Inmunofenotipado Y Clasificación Celular De MKs Humanos De Fuentes Primarias Humanas O Diferenciados In Vitro De Progenitores Hematopoyéticos

Resumen

Aquí, presentamos una estrategia de inmunofenotipificación para la caracterización de la diferenciación de megacariocitos, y mostrar cómo esa estrategia permite la clasificación de megacariocitos en diferentes etapas con un clasificador de células activado por fluorescencia. La metodología se puede aplicar a tejidos primarios humanos, pero también a megacariocitos generados en cultivo in vitro.

Resumen

La diferenciación de megacariocitos (MK) abarca una serie de ciclos enddomíticos que dan lugar a una célula altamente poliploide (que alcanza incluso >64N) y extremadamente grande (40-60 μm). En oposición al conocimiento de rápido aumento en megakaryopoiesis en la biología celular y el nivel molecular, la caracterización del megakaryopoiesis por cytometry de flujo se limita a la identificación de MKs maduros usando marcadores superficiales linaje-específicos, mientras que las etapas anteriores de la diferenciación de MK siguen siendo inexploradas. Aquí, presentamos una estrategia de immunophenotyping que permita la identificación de las etapas sucesivas de la diferenciación del MK, con la situación ploidy cada vez mayor, en fuentes primarias humanas o culturas ines vitro con un panel que integra los marcadores superficiales específicos y no específicos del MK. A pesar de su tamaño y fragilidad, los MKs pueden ser inmunofenotipadas usando el panel antes mencionado y enriquecidas por la clasificación celular activada por fluorescencia bajo condiciones específicas de presión y diámetro de boquilla. Este enfoque facilita los estudios multi-Ómicos, con el objetivo de comprender mejor la complejidad de la megacariopoyesis y la producción de plaquetas en los seres humanos. Una mejor caracterización del megakaryopoiesis puede plantear fundamental en la diagnosis o el pronóstico de patologías y de malignidad linaje-relacionadas.

Introducción

Los megacariocitos (MKs) se desarrollan a partir de células madre hematopoyéticas (HSCs) siguiendo un proceso complejo llamado megacariopoyesis, que es orquestado principalmente por la hormona trombopoyetina (TPO). La visión clásica de la megacariopoyesis describe el viaje celular desde las HSCs a través de una sucesión de etapas jerárquicas de progenitores comprometidos y células precursoras, lo que conduce en última instancia a un MK maduro. Durante la maduración, los MKs experimentan múltiples rondas de endomitosis, desarrollan un intrincado sistema de membrana de demarcación intracelular (DMS), que proporciona suficiente superficie de membrana para la producción de plaquetas, y producen y empaquetan eficientemente la plétora de factores que están contenidos en los diferentes gránulos heredados por las plaquetas maduras^1,2,3. Como resultado, los MKs maduros son células grandes (40-60 μm) caracterizadas por un núcleo altamente poliploide (alcanzando incluso >64N). Estudios recientes sugieren rutas alternativas por las cuales las HSCs se diferencian en MKs evitando los puntos de control de compromiso de linaje tradicional en respuesta a ciertas condicionesfisiopatológicas^{4,5,6,7,8,9,10,11.} Estos hallazgos ponen de relieve que la diferenciación hematopoyética hacia el MK maduro es un proceso continuo y adaptativo que responde a las necesidades biológicas.

