Artículo de método

Identificación de proteínas de inmunidad antibacteriana en Escherichia coli utilizando MALDI-TOF-TOF-MS/MS y análisis proteómico de arriba hacia abajo

DOI:

10.3791/62577

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23 de mayo de 2021

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1Produce Safety & Microbiology, Western Regional Research Center, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture

En este artículo

Resumen

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Aquí presentamos un protocolo para la identificación rápida de proteínas producidas por bacterias patógenas secuenciadas genómicamente utilizando espectrometría de masas en tándem MALDI-TOF-TOF y análisis proteómico de arriba hacia abajo con software desarrollado internamente. Los iones proteicos metaestables se fragmentan debido al efecto del ácido aspártico y esta especificidad se explota para la identificación de proteínas.

Resumen

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Este protocolo identifica las proteínas de inmunidad de las enzimas bactericidas: colicina E3 y bacteriocina, producidas por una cepa patógena de Escherichia coli mediante inducción antibiótica, e identificadas por espectrometría de masas en tándem MALDI-TOF-TOF y análisis proteómico de arriba hacia abajo con software desarrollado internamente. La proteína de inmunidad de la colicina E3 (Im3) y la proteína de inmunidad de la bacteriocina (Im-Bac) se identificaron a partir de iones prominentes de fragmentos de tipo b y / o y generados por la escisión de la columna vertebral polipeptídica (PBC) en el lado C-terminal del ácido aspártico, el ácido glutámico y los residuos de asparagina por el mecanismo de fragmentación del efecto del ácido aspártico. El software escanea rápidamente secuencias de proteínas in silico derivadas de la secuenciación del genoma completo de la cepa bacteriana. El software también elimina iterativamente los residuos de aminoácidos de una secuencia de proteínas en caso de que la secuencia de proteínas maduras se trunca. Una sola secuencia de proteínas poseía iones de masa y fragmento consistentes con los detectados para cada proteína de inmunidad. La secuencia candidata se inspeccionó manualmente para confirmar que se podían asignar todos los iones de fragmento detectados. La metionina N-terminal de Im3 fue eliminada post-traslacionalmente, mientras que Im-Bac tenía la secuencia completa. Además, encontramos que solo dos o tres iones de fragmentos no complementarios formados por PBC son necesarios para identificar la secuencia de proteínas correcta. Finalmente, se identificó un promotor (caja SOS) aguas arriba de los genes antibacterianos y de inmunidad en un genoma plásmido de la cepa bacteriana.

Introducción

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El análisis e identificación de proteínas no digeridas por espectrometría de masas se conoce como el análisis proteómico de arribahacia abajo 1,2,3,4. Ahora es una técnica establecida que utiliza ionización por electrospray (ESI)5 y analizadores de masa de alta resolución6,y técnicas sofisticadas de disociación, por ejemplo, disociación por transferencia de electrones (ETD), disociación por captura de electrones (ECD)7,fotodesociación ultravioleta (UV-PD)8,etc.

La otra técnica de ionización suave es la desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI)9,10,11 que se ha utilizado menos ampliamente para el análisis de arriba hacia abajo, en parte porque está acoplada principalmente a analizadores de masa de tiempo de vuelo (TOF), que tienen una resolución limitada en comparación con otros analizadores de masas. A pesar de estas limitaciones, los instrumentos MALDI-TOF y MALDI-TOF-TOF han sido explotados para el análisis rápido de arriba hacia abajo de proteínas puras y mezclas fraccionadas y no fraccionadas de proteínas. Para la identificación de proteínas puras, la desintegración en la fuente (ISD) es una técnica particularmente útil porque permite el análisis de espectrometría de masas (MS) de iones de fragmentos de ISD, así como la espectrometría de masas en tándem (MS / MS) de fragmentos de iones de proteínas que proporcionan fragmentos específicos de secuencia a menudo de los N- y C-termini de la proteína objetivo, análogo a la secuenciación de Edman12,13 . Un inconveniente del enfoque ISD es que, como en la secuenciación de Edman, la muestra debe contener solo una proteína. El único requerimiento de proteína se debe a la necesidad de una atribución inequívoca de iones fragmento a un ion precursor. Si dos o más proteínas están presentes en una muestra, puede ser difícil asignar qué iones fragmento pertenecen a qué iones precursores.

