Pinzas ópticas para estudiar las interacciones ARN-proteína en la regulación de la traducción

Resumen

Este protocolo presenta un flujo de trabajo experimental completo para estudiar las interacciones ARN-proteína utilizando pinzas ópticas. Se describen varias configuraciones experimentales posibles, incluida la combinación de pinzas ópticas con microscopía confocal.

Resumen

El ARN adopta diversos pliegues estructurales, que son esenciales para sus funciones y, por lo tanto, pueden afectar diversos procesos en la célula. Además, la estructura y función de un ARN puede ser modulada por diversos factores de acción trans, como proteínas, metabolitos u otros ARN. Las moléculas de ARN que cambian el marco, por ejemplo, son ARN reguladores ubicados en regiones codificantes, que dirigen la traducción de ribosomas en un marco de lectura abierto alternativo y, por lo tanto, actúan como interruptores genéticos. También pueden adoptar diferentes pliegues después de unirse a proteínas u otros factores trans. Para diseccionar el papel de las proteínas de unión al ARN en la traducción y cómo modulan la estructura y la estabilidad del ARN, es crucial estudiar la interacción y las características mecánicas de estos complejos ARN-proteína simultáneamente. Este trabajo ilustra cómo emplear pinzas ópticas acopladas a fluorescencia de una sola molécula para explorar el panorama conformacional y termodinámico de los complejos ARN-proteína a una alta resolución. A modo de ejemplo, se elabora la interacción del elemento de desplazamiento de marco ribosómico programado por sarS-CoV-2 con la isoforma corta del factor de acción trans de la proteína antiviral zinc-dedo. Además, los ribosomas marcados con fluorescencia se monitorizaron utilizando la unidad confocal, lo que en última instancia permitiría el estudio del alargamiento de la traducción. El ensayo OT acoplado a fluorescencia se puede aplicar ampliamente para explorar diversos complejos de ARN-proteína o factores de acción trans que regulan la traducción y podría facilitar los estudios de regulación génica basada en ARN.

Introducción

La transferencia de información genética del ADN a las proteínas a través de los ARNm es un proceso bioquímico complejo, que se regula con precisión en todos los niveles a través de interacciones macromoleculares dentro de las células. Para la regulación traslacional, las interacciones ARN-proteína confieren un papel crítico para reaccionar rápidamente a diversos estímulos y ^señales1,2. Algunas interacciones ARN-proteína afectan la estabilidad del ARNm y, por lo tanto, alteran el tiempo que un ARN está activo traslacionalmente. Otras interacciones ARN-proteína se asocian con mecanismos de recodificación como l....

Protocolo

1. Preparación de la muestra

1. Clonar la secuencia de interés en el vector que contiene los fragmentos de ADN Lambda, que sirven como secuencias de mango (Figura 2)^43,50.
2. Primero generar una plantilla de ADN para la posterior transcripción in vitro mediante PCR (Figura 2B; reacción 1). En este paso de PCR, el promotor T7 se añade en el extremo 5' de la molécula de ADN sensorial32,33,43,50.

Resultados

En esta sección, se presta especial atención a las mediciones de las interacciones ARN-proteína/ligando por las pinzas ópticas de fluorescencia. Para una descripción de los experimentos generales de pinzas ópticas de ARN y los resultados representativos correspondientes, ^ver32. Para una discusión más detallada de las interacciones ARN/ADN-proteína, véase también1,2,26,59,60.

Discusión

Aquí, demostramos el uso de pinzas ópticas acopladas a fluorescencia para estudiar las interacciones y el comportamiento dinámico de las moléculas de ARN con varios ligandos. A continuación, se discuten los pasos críticos y las limitaciones de la presente técnica.