Con el creciente conocimiento sobre la biología celular y los aspectos moleculares que caracterizan la megacariopoyesis^12,la mayor parte de las investigaciones dedicadas al estudio del proceso por citometría de flujo se limitan a la identificación de MKs maduros utilizando marcadores de superficie específicos del linaje(es decir, CD42A/B, CD41/CD61), mientras que las etapas anteriores de diferenciación mk permanecen inexploradas. Hemos documentado previamente una estrategia para escenificar megacariopoyesis en cultivos de MK derivados de la médula ósea de ratón y de la médula ósea^13,14,que hemos adaptado y aplicado a los seres humanos^15. En el presente artículo mostramos una estrategia de inmunofenotipificación que permite la caracterización de megacariopoyesis, desde HSCs hasta MKs maduros, en fuentes primarias humanas (médula ósea -BM- y sangre periférica -PB-) o cultivos in vitro mediante un panel que integra marcadores de superficie específicos e inespecíficos (CD61, CD42B, CD49B, CD31, KIT y CD71, entre otros). A pesar de su gran tamaño y fragilidad, los MKs pueden ser immunophenotyped usando los marcadores antedichos de la superficie de la célula y enriquecidos por la clasificación fluorescencia-activada de la célula bajo condiciones específicas del diámetro de la presión y de la boquilla para reducir al mínimo la ruptura y/o el daño de la célula. Esta técnica facilita los enfoques multi-Ómicos, con el objetivo de comprender mejor la complejidad de la megacariopoyesis y la producción de plaquetas en la salud humana y la enfermedad. Cabe destacar que se planteará como una herramienta útil para ayudar al diagnóstico y pronóstico en un contexto clínico de creciente demanda.

En este manuscrito documentamos una estrategia para escenificar la megacariopoyesis humana con un panel que integra marcadores de superficie mk-específicos e inespecíficos de fuentes primarias o generadas in vitro. Además, proporcionamos un protocolo para clasificar, con un clasificador de células activado por fluorescencia, las fracciones preferidas y MKs maduros(Figura 1). Este paso no es popular, ya que es técnicamente difícil debido al gran tamaño y la fragilidad de los MKs. Sin embargo, se ha empleado tanto en muestras de ratón como de médula ósea humana con anterioridad, y debido al avance tecnológico, con un mejor resultado cada vez^16,17,18. Las fuentes primarias humanas donde se pueden estudiar los precursores de MKs o MK incluyen médula ósea, sangre del cordón umbilical y sangre periférica, entre otras. El procesamiento adecuado de la muestra para aislar la fracción celular relevante para el análisis en cada muestra es de importancia. Se incorporan procedimientos estándar, con algunas consideraciones a tener en cuenta a la hora de apuntar al estudio de la megacariopoyesis.

Protocolo

Las muestras de sangre entera y médula ósea se obtuvieron y procesaron de conformidad con la Declaración de Helsinki de 1964. Se obtuvieron muestras de sangre entera de donantes sanos tras la concesión del consentimiento informado (ISPA), dentro de un estudio aprobado por nuestro comité ético médico institucional (Hospital Universitario Central de Asturias -HUCA-). Se obtuvieron muestras de médula ósea a partir de material de descarte aspirado de médula ósea de pacientes manejados en el Departamento de Hematología del Hospital Clínico San Carlos (HCSC).

Figura 1: Representación esquemática del protocolo documentado en este manuscrito. Las fuentes humanas primarias o las culturas primarias donde la diferenciación del MK se puede organizar usando immunophenotyping se indican. Esta estrategia de inmunofenotipado se puede aplicar al estudio del proceso en diferentes patologías relacionadas con el linaje o malignidad en fuentes primarias. Además, hace posible la clasificación celular de MKs y precursores con un clasificador de células activado por fluorescencia, que permite un análisis adicional de fracciones enriquecidas. Las imágenes utilizadas son parte de Servier Medical Art (SMART) de Servier y están licenciadas bajo CC BY 3.0. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