La atribución de iones de fragmentos/iones precursores se puede abordar utilizando MALDI-TOF-TOF-MS/MS. Al igual que con cualquier experimento clásico de MS / MS, los iones precursores se seleccionan en masa / se aíslan antes de la fragmentación, y los iones de fragmento detectados se pueden atribuir a un ion precursor específico. Sin embargo, las técnicas de disociación disponibles para este enfoque se limitan principalmente a la disociación inducida por colisión de alta energía (HE-CID)14 o a la desintegración posterior a la fuente (PSD)15,16. HE-CID y PSD son más eficaces en la fragmentación de péptidos y proteínas pequeñas, y la cobertura de la secuencia puede, en algunos casos, ser limitada. Además, la DSP da como resultado una escisión de la columna vertebral polipeptídica (PBC) principalmente en el lado C-terminal de los residuos de ácido aspártico y glutámico por un fenómeno llamado efecto del ácido aspártico17,18,19,20.

MALDI-TOF-MS también ha encontrado una aplicación de nicho en la identificación taxonómica de microorganismos: bacterias21,hongos22y virus23. Por ejemplo, los espectros de EM se utilizan para identificar bacterias desconocidas en comparación con una biblioteca de referencia de espectros de EM de bacterias conocidas utilizando algoritmos de reconocimiento de patrones para la comparación. Este enfoque ha demostrado ser muy exitoso debido a su velocidad y simplicidad, aunque requiere un cultivo nocturno del aislado. Los iones proteicos detectados por este enfoque (generalmente por debajo de 20 kDa) comprenden una huella dactilar MS que permite la resolución taxonómica a nivel de género y especie y, en algunos casos, en la subespecie24 y el nivel de cepa25,26. Sin embargo, sigue siendo necesario no solo clasificar taxonómicamente los microorganismos potencialmente patógenos, sino también identificar factores específicos de virulencia, toxinas y factores de resistencia a los antimicrobianos (AMR). Para lograr esto, la masa de péptidos, proteínas o moléculas pequeñas se mide por EM y posteriormente se aísla y fragmenta por EM / EM.

Las bacterias patógenas a menudo transportan piezas circulares de ADN llamadas plásmidos. Los plásmidos, junto con los profagos, son un vector importante de transferencia horizontal de genes entre bacterias y son responsables de la rápida propagación de la resistencia a los antimicrobianos y otros factores de virulencia a través de las bacterias. Los plásmidos también pueden portar genes antibacterianos (AB), por ejemplo, colicina y bacteriocina. Cuando estos genes se expresan y las proteínas se secretan, actúan para desactivar la maquinaria de traducción de proteínas de las bacterias vecinas que ocupan el mismo nicho ambiental27. Sin embargo, estas enzimas bactericidas también pueden representar un riesgo para el huésped que las produjo. En consecuencia, un gen es co-expresado por el huésped que inhibe específicamente la función de una enzima AB y se conoce como su proteína de inmunidad (Im).

