Method Article

Cuantificación de las densidades celulares y propiedades antigénicas mediante levitación magnética

DOI:

10.3791/62550

⸱

May 17th, 2021

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1Nano Flow Core Facility, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School, 2Department of Medicine, Division of Allergy and Inflammation, Beth Israel Deaconess Medical Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este artículo describe un método basado en la levitación magnética que puede detectar específicamente la presencia de antígenos, ya sean solubles o unidos a la membrana, cuantificando los cambios en la altura de levitación de las perlas de captura con densidades fijas.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El método descrito se desarrolló en base a los principios de la levitación magnética, que separa las células y las partículas en función de su densidad y propiedades magnéticas. La densidad es una propiedad de identificación de tipo celular, directamente relacionada con su tasa metabólica, diferenciación y estado de activación. La levitación magnética permite un enfoque de un solo paso para separar, obtener imágenes y caracterizar con éxito las células sanguíneas circulantes, y para detectar anemia, enfermedad de células falciformes y células tumorales circulantes en función de la densidad y las propiedades magnéticas. Este enfoque también es susceptible de detectar antígenos solubles presentes en una solución mediante el uso de conjuntos de perlas de baja y alta densidad recubiertas con anticuerpos de captura y detección, respectivamente. Si el antígeno está presente en la solución, une los dos conjuntos de perlas, generando un nuevo complejo de cuentas- cuentas, que levitará entre las filas de cuentas recubiertas de anticuerpos. El aumento de la concentración del antígeno objetivo en solución generará un mayor número de complejos de perlas en comparación con concentraciones más bajas de antígeno, lo que permitirá mediciones cuantitativas del antígeno objetivo. La levitación magnética es ventajosa para otros métodos debido a su menor tiempo de preparación de la muestra y la falta de dependencia de los métodos clásicos de lectura. La imagen generada se captura y analiza fácilmente utilizando un microscopio estándar o un dispositivo móvil, como un teléfono inteligente o una tableta.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La levitación magnética es una técnica desarrollada para separar, analizar e identificar los tipos celulares1,2,3,proteínas4,5 y opioides6 basándose únicamente en su densidad específica y propiedades paramagnéticas. La densidad celular es una propiedad única e intrínseca de cada tipo de célula directamente relacionada con su tasa metabólica y estado de diferenciación7,8,9,10,11,12,13,14. Cuantificar los cambios sutiles y transitorios en la densidad celular durante las condiciones de estado estacionario, y durante una variedad de procesos celulares, podría permitirle a uno una visión inigualable de la fisiología celular y la fisiopatología. Los cambios en la densidad celular se asocian con ladiferenciación celular15,16,la progresión del ciclo celular9,17, 18,19,la apoptosis 20,21,22,23y la transformación maligna24,25,26 . Por lo tanto, la cuantificación de cambios específicos en la densidad celular, se puede utilizar para diferenciar entre células de diferentes tipos, así como discriminar entre un mismo tipo de células sometidas a diversos procesos de activación. Esto permite experimentos dirigidos a una subal población celular en particular, donde los cambios dinámicos en la densidad sirven como un indicador del metabolismo celular alterado27. Como se ha establecido que una célula puede alterar su densidad en respuesta a un entorno cambiante7,es imperativo medir la cinética de la célula en relación con su densidad para entenderla completamente, lo que los métodos actuales pueden no proporcionar12. La levitación magnética, por otro lado, permite una evaluación dinámica de las células y sus propiedades28.

