Aquí describimos un método para visualizar la sinaptogénesis de las neuronas granulares en el cerebelo del ratón durante el curso del desarrollo cerebral postnatal cuando estas células refinan sus estructuras sinápticas y forman sinapsis para integrarse en el circuito cerebral general.
Artículo de método
Utilización de electroporación postnatal in vivo para estudiar la morfología de la neurona del gránulo cerebeloso y el desarrollo de la sinapsis
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Resumen
Resumen
Las neuronas experimentan cambios dinámicos en su estructura y función durante el desarrollo del cerebro para formar conexiones apropiadas con otras células. El cerebelo de roedores es un sistema ideal para rastrear el desarrollo y la morfogénesis de un solo tipo de célula, la neurona granulosa cerebelosa (CGN), a través del tiempo. Aquí, la electroporación in vivo de progenitores de neuronas granulares en el cerebelo de ratón en desarrollo se empleó para etiquetar escasamente las células para análisis morfológicos posteriores. La eficacia de esta técnica se demuestra en su capacidad para mostrar las etapas clave del desarrollo de la maduración de CGN, con un enfoque específico en la formación de garras dendríticas, que son estructuras especializadas donde estas células reciben la mayoría de sus entradas sinápticas. Además de proporcionar instantáneas de las estructuras sinápticas de CGN a lo largo del desarrollo cerebeloso, esta técnica se puede adaptar para manipular genéticamente las neuronas granulares de manera autónoma celular para estudiar el papel de cualquier gen de interés y su efecto en la morfología de CGN, el desarrollo de garras y la sinaptogénesis.
Introducción
El desarrollo del cerebro es un proceso prolongado que se extiende desde la embriogénesis hasta la vida postnatal. Durante este tiempo, el cerebro integra una combinación de estímulos intrínsecos y extrínsecos que esculpen el cableado de las sinapsis entre las dendritas y los axones para guiar finalmente el comportamiento. El cerebelo de roedores es un sistema modelo ideal para estudiar cómo se desarrollan las sinapsis porque el desarrollo de un solo tipo de neurona, la neurona granular cerebelosa (CGN), se puede rastrear a medida que pasa de una célula progenitora a una neurona madura. Esto se debe, en parte, al hecho de que la mayoría de la corteza cerebelosa se des....
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Protocolo
NOTA: Todos los procedimientos se realizaron bajo protocolos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Duke (IACUC).
1. Preparación del ADN para electroporación in vivo o IVE (1 día antes de la cirugía)
- Reúna los siguientes materiales: ADN purificado (0.5-25 μg por animal), acetato de sodio 3 M, etanol, colorante verde rápido, agua destilada ultrapura, solución tampón de fosfato (PBS) (consulte la Tabla de materiales).
NOTA: Para el ADN, se obtuvo de Addgene (FUGW, https://www.addgene.org/14883/) una construcción que expresa la proteína fluorescente verde (GFP) bajo....
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Resultados
Figura 4: Análisis de la morfología de las neuronas granulares durante el desarrollo cerebeloso. (A) Imágenes de proyección máxima de CGN electroporadas de 3-DPI a 14-DPI (edad postnatal P10 a P21), núcleos (azul) y GFP (verde); Las puntas de flecha indican dendritas individuales, y la barra de escala es de 10 μm. (B) Número promedio de dendritas. (.......