Los antibióticos dañinos para el ADN como la mitomicina-C y la ciprofloxacina se utilizan a menudo para inducir la respuesta SOS en la E. coli productora de toxina Shiga (STEC) cuyo gen de la toxina Shiga(stx) se encuentra dentro de un genoma de profagos presente en el genoma bacteriano28. Hemos utilizado previamente la inducción antibiótica, MALDI-TOF-TOF-MS/MS, y el análisis proteómico de arriba hacia abajo para detectar e identificar tipos y subtipos stx producidos por las cepas STEC29,30,31,32. En el trabajo anterior, la cepa RM7788 de STEC O113:H21 se cultizó durante la noche en medios de agar suplementados con mitomicina-C. Sin embargo, en lugar de detectar la subunidad B anticipada de Stx2a en m/z ~7816, se detectó un ion proteico diferente en m/z ~7839 y se identificó como una proteína hipotética codificada por plásmidos de función desconocida33. En el trabajo actual, identificamos dos proteínas AB-Im codificadas en plásmidos producidas por esta cepa utilizando inducción de antibióticos, MALDI-TOF-TOF-MS / MS, y análisis proteómico de arriba hacia abajo utilizando un software independiente desarrollado para procesar y escanear secuencias de proteínas in silico derivadas de la secuenciación del genoma completo (WGS). Además, se incorporó al software la posibilidad de modificaciones posteriores a la traducción (PTM) que impliquen truncamiento de secuencia. Las proteínas de inmunidad se identificaron utilizando este software a partir de la masa medida del ion proteína madura y los iones de fragmento específicos de secuencia de PBC causados por el efecto del ácido aspártico y detectados por MS / MS-PSD. Finalmente, se identificó un promotor aguas arriba de los genes AB/Im en un genoma de plásmido que puede explicar la expresión de estos genes cuando esta cepa está expuesta a un antibiótico dañino para el ADN. Partes de este trabajo se presentaron en la Reunión y Exposición Virtual de otoño de 2020 de la National American Chemical Society (17-20 de agosto de 2020)34.

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Protocolo

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1. Preparación microbiológica de muestras

  1. Inocular 25 ml de caldo de Luria (LB) en un tubo cónico de 50 ml con E. coli O113:H21 cepa RM7788 (u otra cepa bacteriana) de una cepa de glicerol utilizando un asa estéril de 1 μL. Tapar el tubo y preculterr a 37 °C con agitación (200 rpm) durante 4 h.
  2. Alícuota de 100 μL de caldo preculto y untar sobre una placa de agar LB suplementada con 400 u 800 ng/mL de mitomicina-C. Cultivar placas de agar estáticamente durante la noche en una incubadora a 37 °C.
    PRECAUCIÓN: Las cepas STEC son microorganismos patógenos. Realizar todas las manipulaciones microbiológicas, más allá del cultivo, en un gabinete de bioseguridad BSL-2.
  3. Recolecte células bacterianas de colonias visibles individuales utilizando un bucle estéril de 1 μL y transfiéralo a un tubo de microcentrífuga de tapa de rosca revestido de anillo tórica de 2,0 ml que contenga 300 μL de agua de grado HPLC. Tapa el tubo, el vórtice brevemente y centrifuga a 11.337 x g durante 2 min para peletizar las células.

