RIBO-seq En Bacterias: Una Colección de Muestras Y Protocolo De Preparación De La Biblioteca Para La Secuenciación NGS

Summary

Aquí se describen las etapas de la recolección de muestras y la preparación de RIBO-seq en bacterias. La secuenciación de las bibliotecas preparadas de acuerdo con estas directrices da como resultado datos suficientes para un análisis bioinformático exhaustivo. El protocolo que presentamos es simple, utiliza equipos de laboratorio estándar y tarda siete días desde la lisis hasta la obtención de bibliotecas.

Abstract

La técnica de perfilado de ribosomas (RIBO-seq) es actualmente la herramienta más eficaz para estudiar el proceso de síntesis de proteínas in vivo. La ventaja de este método, en comparación con otros enfoques, es su capacidad para monitorear la traducción mediante el mapeo preciso de la posición y el número de ribosomas en una transcripción de ARNm.

En este artículo, se describen las etapas consecutivas de la recolección de muestras y la preparación para el método RIBO-seq en bacterias, destacando los detalles relevantes para la planificación y ejecución del experimento.

Puesto que el RIBO-seq confía en los ribosomas intactos y los mRNAs relacionados, el paso dominante es la inhibición rápida de la traducción y la desintegración adecuada de células. Por lo tanto, sugerimos la filtración y la congelación flash en nitrógeno líquido para la recolección celular con un pretratamiento opcional con cloranfenicol para detener la traducción en bacterias. Para la desintegración, proponemos moler las células congeladas con mortero y pestle en presencia de óxido de aluminio para alterar mecánicamente la pared celular. En este protocolo, no se requiere un cojín de sacarosa o una ultracentrifugación de gradiente de sacarosa para la purificación del monosoma. En lugar, la separación del mRNA usando la electroforesis del gel de la poliacrilamida (PÁGINA) seguida por la supresión ribosómica de la huella (venda de 28-30 nt) se aplica y proporciona resultados satisfactorios. Esto simplifica en gran medida el método, así como reduce los requisitos de tiempo y equipo para el procedimiento. Para la preparación de la biblioteca, recomendamos usar el pequeño kit de ARN disponible comercialmente para la secuenciación de Illumina de New England Biolabs, siguiendo las pautas del fabricante con cierto grado de optimización.

Las bibliotecas de ADNc resultantes presentan la cantidad y calidad adecuadas requeridas para la secuenciación de próxima generación (NGS). La secuenciación de las bibliotecas preparadas de acuerdo con el protocolo descrito da como resultado de 2 a 10 mln lecturas mapeadas de forma única por muestra, lo que proporciona datos suficientes para un análisis bioinformático exhaustivo. El protocolo que presentamos es rápido y relativamente fácil y se puede realizar con equipos de laboratorio estándar.

Introduction

La técnica de perfilado de ribosomas (RIBO-seq) fue desarrollada en el laboratorio de Jonathan Weissman de la Universidad de California, San Francisco^1. En comparación con otros métodos utilizados para estudiar la expresión génica a nivel traslacional, RIBO-seq se centra en cada ribosoma que se une al ARNm y proporciona información sobre su ubicación y el número relativo de ribosomas en una transcripción. Permite monitorizar el proceso de síntesis de proteínas in vivo y puede proporcionar resolución y precisión de un solo codón permitiendo la medición de la densidad del ribosoma tanto en el ARNm individual como a lo largo de todo el tr....

Protocol

1. Recogida de muestras

1. Preparar un cultivo bacteriano. Recomendamos un volumen de cultivo de 100 mL por muestra.
2. Preparar equipos y reactivos para la recolección de muestras: dos scápulas por muestra, filtros estériles de membrana de ésteres de celulosa (MCE) mixtos de 0,45 μm, tubos estériles de 50 mL, nitrógeno líquido, 50 mg/mL de cloranfenicol en etanol al 70% (vol/vol) (opcional). Pinchar la tapa de tubos de 50 mL para permitir la evaporación de nitrógeno líquido y evitar la explosión de tubos cerrados. Descontaminar las escápulas con detergente de laboratorio y etanol al 70%.
3. Preguerra el equipo de filtrado y una de las scoopulas a....