Las células son diamagnéticas, lo que significa que no tienen un momento dipolar magnético permanente. Sin embargo, cuando se expone a un campo magnético externo, se genera un momento dipolar magnético débil en las células, en la dirección opuesta al campo aplicado. Por lo tanto, si las células están suspendidas en una solución paramagnética y expuestas a un fuerte campo magnético vertical, levitarán lejos de la fuente magnética y se detendrán a una altura, que depende principalmente de su densidad individual. La levitación diamagnética de un objeto confinado al mínimo de un campo magnético no homogéneo es posible cuando se cumplen los dos criterios siguientes: 1) la susceptibilidad magnética de la partícula debe ser menor que la del medio circundante, y 2) la fuerza magnética debe ser lo suficientemente fuerte como para contrarrestar la fuerza de flotabilidad de la partícula. Ambos criterios pueden cumplirse suspendiendo los glóbulos rojos en un búfer magnético y creando fuertes gradientes de campo magnético con imanes permanentes pequeños, económicos y disponibles comercialmente1. La posición de equilibrio de una partícula atrapada magnéticamente en un eje a lo largo de la dirección de la gravedad está determinada por su densidad (en relación con la densidad del tampón), su susceptibilidad magnética (en relación con la susceptibilidad magnética del tampón) y la firma del campo magnético aplicado. Como la densidad y las propiedades magnéticas de la solución son constantes en todo el sistema, las propiedades de densidad intrínseca de las células serán el factor principal que determine la altura de levitación de las células, con células más densas que levitan más bajas en comparación con las células menos densas. Este enfoque utiliza un conjunto de dos cuentas de referencia de densidad (1,05 y 1,2 g/ml) que nos permite utilizar un análisis preciso y ratiométrico para las mediciones de densidad. Alterar la concentración de la solución magnética permite aislar diferentes poblaciones celulares, como los glóbulos rojos de los glóbulos blancos, ya que la densidad de las células circulantes es específica de la célula, eliminando la necesidad de protocolos de aislamiento u otra manipulación celular.

La mayoría de los métodos de detección utilizados en la investigación biología se basan en la extrapolación de eventos de unión específicos en señales lineales fáciles de cuantificar. Estos métodos de lectura son a menudo complejos e involucran equipos especializados y personal científico dedicado. Aquí se describe un enfoque dirigido a la detección de antígenos que se encuentran en la membrana plasmática de las células o vesículas extracelulares o que son solubles en plasma, utilizando una o dos perlas recubiertas de anticuerpos. Las cuentas deben ser de diferentes densidades entre sí y de las de los objetivos interrogados. La presencia del antígeno objetivo en cualquier biofluido dado se traduce en un cambio específico y medible en la altura de levitación de una célula positiva para antígeno que está unida a una cuenta de detección. En el caso de antígenos solubles o vesículas extracelulares, están unidas tanto a cuentas de captura como de detección, formando un complejo de cuentas-cuentas en lugar de un complejo de perlas-células. El cambio en la altura de levitación depende de la nueva densidad de los complejos de células de cuentas o cuentas. Además del cambio en la altura de levitación de los complejos, que indica la presencia de antígeno en el biofluido, el número de complejos también depende de la cantidad de objetivo, lo que hace que la levitación magnética también sea un enfoque cuantitativo para la detección de antígenos24.

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Protocol

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El protocolo experimental utilizado en este estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional del Centro Médico Beth Israel Deaconess (IRB).

1. Configuración del instrumento

NOTA: Las imágenes de células levitizantes requieren que dos imanes de neodimio de tierras raras magnetizados en el eje Z se coloquen con el mismo polo uno frente al otro para generar un campo magnético. La distancia entre los imanes se puede personalizar dependiendo de la intensidad del campo magnético y la densidad de los objetivos. En este caso, los imanes están separados por un espacio de 1 mm suficiente para la inserción de un tubo capilar de vidrio cuadrado de 1x1 mm de 50 mm de largo. El dispositivo se imprimió en 3D utilizando un diseño de AutoCAD, que está disponible bajo petición.

  1. Coloca el microscopio de lado, perfectamente horizontal.
    NOTA: Un microscopio colocado en posición vertical estándar no es directamente adecuado para obtener imágenes de objetos levitantes debido a las posiciones de los imanes con respecto al condensador y el objetivo. Esta limitación se puede evitar colocando el microscopio de lado, perfectamente horizontal permitiendo que el condensador enfoque la luz en el capilar, y la lente del objetivo para obtener imágenes de la célula levitando entre los imanes, manteniendo los requisitos de iluminación de Köhler.
  2. Apoye y nivele el soporte en una mesa de placa de pruebas utilizando 2 o 3 tomas de laboratorio.
  3. Para limitar las vibraciones, apoye la mesa de la placa de pruebas con pies amortiguadores de goma.
  4. Retire la etapa y reemplácela con un conector de laboratorio compacto para ajustar la altura del dispositivo de levitación(eje y)y dos etapas de traslación de un solo eje; uno para ajustar el enfoque(eje z),y el segundo para escanear el tubo capilar.
  5. Conecte el dispositivo de levitación magnética a la toma de laboratorio mediante dos postes ópticos de la miniserie.

2. Unión de anticuerpos a carboxi-micropartículas/perlas (Modificado a partir de un protocolo por PolyAn)

NOTA: Solo las perlas de baja densidad (1,05 g/ml) deben recubrirse para la detección de Rh(+), pero tanto las perlas de alta como las de baja densidad están recubiertas para la detección de vesículas extracelulares.