2. Espectrometría de masas

  1. Apunte la alícuota de 0,75 μL del sobrenadante de muestra sobre el objetivo MALDI de acero inoxidable y deje que se seque. Superponga el punto de muestra seca con alícuota de a0,75 μL de una solución saturada de ácido sinapínico en acetonitrilo al 33%, 67% de agua y ácido trifluoracético al 0,2%. Deje que la mancha se seque.
  2. Analice las manchas de muestra seca utilizando un espectrómetro de masas MALDI-TOF-TOF.
    1. Después de cargar el objetivo MALDI en el espectrómetro de masas, haga clic en el botón para la adquisición del modo lineal MS en el software de adquisición. Ingrese el rango m / z a analizar ingresando el m / z de los límites inferior y superior (por ejemplo, 2 kDa a 20 kDa) en sus respectivos campos en el software del método de adquisición.
    2. Haga clic en el lugar de muestra para ser analizado en la plantilla de destino MALDI en el software. Luego, deprima el botón izquierdo del mouse y arrastre el cursor del mouse sobre el punto de muestra para especificar la región rectangular que se muestreará para la ablación / ionización con láser. Suelte el botón del mouse y se iniciará la adquisición. Recolecte 1,000 disparos láser para cada punto de muestra.
      NOTA: La adquisición de datos se muestra en tiempo real en la ventana de adquisición de software.
    3. Si no se detectan iones, aumente la intensidad del láser ajustando la barra de escala móvil bajo Intensidad del láser en el software hasta que se detecte la señal de iones de proteína. Esto se conoce como umbral.
      NOTA: Antes del análisis del punto de muestra, calibre externamente el instrumento en modo lineal MS con calibrantes de proteínas cuyo m/z abarque el rango que se está analizando, por ejemplo, los estados de carga +1 y +2 de los calibrantes de proteínas: citocromo-C, lisozima y mioglobina cubren un rango de masa de 2 kDa a 20 kDa. Una masa intermedia dentro del rango de masa especificado se utiliza como masa de enfoque, por ejemplo, 9 kDa. La masa de enfoque es el ion cuyo m/z está enfocado de manera óptima para su detección por el detector de modo lineal.
    4. Cuando se complete la adquisición del modo lineal de MS, haga clic en el botón para la adquisición del modo de reflectrón de MS/MS en el software de adquisición. Introduzca la masa precursora que se analizará en el campo Masa precursora. A continuación, introduzca un ancho de aislamiento (en Da) en la ventana de masa precursora para el lado de masa baja y alta de la masa precursora, por ejemplo, ±100 Da.
    5. Haga clic en el botón CID Off. Haga clic en el botón Metastable Suppressor ON. Ajuste la intensidad del láser al menos al 90% de su valor máximo ajustando la barra de escala deslizante debajo de la intensidad del láser en el software.
    6. Haga clic en el lugar de muestra para ser analizado en la plantilla de destino MALDI en el software. A continuación, deprima el botón izquierdo del ratón y arrastre el cursor del ratón sobre el punto de muestra para especificar la región rectangular que se muestreará para la ablación/ionización con láser. Suelte el botón del mouse y se iniciará la adquisición. Recolecte 10,000 disparos láser para cada punto de muestra.
      NOTA: Antes del análisis puntual de la muestra, el instrumento debe calibrarse externamente en modo MS/MS-reflectrón utilizando los iones fragmentos de la desintegración posterior a la fuente (PSD) del estado de carga +1 de la tiorredoxina alquilada35.
  3. No procese datos de MS sin procesar. Procese los datos brutos de MS/MS-PSD utilizando la siguiente secuencia de pasos en el orden especificado: corrección basal avanzada (32, 0,5, 0,0) seguida de eliminación de ruido (dos desviaciones estándar) seguida de suavizado gaussiano (31 puntos).
  4. Inspeccione manualmente los datos de MS/MS-PSD para detectar la presencia de iones fragmentos prominentes generados por PBC19,20.
  5. Evaluar los datos de MS/MS con respecto a la abundancia absoluta y relativa de iones fragmentos y su señal a ruido (S/N). Utilice solo los iones de fragmento más abundantes para la identificación de proteínas, especialmente si los datos de MS / MS-PSD son ruidosos.

3. Construcción de bases de datos de proteínas in silico

  1. Genere un archivo de texto que contenga secuencias de proteínas in silico de la cepa bacteriana, que será escaneado por el software Protein Biomarker Seeker para la identificación de proteínas. Las secuencias de proteínas se derivan de la secuenciación del genoma completo (WGS) de la cepa que se está analizando (o una cepa estrechamente relacionada).
  2. Acceda al sitio web de NCBI/PubMed (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/) para descargar aproximadamente 5,000 secuencias de proteínas de la cepa bacteriana específica (por ejemplo, Escherichia coli O113: H21 cepa RM7788) que se está analizando. El tamaño máximo de descarga es de 200 secuencias.
    1. En consecuencia, copie y pegue las 25 descargas en un solo archivo de texto. Seleccione el formato FASTA (texto) para cada descarga.