1. Procesamiento de la sangre entera y la médula ósea antes de la inmunofenotipado

1. Cuando se utiliza sangre entera (WB) de donaciones como fuente primaria, opcionalmente aislar el componente de células mononucleares de sangre periférica (PBMC). Esto puede lograrse mediante el uso de la centrifugación diferencial estándar combinada con la separación celular del gradiente de densidad, como se describió anteriormente¹⁵.
   1. En resumen, centrífuga sangre a 193 x g durante 15 min (freno 3) a temperatura ambiente. Deseche la fracción plasmática superior y recoja el anillo buffy. Diluir 1:1 con tampón de fosfato solución salina (PBS)/Citrato trisódico Dihidratado (38 g/L, pH 7) tampón y pipetear cuidadosamente un volumen de 25 mL sobre 15 mL de una solución de gradiente de densidad (1.076 g/mL) en tubos de 50 mL.
   2. Centrífuga durante 20 min a 1114 x g (acelerador 3, freno 3, temperatura ambiente). Deseche la fracción plasmática y recoja el anillo buffy que contiene PBMCs. Lave agregando el mismo volumen de PBS, centrífuga a 435 x g durante 5 min y resuspend en PBS para su uso posterior.
2. Alternativamente, use una muestra de WB (alrededor de 100 μL) para inmunofenotipificación después de lisear los glóbulos rojos (glóbulos rojos) y un lavado exhaustivo.
   1. En resumen, diluir 1:1 en tampón de lechado de RBC helado (4,15 g de NH₄Cl, 0,5 g de_{KHCO 3} y 18,5 mg de EDTA (triplex III) a 500 mL de H₂O, pH 7,1-7,4). Espere hasta que la suspensión celular se vuelva roja translúcida (3-5 min).
   2. Centrifugar a 435 x g durante 5 min, a 4 °C, y resuspend las células en PBS. Repita el procedimiento tantas veces como sea necesario para obtener un pellet de células blancas.
3. Del mismo modo, procesar directamente las muestras obtenidas de médula ósea (aspiración) con tampón de lelising RBC (ver punto 1.2) y lavado a fondo, como para comenzar con una suspensión unicelular clara (Figura 1).
   1. Evite el uso de vórtice para mezclar muestras durante el procesamiento, ya que puede dañar los MKs frágiles. Mezcle moviendo o invirtiendo el tubo.
      NOTA: Gradiente de densidad para obtener PBMCs puede resultar en una fracción de célula más rica y más limpia en comparación con RBC-lysed WB. Sin embargo, debemos tener en cuenta que los MKs maduros de alta densidad podrían perderse en la fracción de "neutrófilos". Esto se discutirá en los resultados representativos.

2. Diferenciación in vitro de MK de PBMCs

NOTA: Los MKs se pueden diferenciar in vitro de precursores anteriores, tales como células CD34+, presentes en diversas fuentes primarias(es decir, WB/PBMCs, sangre de cordón umbilical, médula ósea) y de iPSCs. Existen diferentes protocolos que se han aplicado a este fin. Aquí, utilizamos un método de cultivo desarrollado por nosotros que permite la diferenciación MK de PBMCs, sin necesidad de enriquecer para CD34+ precursores^{15,19,20,21,22.}

1. Este protocolo consta de tres fases de cultivo, donde la concentración de trombopoyetina (TPO) aumenta gradualmente a expensas de factores de crecimiento que favorecen la proliferación de precursores anteriores(es decir,SCF, EPO), que disminuyen gradualmente(Figura 2)^15.
   1. Para el medio base, utilice StemSpan SFEM complementado con 0.4% de mezcla de lípidos ricos en colesterol y 1% Penicilina / Estreptomicina.
      1. Para el medio de fase I, utilice el medio base complementado con SCF (100 ng/mL), eritropoyetina (EPO, 0,5 U/mL) y trombopoyetina (TPO, 30 ng/mL). El medio de fase II es el medio base complementado con SCF (50 ng/mL), EPO (0,25 U/mL) y TPO (50 ng/mL). Para el medio de fase III, utilice el medio base complementado con TPO (100 ng/mL).
   2. Cultivo de PBMCs en fase I medio. En el día 6-8, coloque los PBMCs en el medio de la fase II, y en el día 9-12 coloque los PBMCs en el medio de la fase III.
   3. Reemplace el medio centrifucando las células a 435 x g durante 5 min a temperatura ambiente de la Fase I a la Fase II, y a 95 x g durante 5 min a temperatura ambiente de la Fase II a la Fase III, y reemplándolas en medio fresco.
   4. Cultivar células en una incubadora a 37 °C, 5% de_CO2. En estos cultivos primarios, la diferenciación MK dura 10-14 días, y las muestras se pueden extraer en diferentes puntos de tiempo a lo largo del período de cultivo, como para seguir la diferenciación MK.