  1. Saque 1 mg equivalente de suspensión de perlas y agregue a 0.5 mL de tampón de activación (50 mM MES (MW195.2, 9.72 mg en 1 ml)) pH 5.0 y 0.001% polisorbato-20).
  2. Añadir 12 μL de EDC 1,5 M recién hecho (MW 191,7, 0,28755 g en 1 mL) y 12 μL de 0,3 M Sulfo-NHS (MW 217,14, 0,0651 g en 1 mL) en agua helada.
  3. Coloque los tubos en un agitador orbital y agite vigorosamente durante 1 h a temperatura ambiente para activar los grupos carboxilo en las perlas.
  4. Detenga la activación después de 1 h agregando 0.5 mL de tampón de acoplamiento (10x PBS, o 0.1 M de fosfato pH 7-9).
  5. Peletizar las perlas centrifugando a 20.000 x g durante 10 min, o, si las perlas no se pueden peletizar, utilizar un filtro de tubo de centrífuga de 0,45 μm. Aspirar el sobrenadante o flow-through.
  6. Lave las perlas con 1 ml de 10x PBS 3 veces como en el paso 2.5.
  7. Calcule 25 μg de anticuerpos por mg de perlas y mezcle el anticuerpo deseado con perlas activadas a una concentración final de anticuerpos de 0.7-1.0 mg / ml en 10X PBS.
  8. Coloque los tubos en un balancín de tubos a baja velocidad. Enrolle los tubos suavemente a temperatura ambiente durante la noche para el acoplamiento.
  9. Repita el paso 2.5 y lave las perlas dos veces con 1 ml de 10x PBS.
  10. Lavar con 0,5 ml de etanolamina de 1 M (98% de stock = 16,2 M) en tampón de pH 8,0 con polisorbato-20 al 0,02% durante 1 h a temperatura ambiente mientras se agita suavemente.
  11. Repita el paso 2.5 y lave las perlas una vez en 1 ml de DPBS. Las perlas se pueden almacenar en 200 μL de DPBS a 4 °C hasta que sea necesario.
    NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.

3. Recolección y preparación de sangre para la detección de Rh(+)

  1. Usando un dispositivo de punción de un solo clic, pinche el dedo de un donante Rh(+) y recolecte 10 μL de sangre en 1 mL de DPBS.
  2. Teñir las células Rh+ con una tinción fluorescente de membrana plasmática. Opcionalmente, agregue 1 μL de colorante fluorescente a la suspensión de 1 ml de células Rh + (dilución 1: 1000).
  3. Incubar las células con el colorante fluorescente a 37 °C durante 15 min.
  4. Peletizar las células girando a 5.600 x g durante 15 s y lavar 3 veces usando 1 mL de DPBS. Resuspend en 1 mL de HBSS con calcio y magnesio (HBSS++).
  5. Usando el dispositivo de punción de un solo clic, pinche el dedo de un donante Rh(-) y recolecte 2 μL de sangre.
    NOTA: Si prepara más de 2 condiciones, recolecte suficiente sangre para agregar 1 μL de sangre Rh(-) a cada tubo.
  6. Preparar los tubos experimentales necesarios: Perlas solas, control de IgG, muestra.
    1. Perlas solas: agregue 174 μL de HBSS++, 1 μL de perlas de control de IgG, 1 μL de perlas de alta densidad (1,2 g/mL) y 24 μL de 500 mM Gd3+ (60 mM).
    2. Control de IgG: agregue 172 μL de HBSS++, 1 μL de perlas de control de IgG, 1 μL de perlas de alta densidad, 1 μL de sangre Rh,1 μL de suspensión sanguínea Rh+ teñida y 24 μL de 500 mM Gd3+.
    3. El tubo de muestra agrega 172 μL de HBSS++, 1 μL de perlas recubiertas anti-RhD, 1 μL de perlas de alta densidad, 1 μL de sangre Rh-, 1 μL de suspensión sanguínea Teñida Rh(+) y 24 μL de 500 mM Gd3+.
      NOTA: Las perlas de alta densidad se agregan a las muestras de Rh como referencia.