Results

Los resultados ejemplares presentados aquí se obtuvieron en un estudio que examina la regulación de la traducción en células de los subtilis del Bacilo wt esporulantes. Los cultivos nocturnos se diluyeron a OD₆₀₀ igual a 0,1 en 100 mL de medio rico y se incubaron a 37 °C con agitación vigorosa hasta que OD₆₀₀ alcanzó 0,5-0,6. El medio rico fue reemplazado por un medio mínimo para inducir el proceso de esporulación y la incubación se continuó hasta por cuatro horas. Las células fueron cosech.......

Discussion

El desafío técnico clave del perfilado de ribosomas es la necesidad de inhibir rápidamente la traducción para capturar una instantánea de ribosomas en ARNm en un estado fisiológico particular de interés. Para lograr esto, los inhibidores de la traducción, la cosecha rápida y la congelación flash en nitrógeno líquido se utilizan comúnmente. La aplicación de antibióticos es opcional, ya que pueden causar artefactos. El cloranfenicol es un fármaco de uso común para detener los ribosomas alargados en ribo-seq bacteriano. Sin.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10X TBE (polvo)	Invitrogen	AM9864
2-Mercaptoetanol, 99%, puro	Acros Organics	125472500
Adenosina 5'-Trifosfato (ATP)	New England Biolabs	P0756S P.A
aluminio	Chempur	114560600
Cloruro de calcio dihidratado	Sigma-Aldrich	C3881-500G
Cloranfenicol	MP Biomedicals	190321
DNA Clean & Concentrador -5	Zymo Research	D4004
Dnase I recombinante, sin ARNasa	Roche	4716728001
Sal disódica EDTA	Fisher Scientific	E/P140/48
Alcohol etílico Absolut 99,8%  Pure-P.A.-Basic	POCH Avantor Performance Materials Poland S.A	BA6480111
Aparato de filtración	VWR Collection	511-0265	Aparato de filtración totalmente de vidrio, con embudo, base fritada, tapón, 47 mm Ø abrazadera de resorte y matraz de unión rectificada
Gel 40 (19:1)	Rotiphorese	3030.1
Tinte de carga de gel, azul, 6X	New England Biolabs	E6138G
Guanosina 5′-[β,γ-imido]trifosfato sal trisódica hidrato	Sigma-Aldrich	G0635-25MG
labZAP	A& A Biotechnology	040-500
Acetato de magnesio tetrahidratado	Sigma-Aldrich	M5661-250G
Instalador de membrana MCE	Tecnología Alfatec M47MCE45GWS		tamaño de poro: 0,45 um
MICROBExpress Purificación de ARNm bacteriano	Invitrogen	AM1905
Multiplex Conjunto de preparación de biblioteca de ARN pequeño para Illumina	New England Biolabs	E7300S
Agua sin nucleasas	Ambion	AM9937
Acetato de potasio anhidro P.A.	POCH Avantor Performance Materials Poland S.A	744330113
Carga rápida pBR322 DNA-MspI Digest	New England Biolabs	E7323A
RNA Clean & Concentrador -25	Zymo Research	R1018
Acetato de sodio	Sigma-Aldrich	S2889-250G
Carbonato de sodio	Sigma-Aldrich	223530-500G
Carbonato de hidrógeno de sodio puro p.a.	POCH Avantor Performance Materials Poland S.A	810530115
SYBR Tinción de gel de ácido nucleico de oro	Life Technologies	S11494
T4 Polinucleótido quinasa	England Biolabs	M0201L
T4 T4 Tampón de reacción de polinucleótido quinasa	England Biolabs	B0201S
TBE-Urea Sample Buffer (2x)	Invitrogen	LC6876
Tris(hidroximetil)amino-metano, ultrapuro, 99,9%	AlfaAesar	J65594
Triton X-100, 98%	Acros Organics	327371000
Urea G.R.	lach:ner	40096-AP0