Figura 2:Representación esquemática del método de cultivo MK derivado de PBMC. Los PBMCs de donantes sanos fueron cultivados según el protocolo trifásico desarrollado por nosotros para generar MK in vitro (esquema adaptado de Salunkhe et al). Se muestran ¹⁵ fotos tomadas en el día 10 y el día 13 de la cultura. Las fotos se toman con un objetivo de 20X. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

2. Recolección de muestras: Lave las células aplicando centrifugación a baja velocidad durante 5 min (95 x g) y resuspón en PBS o PBS que contenga 1% de albúmina sérica bovina (BSA). Para el inmunofenotipado, la densidad ideal es de 10⁵-10⁶ células/100 μL (véase el punto 3.1). Dependiendo del estado de los cultivos(es decir, presencia de células muertas, escombros, etc.), pueden ser necesarios 1 o 2 lavados. Recoger sus células en los puntos de tiempo de interés durante el cultivo.

3. Immunophenotyping de la diferenciación de MK - incubación con un panel de tagged-anticuerpos

1. Incubar las muestras de células con un panel de anticuerpos marcados siguiendo los procedimientos estándar, prestando atención a la centrífuga a baja velocidad (95 x g) al procesar megacariocitos. Normalmente incubamos las muestras con BSA al 1% en PBS en volúmenes de 100 μL a 4 °C, 20 min, con un rango de 10⁵-10⁶ células.
2. Escale verticalmente cuando sea necesario.
3. Después de la incubación, añadir 5 mL de BSA al 1% en PBS, centrífuga a baja velocidad (95 x g), aspirar el sobrenadante y resuspendir la muestra en BSA al 2% en PBS para preservar la viabilidad de MK (2 mL). Agregue 1-5 mM EDTA para interrumpir los agregados célula-célula (que se ven naturalmente en las culturas mk).
4. Transfiera las muestras a un tubo inferior redondo de 12 x 75 mm (tubo FACS) o placa, manteniéndolas en la oscuridad hasta el análisis de citometría de flujo o la clasificación celular.
5. Preparación de los anticuerpos individuales y mezclas de panel de anticuerpos; configuración del citómetro de flujo:
   1. Valorar los anticuerpos antes de su uso para determinar la concentración óptima en los paneles de anticuerpos. La concentración óptima de anticuerpos es la concentración más baja que separa las células claramente positivas de las negativas (y permite la distinción de los niveles intermedios de expresión). Por ejemplo, la mayoría de los anticuerpos se utilizan en una dilución 1:200 (stock 100 μg/mL) a menos que el fabricante valore o indique lo contrario.
   2. Una vez que se determina la titulación de anticuerpos, prepare una dilución de 10x de cada anticuerpo. Estas diluciones se utilizan para los controles de un solo color y para preparar las mezclas de paneles. Las diluciones y las mezclas de paneles están bien para su uso incluso un mes después de la preparación (almacenadas a 4 °C, a menos que las indicaciones del fabricante impidan estas condiciones de almacenamiento). Esto permite la tinción de muestras con el mismo panel a través de un período de tiempo.
   3. Utilice 10 μL por cada 100 μL de la dilución 10x tanto para los controles de un solo color como para la mezcla de paneles.
      1. Para los controles de un solo color, utilice perlas de afinidad de anticuerpos, que se pueden medir directamente después de agregar el anticuerpo. Los controles de un solo color deben medirse con cada experimento, para permitir un ajuste de compensación adecuado (y ajustar la medición posterior con el software de análisis).
      2. Como alternativa, realice los controles de un solo color con muestras de celda. Sin embargo, las perlas permiten la medición rápida de un número dado de eventos, que, dependiendo del marcador de anticuerpos /superficie, podrían no ser posibles de obtener en fuentes celulares primarias o cultivadas complejas. También recomendamos ejecutar muestras de células teñidas con mezclas de panel "Fluorescencia Menos Uno" (FMO) para configurar los ajustes de compensación apropiados (antes de ejecutar experimentos). Esto es relevante para identificar cuidadosamente los problemas de compensación, y especialmente, en los MKs cultivados, para identificar la interferencia de autofluorescencia (que estará presente si se utiliza un medio de cultivo que contiene rojo fenol).
   4. Prepare suficiente volumen de la mezcla del panel, dependiendo del número de muestras, que contiene los anticuerpos del panel diseñado. La mayoría de nuestros paneles incluyen seis anticuerpos (paneles de 6 colores, ver Tablas 1-2).
   5. Para estos paneles, utilice láseres de 488 nm y 633 nm del citómetro de flujo, sin embargo, los paneles se pueden adaptar a otros escenarios técnicos. Además, las consideraciones de compensación pueden obviarse cuando se utiliza citometría de flujo basada en espectrometría de masas o citómetros con tecnología de enfoque acústico.
      1. Los colorantes para medir la viabilidad pueden dar información falsa con respecto a los MKs, especialmente cuando maduran. Los MKs son células de uptaking muy activas, y la positividad con Hoechst, 7-AAD o PE, pudo no reflejar siempre muerte celular real. Una alternativa (si se requiere la medida de la muerte celular) pudo ser el uso de las manchas de la mitocondria (CMX Ros) o de los tintes reactivos de la amina (tintes del zombi o del fantasma).