4. Funcionamiento del software Protein Biomarker Seeker

  1. Haga doble clic en el archivo ejecutable Protein Biomarker Seeker. Aparecerá una ventana de interfaz gráfica de usuario (GUI)(Figura 1,panel superior).
  2. Ingrese la masa del biomarcador de proteína (medido en modo MS-lineal) en el campo Masa de proteína madura. A continuación, introduzca el error de medición de masa en el campo Tolerancia de masas. El error de medición de masa estándar es ±10 Da para una proteína de 10.000 Da.
  3. Opcionalmente, haga clic en el botón Calculadora de masa de proteína de iones b/a complementarios para calcular la masa de proteínas a partir de un supuesto par de iones de fragmentos complementarios (CFIP o b/y). Aparecerá una ventana emergente, Protein Mass Calculator Tool,(Figura 1,panel inferior).
    1. Ingrese el m / z del supuesto CFIP y haga clic en el botón Agregar par. Aparecerá la masa proteica calculada.
    2. Copie y pegue este número en el campo Masa de proteína madura y cierre la ventana de la herramienta Calculadora de masa de proteína.
  4. Seleccione una longitud de péptido de señal N-terminal haciendo clic en el cuadro Establecer restricción de residuos. Aparecerá una ventana emergente con una escala móvil y un cursor. Mueva el cursor a la longitud deseada del péptido de señal (máximo 50). Si no se selecciona la longitud del péptido de señal, el software realizará un truncamiento de secuencia sin restricciones.
  5. En la condición de iones de fragmento en la GUI, seleccione residuos para la escisión de la columna vertebral polipeptídica (PBC). Haga clic en las casillas de uno o más residuos: D, E, N y/o P.
    1. Haga clic en el botón Introducir iones de fragmento (+1) para buscar. Aparecerá una página de fragmento emergente. A continuación, haga clic en el botón Agregar ion de fragmento, que corresponde al número de iones de fragmento que se ingresará, es decir, un clic para cada ion de fragmento. Aparecerá un campo desplegable para cada fragmento de ion que se introduzca.
    2. Introduzca la m/z de los iones fragmento y su tolerancia m/z asociada. Cuando haya terminado, haga clic en el botón Guardar y cerrar.
      NOTA: Una tolerancia m/z razonable es ±1.5.
    3. Seleccione el número mínimo de iones de fragmento que deben coincidir para una identificación desplazándose hasta el número deseado en el cuadro a la derecha de Cuántos iones de fragmento deben coincidir.
      NOTA: Tres partidos deben ser adecuados.
    4. Seleccione los residuos de cisteína para que estén en su estado oxidado haciendo clic en el círculo correspondiente. Si no se encuentran identificaciones de proteínas después de la búsqueda, repita la búsqueda con cisteínas en su estado reducido. Si no se encuentran identificaciones después de la búsqueda, amplíe la tolerancia de iones del fragmento a ±3 y repita la búsqueda.
  6. En Configuración de archivos,haga clic en el botón Seleccionar archivo FASTA para examinar y seleccionar el archivo FASTA (texto) que contiene las secuencias de proteínas in silico de la cepa bacteriana previamente construida en los pasos 3.1 a 3.2 del protocolo. A continuación, seleccione una carpeta de salida y cree un nombre de archivo de salida.
  7. Haga clic en el botón Ejecutar búsqueda en entradas de archivo. Aparecerá una ventana emergente titulada Confirmar parámetros de búsqueda (Figura 1,panel inferior), que muestra los parámetros de búsqueda antes de que se inicie la búsqueda.
  8. Si los parámetros de búsqueda son correctos, haga clic en el botón Comenzar búsqueda. Si los parámetros de búsqueda no son correctos, haga clic en el botón Cancelar y vuelva a introducir los parámetros correctos. Una vez iniciada la búsqueda, la ventana de parámetros se cierra y aparece una nueva ventana emergente con una barra de progreso(Figura 1,panel inferior) que muestra el progreso de la búsqueda y un recuento en ejecución del número de identificaciones encontradas.
  9. Al finalizar la búsqueda (unos segundos), la barra de progreso se cierra automáticamente y se muestra un resumen de la búsqueda en el campo Registro de la GUI(Figura 2,panel superior). Además, también aparecerá una nueva ventana emergente que muestra la(s) identificación(es) de proteínas, si las hay(Figura 2,panel inferior).
    NOTA: Las secuencias de proteínas in silico que tienen residuos no reconocidos, por ejemplo, U o X, se omiten automáticamente del análisis y estas secuencias se informan posteriormente con una ventana emergente separada para alertar al operador sobre qué secuencias (si las hay) se omitieron al completar la búsqueda.

