Inmunofenotipado Y Clasificación Celular De MKs Humanos De Fuentes Primarias Humanas O Diferenciados In Vitro De Progenitores Hematopoyéticos

Andrea Acebes-Huerta; Patricia Martínez-Botía; Cristina Martín Martín; Ángel Bernardo; Adrián R. Rodríguez; María Carmen Vicente-Ayuso; Celina Benavente Cuesta; Laura Gutiérrez

doi:10.3791/62569

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Artículo de método

Inmunofenotipado Y Clasificación Celular De MKs Humanos De Fuentes Primarias Humanas O Diferenciados In Vitro De Progenitores Hematopoyéticos

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DOI:

10.3791/62569

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7 de agosto de 2021

Andrea Acebes-Huerta¹ , Patricia Martínez-Botía¹ , Cristina Martín Martín² , Ángel Bernardo¹^,³ , Adrián R. Rodríguez¹ , María Carmen Vicente-Ayuso⁴ , Celina Benavente Cuesta⁵ , Laura Gutiérrez¹^,⁶

¹Platelet Research Lab, Instituto de Investigación Sanitaria del Principado de Asturias (ISPA), ²Flow Cytometry and Cell Sorting Platform (ISPA), ³Clinical Diagnosis Laboratory - Dept. of Hematology, Hospital Universitario Central de Asturias (HUCA), ⁴Department of Hematology, Hospital Universitario Severo Ochoa (HUSO), ⁵Department of Hematology, Instituto de Investigación Sanitaria San Carlos (IdISSC), Hospital Clínico San Carlos (HCSC), ⁶Dept. of Medicine, University of Oviedo

En este artículo

Resumen

Aquí, presentamos una estrategia de inmunofenotipificación para la caracterización de la diferenciación de megacariocitos, y mostrar cómo esa estrategia permite la clasificación de megacariocitos en diferentes etapas con un clasificador de células activado por fluorescencia. La metodología se puede aplicar a tejidos primarios humanos, pero también a megacariocitos generados en cultivo in vitro.

Resumen

La diferenciación de megacariocitos (MK) abarca una serie de ciclos enddomíticos que dan lugar a una célula altamente poliploide (que alcanza incluso >64N) y extremadamente grande (40-60 μm). En oposición al conocimiento de rápido aumento en megakaryopoiesis en la biología celular y el nivel molecular, la caracterización del megakaryopoiesis por cytometry de flujo se limita a la identificación de MKs maduros usando marcadores superficiales linaje-específicos, mientras que las etapas anteriores de la diferenciación de MK siguen siendo inexploradas. Aquí, presentamos una estrategia de immunophenotyping que permita la identificación de las etapas sucesivas de la diferenciación del MK, con la situación ploidy cada vez mayor, en fuentes primarias humanas o culturas ines vitro con un panel que integra los marcadores superficiales específicos y no específicos del MK. A pesar de su tamaño y fragilidad, los MKs pueden ser inmunofenotipadas usando el panel antes mencionado y enriquecidas por la clasificación celular activada por fluorescencia bajo condiciones específicas de presión y diámetro de boquilla. Este enfoque facilita los estudios multi-Ómicos, con el objetivo de comprender mejor la complejidad de la megacariopoyesis y la producción de plaquetas en los seres humanos. Una mejor caracterización del megakaryopoiesis puede plantear fundamental en la diagnosis o el pronóstico de patologías y de malignidad linaje-relacionadas.

Introducción

Los megacariocitos (MKs) se desarrollan a partir de células madre hematopoyéticas (HSCs) siguiendo un proceso complejo llamado megacariopoyesis, que es orquestado principalmente por la hormona trombopoyetina (TPO). La visión clásica de la megacariopoyesis describe el viaje celular desde las HSCs a través de una sucesión de etapas jerárquicas de progenitores comprometidos y células precursoras, lo que conduce en última instancia a un MK maduro. Durante la maduración, los MKs experimentan múltiples rondas de endomitosis, desarrollan un intrincado sistema de membrana de demarcación intracelular (DMS), que proporciona suficiente superficie de membrana para la producción d....