Tabla 1: Notas sobre los marcadores de superficie celular del linaje megacariocítico Haga clic aquí para descargar esta Tabla.

Tabla 2: Paneles de anticuerpos Haga clic aquí para descargar esta Tabla.

4. Análisis ploidy combinado con paneles de 6 colores

1. Para el análisis de ploidía, en combinación con un panel de anticuerpos de 6 colores, proceda con la fijación y permeabilización de las células después de la incubación con el panel de anticuerpos. Esta estrategia permitirá la preservación de la tinción del marcador superficial, al tiempo que permitirá la tinción del ADN de las células. Utilizamos Hoechst 33342 para teñir adn, ya que se puede visualizar con el láser violeta de 405 nm disponible.
2. Para 10⁵-10⁶ células, después de la incubación con el panel de anticuerpos, centrífuga las células (95 x g durante 5 min), resuspend en 200 μL de tampón de fijación e incubar 10 min a temperatura ambiente (RT).
3. Las células centrífugas como se indicó anteriormente, resuspended por segunda vez en 200 μL de tampón de fijación, e incubar otros 10 min en RT.
4. Preparar tampón de permeabilización, que contenga 0,1% de Tritón X-100, 200 mg/mL de ARNasa y 20 mg/mL de Hoechst 33342 (permeabilización De Hoechst MIX).
5. Centrífuga de células como las anteriores, resuspend en 300 μL de la permeabilización Hoechst MIX e incubar 30 min a 37 °C. Este paso es muy importante, ya que, para obtener una medición de ploidía limpia, el ARN tiene que ser degradado.
6. Después del tiempo de incubación, mida las muestras directamente con un citómetro de flujo. De lo contrario, mantenga las muestras a 4 °C, en la oscuridad. Mídalos con prontitud. Sin embargo, dado que estas muestras son fijas, la medición puede retrasarse incluso 24-48 horas. Asegúrese de que la muestra se deslice bien antes de la medición, o se pase a través de un colador celular, para asegurar una suspensión de una sola célula.
   1. Los parámetros morfométricos como Forward y Side Scatter no se mantienen después de la fijación de celdas. La gráfica de dispersión hacia adelante/lateral mostrará una contracción de la distribución de celdas después de la fijación. Sin embargo, la tinción del marcador superficial se conserva en su mayor parte, y la estrategia de gating apenas se altera, lo que permite el análisis del estado de ploidía en las diferentes etapas de diferenciación definidas por combinaciones de marcadores de superficie.