5. Confirmación posterior a la búsqueda de la secuencia de proteínas

  1. Confirmar la exactitud de una secuencia candidata mediante análisis manual.
    NOTA: El propósito del software Protein Biomarker Seeker es identificar una secuencia de proteínas con alta precisión eliminando muchas secuencias de proteínas obviamente incorrectas de la consideración e incorporando truncamiento de secuencia como un posible PTM en la proteína madura. Como el número de posibles secuencias candidatas devueltas es escaso, la confirmación manual es manejable.
  2. Genere una tabla del promedio de m/z de iones fragmentos de tipo b e y de la secuencia candidata utilizando cualquier software de espectrometría de masas o proteómico que tenga dicha funcionalidad. Compare el promedio de m/z de los iones de fragmentos in silico en el lado C-terminal de los residuos D-, E-, y N (y en el lado N-terminal de los residuos P) con el m/z de los iones fragmentos prominentes de los datos MS/MS-PSD.
    NOTA: Los iones de fragmento MS/MS-PSD más prominentes deben coincidir fácilmente con los iones de fragmento in silico asociados a D, E y N. Sin embargo, el mecanismo de fragmentación del efecto del ácido aspártico es menos eficiente cerca del N- o C-termini de una secuencia deproteínas 36.

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Resultados

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La Figura 3 (panel superior) muestra el MS de la cepa STEC O113:H21 RM7788 cultivada durante la noche en LBA suplementada con 400 ng/mL de mitomicina-C. Los picos en m/z 7276, 7337 y 7841 se habían identificado previamente como proteína C de choque frío (CspC), proteína de choque frío E (CspE) y una proteína transmitida por plásmidos de función desconocida, respectivamente33. El ion proteína en m/z 9780 [M+H]+ fue analizado por MS/MS-PSD como se muestra en ...

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Discusión

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Consideraciones sobre el protocolo
Las principales fortalezas del protocolo actual son su velocidad, simplicidad de preparación de muestras y uso de un instrumento que es relativamente fácil de operar, entrenar y mantener. Aunque el análisis proteómico de abajo hacia arriba y de arriba hacia abajo por cromatografía líquida-ESI-HR-MS es omnipresente y muy superior en muchos aspectos al de arriba hacia abajo por MALDI-TOF-TOF, requieren más tiempo, mano de obra y experiencia. La complejidad de los instr...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen conflictos de intereses.

Agradecimientos

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El software Protein Biomarker Seeker está disponible gratuitamente (sin costo) poniéndose en contacto con Clifton K. Fagerquist en clifton.fagerquist@usda.gov. Deseamos agradecer el apoyo a esta investigación por parte de ARS, USDA, cris grant: 2030-42000-051-00-D.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Software Explorer de la serie 4000AB SciexVersión 3.5.3
4800 Plus MALDI TOF/TOF Analizador ABSciex
Acetonitrilo Optima Grado LC/MSFisher ChemicalA996-1
BSL-2 Gabinete de riesgo biológicoThe Baker CompanySG403A-HE
Citocromo-CSigmaC2867-10MG
Software Data Explorer ABSciexVersión 4.9
Kit de Reducción de Proteínas-AlquilaciónG-Biosciences786-231
GPMAW SoftwareLighthouse DataVersión 10.0
IncubadoraVWR9120973
LB AgarInvitrogen22700-025
Luria CaldoInvitrogen12795-027
LysozymeSigmaL4919-1G
, 2 mL, tapón de rosca, junta tóricaFisher Scientific02-681-343
Centrífuga MiniSpin PlusEppendorf22620207
Mitomicina-C (de estreptomices)Sigma-AldrichM0440-5MG
MioglobinaSigmaM5696-100MG
Agitador MaxQ 420HP Modelo 420Thermo ScientificModelo 420
Ácido sinapínicoThermo Scientific1861580
Bucles estériles de 1 uLFisher Scientific22-363-595
Tiorredoxina (E. coli, recombinante)SigmaT0910-1MG
Ácido trifluoroacéticoSigma-Aldrich299537-100G
Agua Optima LC/MS gradoFisher ChemicalW6-4
Tubos de microcentrífuga

Referencias

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