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Discusión
Las neuronas granulares cerebelosas son las neuronas más abundantes en el cerebro de los mamíferos, constituyendo casi el 60-70% de la población total de neuronas en el cerebro de roedores 1,14. El cerebelo ha sido ampliamente utilizado para dilucidar los mecanismos de proliferación celular, migración, formación de dendritas y desarrollo de sinapsis 6,9,10,11,15,16,17,18,19,20
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Divulgaciones
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
Agradecimientos
El trabajo fue apoyado por las subvenciones de los NIH R01NS098804 (A.E.W.), F31NS113394 (U.C.) y el Programa de Neurociencia de Verano (DG) de la Universidad de Duke.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Betadine | Purdue Producción | 67618-150-17 | |
| Cementado 10 µ Aguja L | Hamilton | 1701SN (80008) | Calibre 33, 1,27 cm (0,5 pulgadas), estilo de 4 puntos |
| Pollo anti-GFP | Millipore Sigma | AB16901 | Nuestro laboratorio utiliza este anticuerpo a una concentración de 1:1000 |
| Aplicador | |||
| Burro anti-pollo Cy2 | Jackson ImmunoResearch | 703-225-155 | Nuestro laboratorio utiliza este anticuerpo a una concentración de 1:500 |
| Etanol (200 prueba) | Koptec | V1016 | |
| Electroporador ECM 830 | BTX Harvard Apparatus | 45-0052 | |
| Fast Green FCF | Sigma | F7252-5G | |
| FUGW plásmido | Addgene | 14883 | |
| Portaobjetos de vidrio | VWR | 48311-703 | Superfrost plus |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Almohadilla térmica | Softheat | ||
| Hoescht 33342 tinte fluorescente | Invitrogen | 62249 | |
| Imaris | Bitplane | ||
| Isoflurano | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Micro cubreobjetos | VWR | 48382-138 | |
| Esmalte de uñas | Sally Hansen | Color 109 | |
| Normal cabra suero | Gibco | 16210064 | |
| O.C.T. compuesto de inclusión | Tissue-Tek | 4583 | |
| Olympus MVX10 Visor de disección | Olympus | MVX10 | |
| P200 punta de alcance de pipeta | Fisherbrand | 02-707-138 | Se utiliza para el espaciador de aguja |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| PBS pH 7.4 (10x) | Gibco | 70011-044 | |
| Trazador de neuritas simple | FIJI | https://imagej.net/Simple_Neurite_Tracer:_Basic_ Instrucciones | |
| Sacarosa | Sigma | S0389 | |
| Herramientas quirúrgicas | RWD Life Science | Tijeras y pinzas pequeñas | |
| Triton X-100 | Roche | 11332481001 | detergente no iónico |
| Pinzas BTX | Harvard Apparatus | 45-0489 | 5 mm, platino chapado en platino Electrodos tipo pinza |
| Agua destilada ultrapura | Invitrogen | 10977-015 | |
| Medios de montaje Vectashield | Vectashield | H1000 | |
| Vetbond adhesivo tisular | 3M | 1469SB | |
| Zeiss 780 Confocal vertical | Zeiss | 780 |
Referencias
- Altman, J., Bayer, S. A. Development of the cerebellar system : in relation to its evolution, structure, and functions. , CRC Press. (1997).
- Rahimi-Balaei, M., Bergen, H., Kong, J., Marzban, H. Neuronal migration during development of the cerebellum. Frontiers in....
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Formal Correction: Erratum: Utilizing In Vivo Postnatal Electroporation to Study Cerebellar Granule Neuron Morphology and Synapse Development
Posted by JoVE Editors on 4/06/2023. Citeable Link.
An erratum was issued for: Utilizing In Vivo Postnatal Electroporation to Study Cerebellar Granule Neuron Morphology and Synapse Development. A figure was updated.
Figure 2 was updated from:
Figure 2: In vivo cerebellar electroporation of granule neuron progenitors in P7 wildtype mouse pups. (A) Pups are anesthetized with 4% isoflurane delivered at a rate of 0.8L/min to ensure anesthesia throughout the injection of the DNA solution. Isoflurane is delivered at a rate of 0.8 L/min. (B) After sterilizing the mouse 3 times with betadine and 70% ethanol, an incision is made that spans the distance of the ears, revealing the hindbrain. (C) A magnified image of a white demarcation on the cranium, a landmark for the injection site. DNA construct should be injected within 1 mm above the mark; dotted lines outline the demarcation, and black arrow denotes the injection site. The ridges of the cerebellar vermis may be visible and can be useful for finding the injection site. (D) Tweezer-type electrode orientation for efficient electroporation. Plus (+) end must be oriented downwards to pull negatively charged DNA into the cerebellar parenchyma prior to administration of electrical pulses. (E) Test injection of 1 µL of a 0.02% Fast Green dye shows injection is localized to the middle of the cerebellar vermis between lobules 5-7. Please click here to view a larger version of this figure.
to:
Figure 2: In vivo cerebellar electroporation of granule neuron progenitors in P7 wildtype mouse pups. (A) Pups are anesthetized with 4% isoflurane delivered at a rate of 0.8L/min to ensure anesthesia throughout the injection of the DNA solution. Isoflurane is delivered at a rate of 0.8 L/min. (B) After sterilizing the mouse 3 times with betadine and 70% ethanol, an incision is made that spans the distance of the ears, revealing the hindbrain. (C) A magnified image of a white demarcation on the cranium, a landmark for the injection site. DNA construct should be injected within 1 mm above the mark; dotted lines outline the demarcation, and black arrow denotes the injection site. The ridges of the cerebellar vermis may be visible and can be useful for finding the injection site. (D) Tweezer-type electrode orientation for efficient electroporation. Plus (+) end must be oriented downwards to pull negatively charged DNA into the cerebellar parenchyma prior to administration of electrical pulses. (E) Test injection of 1 µL of a 0.02% Fast Green dye shows injection is localized to the middle of the cerebellar vermis between lobules 5-7. Please click here to view a larger version of this figure.