5. Análisis de diferenciación MK

NOTA: Hemos visto que la combinación de CD31/CD71 permite establecer un número de puertas que corresponden a diferentes etapas de la diferenciación MK. El back-gating adicional con los marcadores MK-específicos permite la separación de MKs maduros e inmaduros. Además, en muestras frescas, el back-gating para verificar la presencia de otros marcadores utilizados, o para colocar las poblaciones en los ejes Forward/Side Scatter, refina la evaluación de las etapas de diferenciación mk y permite descartar otros tipos de células que podrían estar presentes en las mismas poblaciones.

1. Utilizar un panel de anticuerpos que incluya marcadores precursores tempranos (KIT, CD34), marcadores precursores comunes (CD31, CD71) y marcadores de linaje, algunos de ellos específicos (CD42A/CD42B, CD49B, CD41/CD61, CLEC2, GPVI, etc.) (ver Tablas 1-2). El uso del cóctel Lineage (Lin) (CD3, CD14, CD16, CD19, CD20 y CD56), también permite "filtrar" las células hematopoyéticas maduras que podrían agregar ruido al análisis (al seleccionar la^población lin). Como ejemplo, vamos a ir a través del análisis de MKs en PBMCs, médula ósea y a través de cultivos celulares derivados de PBMC en los resultados representativos.

6. Clasificación de células precursoras MK y MK

NOTA: Las células teñidas fueron analizadas y clasificadas en un clasificador de células activado por fluorescencia FACS Aria IIu equipado con láseres de estado sólido estándar de 488 nm y 633 nm utilizando el software FACSDiva; Los datos fueron analizados y presentados adicionalmente usando el software FlowJo y Cytobank (análisis viSNE). La pureza de las fracciones clasificadas se confirmó mediante el análisis citométrico de flujo de cada una de las fracciones clasificadas (pureza superior al 85%).

1. Realice la clasificación celular tan pronto como sea posible o dentro de 1 hora después de la incubación de anticuerpos para evitar el deterioro celular.
2. Filtre la muestra con un colador de celdas de 100 μm para asegurar la suspensión de una sola célula y la integridad de los MK grandes.
3. Utilice una boquilla de cerámica de 130 μm, una presión de vainilla establecida en 11 libras por pulgada cuadrada (PSI) y la frecuencia de accionamiento de caída establecida en 12 kHz para romper la corriente en gotas.
4. Antes de clasificar, esterilice la boquilla, la vaina y las líneas de muestra realizando una adquisición de 30 minutos con penicilina/estreptomicina diluida 1:5 en agua estéril, seguida de una adquisición de 10 minutos con agua estéril para eliminar el descontaminante restante.
5. Una vez que la secuencia se ha estabilizado, ajuste el drop-delay con los rebordes recomendados para ordenar en modo de ajuste fino más el de 97,5% de las caídas reflejadas a un caudal de 400-1200 eventos por segundo.
6. Preparar tubos FACS de recolección con 500 μL de BSA al 2% en PBS. El porcentaje de BSA se puede aumentar hasta 5-10%.
7. Genere la plantilla de experimento con los parámetros de matriz de compensación adecuados.
8. Cargue el tubo FACS en el citómetro.
9. Realice una medición de la muestra para establecer las puertas deseadas y la pureza de las poblaciones de células objetivo. Mantenga el registro activado para mostrar hasta 200.000 eventos en las puertas de población seleccionadas durante la ordenación de celdas.
10. FACS Aria IIu permite la separación de hasta 4 poblaciones celulares diferentes al mismo tiempo. Cree un nuevo diseño de ordenación y seleccione el dispositivo de recolección (4 tubos) y el modo de precisión adecuado (se recomienda una máscara intermedia de pureza y recuperación). Finalmente, agregue las poblaciones de interés a cada campo de ubicación de ordenación (Figura 3).