Pasos críticos en el protocolo
Como para muchos otros métodos, la calidad de la muestra es fundamental para obtener datos confiables. Por lo tanto, para obtener muestras de la más alta calidad posible, vale la pen.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
bacterias fuertes. coli >
fuerte Colección	laboratorio	/A	Clonación de los vectores
químicos y enzimasCloruro
sodio	Sigma-Aldrich	31424	Tampones
Biotina-16-dUTP	Roche	11093070910	Biotinilación
BSA	Sigma-Aldrich	A4737	Tampones
Catalasa	Lumicks	N/A	Sistema de limpieza de oxígeno
Dithiothreitol (DTT)	Melford Labs	D11000	Tampones
ADNasa I del páncreas bovino	Sigma-Aldrich	D4527	in vitro
dNTPs	Th.Geyer	11786181	PCR
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884	Tampones
Formamida	Sigma-Aldrich	11814320001	Tampones
Glucosa	Sigma-Aldrich	G8270-1KG	Sistema de limpieza de oxígeno
Glucosa-oxidasa	Lumicks	N/A	Sistema de limpieza de oxígeno
HEPES	Carl Roth	HN78.3	Tampones
Cloruro de magnesio	Carl Roth	2189.1	Tampones
Phusion ADN polimerasa	NEB	M0530L Ensamblaje	Gibson, clonación
Cloruro de potasio	Merck	529552-1KG	Tampones
PrimeSTAR GXL ADN POLIMERASA	Takara Bio Clontech	R050A	PCR
Pirofosfatasa, termoestable, inorgánica	NEB	M0296L	de transcripción in vitro
	Tampones 1000379515 Molox
rNTPS	life technologies	R0481	in vitro
Tiosulfato de sodio	Sigma-Aldrich	S6672-500G	Desactivación de lejía
Sytox Green	Lumicks	N/A	Mediciones confocales
ADN polimerasa T4	NEB	M0203S	Biotinilación
T5 exonucleasa	NEB	M0363S	Ensamblaje de Gibson, clonación
ARN polimerasa T7	Producción propia N	/A	transcripción in vitro
ADN polimerasa	Taq NEB	M0267S	PCR
Taq ligasa	Biozym	L6060L	Ensamblaje de Gibson, clonación
TWEEN 20 BioXtra	Sigma-Aldrich	P7949	Tampones
Kits
Kit de etiquetado de proteínas monolíticas RED-NHS de 2ª generación (reactiva a la amina)	Nanotemper	MO-L011	Se utiliza para el etiquetado de ribosomas
Purefrex 2.0	GeneFrontier	PF201-0.25-EX	Ribosomas utilizados para el etiquetado
fuerte Mango T7 adelante	Microsynth	pedido	personalizado5' - CTTAATACGACTCACTATAGGTC CTTTCTGTGGACGCC - 3', utilizado para generar una plantilla de transcripción in vitro de OT en PCR 1
3' manejar	Microsynth	personalizado	5' -  GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC - 3', utilizado para generar la plantilla de transcripción in vitro de OT en PCR 1
5' mango adelante	Microsynth	pedido personalizado	5' - TCCTTTGTGGACGCCGC - 3' , utilizado para generar 5' mango en PCR 2
5' mango inverso	Microsynth	pedido personalizado	5' - CATAAATACCTCTTTACTAATATA TATACCTTCGTAAGCTAGCGT - 3', utilizado para generar 5' mango en PCR 2
3' mango adelante	Microsynth	pedido personalizado	5' - ATCCTGCAACCTGCTCTTCGCC AG - 3', utilizado para generar 3' mango en PCR 3
3' mango reverso 5' marcado con digoxigenina	Microsynth	pedido personalizado	5' -[Dig]-GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC - 3', utilizado para generar 3' mango en PCR 3
DNA vectors
pMZ_OT	producido internamente	N/A	descripción adicional en "Los estudios estructurales de la proteína Cardiovirus 2A revelan la base molecular para el reconocimiento de ARN y el control traduccional" Chris H. Hill, Sawsan Napthine, Lukas Pekarek, Anuja Kibe, Andrew E. Firth, Stephen C. Graham, Neva Caliskan, Ian Brierley bioRxiv 2020.08.11.245035; doi: https://doi.org/10.1101/2020.08.11.245035
Software and Algorithms
Atom	https://atom.io/packages/ide-python	N/A
Bluelake	Lumicks	N/A
Graphpad	https://www.graphpad.com/	N/A
InkScape 0.92.3	https://inkscape.org/	N/A
Matlab		https://www.mathworks.com/products/matlab.html N/A
POTATO		N/A
RNAstructure	https://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructure.html	N/A
Spyder	https://www.spyder-ide.org/	N/A
Otro
Partículas de poliestireno recubiertas de estreptavidina, 1,5-1,9 y micro; m, 5 ml, 1.0% p/v	Spherotech	SVP-15-5
Partículas de poliestireno recubiertas de digoxigenina, 2.0-2.4 y micro; m, 2 ml, 0,1 % p/v	Jeringas Spherotech	DIGP-20-2
	VWR	TERUMO SS+03L1
Devices
C-trap	Lumicks	N/A	Pinzas ópticas acopladas a microscopía confocal

de N de transcripción de Inhibidor de ARNasa transcripción de inverso orden https://github.com/lpekarek/POTATO.git