara, diseñada utilizando el archivo CAD (proporcionado como archivo suplementario....

Resultados

Para obtener una población altamente purificada de CMs a partir de hiPSCs, se utiliza una versión modificada que implica una combinación del protocolo de diferenciación^{Lian 33} y los pasos de purificación³⁴ de Tohyama (consulte la Figura 1A para la línea de tiempo experimental). Los hiPSCs necesitan ser colonia-como, ~85% confluente, y uniformemente repartidos a través del pozo de la cultura 3-4 días después del paso, en el inicio de la diferenc.......

Discusión

La formación de un modelo de tejido cardíaco humano in vitro con interacciones célula-célula mejoradas y estructura 3D biomimética es imprescindible para la investigación cardiovascular básica y las correspondientes aplicaciones clínicas¹. Este protocolo contorneado explica el desarrollo del tejido cardiaco anisotrópico humano 3D dentro de un dispositivo microfluidic, usando el co-cultivo de CMs célula-derivados del vástago con los CF conectivos encapsulados dentro de un hidrogel del colá.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubos de centrífuga de 0,65 ml	VWR	87003-290
1 mm Punzón de biopsia	VWR	95039-090
1,5 mm Punzón de biopsia	VWR	95039-088
Tubos Falcon de 15 mL VWR		89039-670
Cubreobjetos de 18x18 mm	VWR	16004-308	Los cubreobjetos deben ser n.º 1, para permitir la obtención de imágenes
de gran aumentoParaformaldehído al 4%	ThermoFisher	101176-014
de cultivo de tejidos de 6 pocillos	VWR	82050-844
B27 sin insulina	LifeTech	A1895602
B27 más insulina	LifeTech	17504001
CHIR99021	VWR	10188-030
Colágeno I, cola	rata Corning	47747-218
DMEM F12	ThermoFisher	11330057
DPBS	ThermoFisher	21600069
E8	ThermoFisher	A1517001	también se puede fabricar internamente
EDTA	VWR	45001-122
Etanol
FGM3	VWR	10172-048
GFR-Matrigel	VWR	47743-718
Glycine	Sigma	G8898-500G
Suero de cabra	VWR	10152-212
hESC-Matrigel	Corning	BD354277
IPA
IWP2	Sigma	I0536-5MG
Toallitas Kimwipes	VWR	82003-820
MTCS	Sigma	440299-1L
NaN3	Sigma	S2002-25G
NaOH	Sigma	S5881-500G
Pluma/Estreptococo	VWR	15140122
Placa de Petri (150x15mm)	VWR	25384-326
Placa de Petri (60x15mm)	VWR	25384-092
Phenol Red	Sigma	P3532-5G
RPMI 1640	ThermoFisher	MT10040CM
RPMI 1640 menos glucosa	VWR	45001-110
Obleas de silicio (100mm)	University Wafer	1196
Lactato de sodio	Sigma	L4263-100ML
SU8 2075	Microchem	Y111074 0500L1GL
SU8 Revelador	Matraces ThermoFisher	NC9901158
Sylgard Elastómero	Essex Brownell	DC-184-1.1
T75	VWR	82050-856
Triton X-100	Sigma	T8787-100ML
TrypLE	ThermoFisher	12604021
Tripsina-EDTA (0,5%)	ThermoFisher	15400054
Tween20	Sigma	P9416-50ML
Y-27632 Tecnologías de	células madre	72304
EVG620 Alineador	EVG
Limpiador de plasma PDC-32G	Harrick Plasma
Zeiss AxioObserver Z1 Microscopio	Nikon
Leica SP8 Microscopio confocal	Leica