Figura 3:Representación esquemática del principio de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). Las partículas pasan a través de la boquilla de 130 μm y se ven obligadas a romperse en una corriente de gotitas regulares debido a la aplicación de vibración a la boquilla. A continuación, las gotitas son interrogadas por el láser (punto de análisis) y las señales se procesan para dar la ''decisión de clasificación" mediante la aplicación de una carga a esas gotitas. Cuando una gota de carga pasa a través de un campo electrostático de alto voltaje (placa de detección), se desvía y se recoge en el tubo de recogida correspondiente. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

11. Cargue los tubos de recolección y comience a ordenar las poblaciones objetivo.
12. Centrifugar los tubos de recolección durante 5 minutos a 95 x g y resuspend el pellet celular en el volumen apropiado de BSA al 2% en PBS.
13. Mida de nuevo una fracción de cada muestra ordenada, para calcular la pureza.
14. Almacene las celdas adecuadamente para su uso posterior. Las células clasificadas se pueden utilizar para análisis citológicos y moleculares, o pueden ser re-cultivadas con el objetivo de estudiar el proceso de diferenciación de una población celular seleccionada.

7. Preparación de la muestra posterior a la clasificación

1. Preparación de citoespinas para análisis citológicos con citocentrífuga
   1. Lleve las celdas ordenadas a un volumen de trabajo fácil de manejar de 100-200 μL. Tenga en cuenta que la densidad celular dependerá del rendimiento de la población ordenada en cada caso.
   2. Coloque una guía limpia en el soporte metálico y coloque una parte superior del filtro. Recuerde etiquetar la diapositiva y el filtro para evitar mezclar muestras.
   3. Agregue 100 μL de PBS en el orificio del filtro contra la diapositiva, para que el filtro se humidifique en el borde del orificio.
   4. Coloque el embudo, cierre el soporte metálico y colóquelo en su lugar en la centrífuga.
   5. Agregue la muestra (100-200 μL) dentro del embudo.
   6. Centrífuga a 36 x g durante 5 minutos. Los portaobjetos de citoespino se pueden dejar secar al aire en RT (debidamente cubiertos para evitar el polvo) y se pueden mantener en RT durante 1 semana antes de la inmunotensación o histoquímica.
2. Para inmunosutensiones
   1. Fijar diapositivas en paraformadehído al 2% (PFA) diluido en PBS e incubar durante 5min.
      1. Se puede utilizar un rango de 0.5-4% de PFA en PBS. En nuestras manos, utilizamos el 4% para obtener la fijación apropiada de tejidos o de algunos tipos de la célula, y 0.5% PFA en PBS es suficiente para las plaquetas. Al configurar esta técnica, el porcentaje correcto de PFA requiere optimización por tipo de celda/origen.
   2. Incubar 5 min en PBS.
   3. Incubar 5 min en etanol al 50% (EtOH).
   4. Incubar 5 min en EtOH al 70%.
   5. Conservar en EtOH al 70% a -20ºC.
   6. Al realizar la inmunotensación, rehidrate y siga los procedimientos estándar (permeabilización, lavado, bloqueo, incubaciones de anticuerpos primarios y secundarios, preservación, etc.).
3. Para citoquímica:
   NOTA: Los portaobjetos se pueden teñir con tinción de May-Grünwald Giemsa o la tinción conveniente para cada propósito.
4. Para el examen inmediato de la morfología
   1. Agregue una gota de medio de montaje en el punto que contiene la célula del cytospin y coloque un cubrebocas.
   2. Mantenga las guías a 4 °C no más de una semana, a menos que estén selladas, lo que permite el almacenamiento a largo plazo incluso en RT. El montaje de fijación media permite el almacenamiento a largo plazo en RT.

Resultados

Médula ósea y ploidía
En la Figura 4, mostramos un análisis representativo de inmunofenotipado de megacariopoyesis en muestras de BM (aspiración) de pacientes. Al trazar la fracción celular contra CD71 y CD31, hemos bloqueado seis poblaciones principales: CD31^- CD71^- (rojo), CD31^- CD71⁺ (azul), CD31⁺ CD71^- (naranja), CD31⁺ CD71^medio (verde claro), CD31⁺ CD71...