4. Aislamiento de PMN para demostración de separación celular

  1. Aislamiento de neutrófilos
    1. Extraiga 40 ml de sangre venosa en una jeringa de 60 ml que contenga 6 ml de citrato de sodio/ácido cítrico (0,15 M, pH 5,5) y 14 ml de dextrano-70 al 6%.
    2. Espere 50 minutos para que la sangre se sedimente.
    3. Coloque lentamente las células de la capa buffy sobre 20 ml de Ficoll-Paque empujando los 18 ml superiores a través del tubo de recolección de sangre en un tubo de 50 ml, evitando la contaminación con glóbulos rojos sedimentados. Se recomienda utilizar un conjunto de recolección de sangre fresca, para minimizar la contaminación con glóbulos rojos residuales sobrantes en el tubo de recolección de sangre original.
    4. Pellet las células de la capa buffy por centrifugación durante 20 min a 3.000 x g. Los neutrófilos y los glóbulos rojos contaminantes se gricarán en la parte inferior del tubo. PBMC formará una capa blanca en la parte superior de Ficoll-Paque.
    5. Transfiera los neutrófilos a un nuevo tubo de 50 ml.
    6. Lise cualquier glóbulo rojo residual incubando los neutrófilos con 20 ml de solución de NaCl fría al 0,2% durante 25 segundos, seguido de 20 ml adicionales de NaCl al 1,6%. La concertación final de NaCl debe ser del 0,9% (isotónica).
    7. Centrifugar la suspensión durante 10 min a 3.000 x g.
    8. Retire el sobrenadante y vuelva a colocar los neutrófilos a la concentración deseada.
  2. Aislamiento de linfocitos
    1. Placa los PBMCs en RPMI con suero inactivado por calor al 5% en placas de cultivo de 6 pozos.
    2. Incubar las placas durante 1 h a 37 °C. Los monocitos se adherirán a la placa, los linfocitos flotarán libremente.
    3. Retire el tampón que contiene los linfocitos y lávelo dos veces con RPMI.
    4. Resuspend los linfocitos a la concentración deseada.
  3. Etiquete los glóbulos rojos, pmN y linfocitos.
    1. Etiquete cada tipo de célula con un tinte fluorescente diferente. Asegúrese de que cada colorante fluorescencia en un canal diferente. Siga las instrucciones del fabricante para cada uno de los tintes elegidos.

5. Generación de vesículas extracelulares de glóbulos rojos a través de la activación del complemento

  1. Obtener sangre entera a través de la venopunción utilizando tubos de EDTA.
  2. Pase la sangre a través de un filtro de glóbulos blancos y luego centrífuga 3 veces a 500 x g durante 10 minutos cada una para aislar los glóbulos rojos. Utilice HBSS++ como tampón de lavado.
  3. Haga alícuotas de glóbulos rojos empaquetados de 100 μL en tubos de 1.5 ml y sume el volumen a 1 ml agregando HBSS ++.
  4. Agregue C5b,6 a una concentración final de 0,18 μg/ml en HBSS++, y luego vórtice.
  5. Coloque un agitador lento a temperatura ambiente durante 15 min.
  6. Añadir la proteína C7 a una concentración final de 0,2 μg/ml. Mezclar invirtiendo el tubo suavemente un par de veces. No vórtice a partir de este punto.
  7. Coloque el tubo en un agitador de tubos a baja velocidad durante 5 minutos a temperatura ambiente.
  8. Añadir la proteína C8 a una concentración final de 0,2 μg/ml, y la proteína C9 a 0,45 μg/ml. Mezclar invirtiendo los tubos suavemente un par de veces.
  9. Incubar a 37 °C durante 30 min.
  10. Centrifugar el tubo a 10.000 x g durante 10 min.
  11. Recoja el sobrenadante que contiene EV en un tubo nuevo. No tremove el sobrenadante demasiado cerca de la bolita celular.

6. Análisis de células en el dispositivo de levitación magnética

  1. Realice el arranque del instrumento de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
  2. Cargue 50 μL de muestra en un tubo capilar hasta que el tubo se llene. Selle los extremos del tubo capilar con sellador capilar asegurándose de que no haya burbujas de aire presentes.
  3. Cargue el tubo capilar en el soporte entre los imanes superior e inferior. Ajuste el escenario y el enfoque para una visualización óptima.
    NOTA: Las células / perlas pueden tardar entre 5 y 20 minutos en alcanzar su posición de equilibrio magnético en función de su densidad y la concentración de Gd3+. Cuanto mayor sea la concentración de Gd3+,menor será el tiempo.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La levitación magnética enfoca objetos de diferentes densidades a diferentes alturas de levitación dependiendo de la densidad del objeto, su firma magnética, la concentración de solución paramagnética y la fuerza del campo magnético creado por dos imanes fuertes de tierras raras. Como los dos imanes se colocan uno encima del otro, las muestras que levitan solo se pueden ver, manteniendo la iluminación de Köhler, mediante el uso de un microscopio girado de lado(Figura 1). La altura de levitac...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La centrifugación por gradiente es actualmente la técnica estándar para aislar componentes subcelulares en función de sus densidades únicas. Este enfoque, sin embargo, requiere el uso de medios de gradiente especializados, así como equipos de centrífuga. El enfoque de levitación magnética presentado aquí permite una investigación detallada de las propiedades morfológicas y funcionales de las células circulantes, con una manipulación mínima, si es que hay alguna, de las células, proporcionando un acceso casi in vivo

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Disclosures

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Los autores no tienen conflictos que revelar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores desean agradecer al Dr. Getulio Pereira por su ayuda con el trabajo de vesículas extracelulares.

Este trabajo fue apoyado por las siguientes subvenciones del Instituto Nacional de Salud al ICG: RO1CA218500, UG3HL147353 y UG3TR002881.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Hidrato de ácido 2-(N-Morfolino)etanosulfónicoSigma AldrichM-2933(MES); componente del tampón de activación
50x2,5x1 mm imanes, chapado en níquel (Ni-Cu-Ni), grado N52, magnetizado a través de 5mm (0,197") de espesorK& J MagneticsImanes personalizadosutilizados para el dispositivo de levitación magnética
Sellador de tubos capilares (Critoseal)Leica Microsystems267620Se utiliza para tapar los extremos de los tubos capilares Filtros de tubos de
centrífuga (Corning Costar, Spin-X)Sigma AldrichCLS8163Se utiliza para lavar cuentas
Compact Lab JackThorlabsLJ750Se utiliza para ajustar el dispositivo de levitación magnética
DPBS, sin calcio, sin magnesioGibco14190-144Solución para suspensiones de perlas
EtanolaminaSigma AldrichE9508-100MLSe utiliza durante una etapa de lavado de perlas
Tinción de membrana plasmática fluorescente (CellMask Green)InvitrogenC37608Se utiliza para teñir células Rh+
Gadoteridol InyecciónProHanceNDC 0270-1111-03Gadolinio (Gd3+); Solución magnética utilizada para suspender células
HBSS++Gibco14025-092Solución para la preparación de muestras
Complejo humano C5b,6Complement Technology, IncA122Se utiliza para generar glóbulos rojos Evs
Proteína C7 humanaComplement Technology, IncA124Se utiliza para generar glóbulos rojos Evs
Proteína C8 humanaSupplement Technology, IncA125Se utiliza para generar glóbulos rojos Proteína
C9 humanaEvs Tecnología del complemento, IncA126Se utiliza para generar RBC Evs
Mini Series Post CollarThorlabsMSR2Se utiliza para asegurar el dispositivo de levitación magnética a los gatos de laboratorio
N-(3-dimetilaminopropilo)-N′-clorhidrato de etilcarbodiimida SigmaAldrichE1769-10G(EDC); utilizado en la reacción de acoplamiento de anticuerpos
IgGde conejoR& D SystemsAB-105-CSe utiliza para recubrir perlas como condición de control
Solución salina tamponada con fosfato (solución 10X, pH 7.4)Boston BioproductsBM-220Componente del tampón de acoplamiento, utilizado para las etapas de lavado
Polisorbato 20 (Tween 20)Sigma AldrichP7949-500MLComponente del tampón de activación
Poliestireno CarboxilPolímero Bangs Laboratories PC06004Perlas de densidad superior (1,05 g/mL), utilizadas para el acoplamiento de anticuerpos
Conejo RhD Anticuerpo policlonalInvitrogenPA5-112694Se utiliza para recubrir perlas para la detección del factor Rh en los glóbulos rojos
Microscopio de grado de investigaciónOlympusProvis AX-70Microscopio utilizado para montar un dispositivo de levitación magnética y ver células levitantes
Pies amortiguadores de gomaThorlabsRDF1Se utiliza para apoyar la mesa de protoboard
Tubo cuadrado BoroVitroTubes8100-050Tubo capilar utilizado para cargar muestras en Maglev
Sulfo-NHSThermoscientific24510Utilizado en la reacción de acoplamiento de anticuerpos
Etapa traslacionalThorlabsPT1Se utiliza para enfocar y para escanear tubo capilar
Control normal de

References

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