Discusión

La mayor parte de la investigación centrada en el estudio de la megacariopoyesis por citometría de flujo se limita hasta la fecha a la identificación de subconjuntos de MK utilizando sólo marcadores de superficie específicos del linaje(es decir,CD42A/CD42B, CD41/CD61), mientras que las etapas anteriores de diferenciación de MK han sido mal examinadas. En el actual artículo mostramos una estrategia immunophenotyping para dirigir una caracterización cytometry de flujo comprensiva del megakaryopoiesis humano. En ge...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Boquilla de 130 micras	BD	643943	necesaria para la clasificación MK
5810R Centrífuga	Eppendorf		Aislamiento de células y lavados
A-4-62 Rotor de cubo oscilante	Eppendorf		Aislamiento de células y lavados
Aerospray Pro Hematology Tinción de portaobjetos / Citocentrífuga	ELITech Group		Dispositivo de citología automatizado, donde los portaobjetos se tiñen con Mat-Gr& uuml; nwald Giemsa
CO2 Incubadora Galaxy 170	S Eppendorf		Incubación de células
Cytospin 4 Citocentrífuga	Thermo Scientific		Para preparar los citospins Clasificador
FACSAria IIu	BD		Láseres 488 nm y 633 nm
Citómetro de flujo FACSCanto II	BD		Lasers 488 nm , 633 nm y 405 nm
Microscopio Olympus BX 41	Microfotografías Olympus
Microscopio Olympus BX 61	Microfotografías Olympus
Zoe Generador de imágenes de células fluorescentes
Para obtener PBMC
	Tecnologías	#07801	o similar
Penicilina-Estreptomicina	Sigma-Aldrich	P4333	o similar
Eritropoyetina humana recombinante (EPO)	R& D Systems	287-TC-500	o similar
Factor de células madre humanas recombinantes (SCF)	Thermo Fisher Scientific, Gibco™	PHC2115	o similar
Trombopoyetina humana recombinante (TPO)	Thermo Fisher Scientific, Gibco™	PHC9514	o agonistas del receptor TPO
StemSpan SFEM	Stem Cell Technologies	#09650
Análisis de citometría de
Albúmina sérica bovina	Merck	A7906-100G	o similar
BD CompBead Anti-Mouse Ig, κ/Compensación de control negativo Conjunto de partículas	BD	552843	Los anticuerpos para las células humanas son generalmente de ratón.
BD Cytofix/Cytoperm	BD	554714	o similar
BD FACS Accudrop Beads	BD	345249
CD31 AF-647	BD	561654	Ratón antihumano
CD31 FITC	Immunostep	31F-100T
CD34 FITC	BD	555821	Ratón antihumano
CD41 PE	BD	555467	Ratón antihumano
CD41 PerCP-Cy5.5	BD	333148	Ratón anti-humano
CD42A APC	Immunostep	42AA-100T	Observamos... que debe evaluarse
CD42A PE	BD		Ratón antihumano
CD42B PerCP Biolegend		303910	Ratón antihumano
CD49B PE	BD		Ratón
antihumano CD61 FITC	BD	555753	Ratón antihumano
CD71 APC-Cy7	Biolegend	334109	Ratón antihumano
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H3570
Bloque BD Fc Humano	Bloqueo BD	564219	Fc - KIT
de control PE-Cy7	Biolegend	313212	Ratón antihumano
Lineage Cocktail 2 FITC	BD	643397	Ratón anti-ARNasa
	Merck	R6513	o similar
Triton X-500	Merck	93443-500ML	o similar
Filtros de células para la
CellTrics Filtros 100 micrómetros	Sysmex	04-004-2328	Filtros de células
Nota: no especificamos reactivos/productos químicos generales (PBS, EDTA, etc.) o desechables (tubos, etc.), ni reactivos especificados en protocolos estándar y publicados anteriormente, a menos que se especifique lo contrario.