Aquí, establecemos un protocolo para visualizar y analizar simultáneamente múltiples complejos SMAD utilizando el ensayo de ligadura de proximidad (PLA) en células endoteliales expuestas a condiciones patológicas y fisiológicas de estrés por cizallamiento de fluidos.
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Artículo de método
Visualización y cuantificación de la señalización TGFβ/BMP/SMAD bajo diferentes condiciones de tensión por cizallamiento de fluidos mediante ensayo de ligadura de proximidad
En este artículo
Resumen
Resumen
La señalización del factor de crecimiento transformador β (TGFβ)/proteína morfogenética ósea (BMP) está estrechamente regulada y equilibrada durante el desarrollo y la homeostasis del sistema de vasculatura Por lo tanto, la desregulación en esta vía de señalización da como resultado patologías vasculares graves, como hipertensión arterial pulmonar, telangiectasia hemorrágica hereditaria y aterosclerosis. Las células endoteliales (CE), como la capa más interna de los vasos sanguíneos, están constantemente expuestas al estrés por cizallamiento de líquidos (SS). Se ha demostrado que los patrones anormales de SS de líquido mejoran la señalización TGFβ / BMP, que, junto con otros estímulos, inducen aterogénesis. En relación con esto, se encontró que la ateroprofona, SS laminar baja, mejora la señalización TGFβ / BMP, mientras que la SS ateroprotectora y laminar alta disminuye esta señalización. Para analizar de manera eficiente la activación de estas vías, diseñamos un flujo de trabajo para investigar la formación de complejos de factores de transcripción en condiciones de SS laminar baja y SS laminar alta utilizando un sistema de bomba neumática disponible comercialmente y un ensayo de ligadura de proximidad (PLA).
La señalización activa de TGFβ/BMP requiere la formación de complejos SMAD triméricos que consisten en dos SMAD reguladores (R-SMAD); SMAD2/3 y SMAD1/5/8 para la señalización TGFβ y BMP, respectivamente) con un mediador común SMAD (co-SMAD; SMAD4). Utilizando PLA dirigido a diferentes subunidades del complejo SMAD trimérico, es decir, R-SMAD /co-SMAD o R-SMAD/R-SMAD, la formación de complejos activos de factor de transcripción SMAD se puede medir cuantitativa y espacialmente utilizando microscopía de fluorescencia.
El uso de diapositivas de flujo con 6 pequeños canales paralelos, que se pueden conectar en serie, permite la investigación de la formación del complejo del factor de transcripción y la inclusión de los controles necesarios.
El flujo de trabajo explicado aquí se puede adaptar fácilmente para estudios dirigidos a la proximidad de los SMAD a otros factores de transcripción o a complejos de factores de transcripción distintos de los SMAD, en diferentes condiciones de SS fluidos. El flujo de trabajo presentado aquí muestra una forma rápida y efectiva de estudiar la señalización fluida inducida por SS TGFβ / BMP en ECs, tanto cuantitativa como espacialmente.
Introducción
Las proteínas de la superfamilia de factores de crecimiento transformantes beta (TGFβ) son citoquinas pleiotrópicas con una variedad de miembros, incluyendo TGFβs, proteínas morfogenéticas óseas (BMP) y activinas1,2. La unión al ligando induce la formación de oligómeros receptores que conducen a la fosforilación y, por lo tanto, a la activación del SMAD regulador citosólico (R-SMAD). Dependiendo de la subfamilia de ligandos, se activan diferentes R-SMADs1,2. Mientras que TGFβs y Activinas inducen principalmente la fosforilación de SMAD2/3, los BMP indu....
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Protocolo
1. Cultivo celular y exposición al estrés por cizallamiento de fluidos
NOTA: Las CE de vena umbilical humana (HUVEC) se utilizaron como ejemplo para estudiar la interacción inducida por SS de los SMAD. El protocolo que se describe a continuación se puede aplicar a cada tipo de célula sensible a SS.
- Cubra el portaobjetos de 6 canales con gelatina de piel porcina al 0,1% en PBS durante 30 min a 37 °C.
- HUVEC de semillas en portaobjetos pre-recubiertos de 6 canales a una densidad de 2,5 x 106 células por ml en 30 μL de medio completo M199.
NOTA: Para obtener más información sobre cómo sembrar celdas en la diapo....
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Resultados
Anteriormente hemos utilizado PLA para detectar interacciones de diferentes proteínas SMAD3 y analizado cambios inducidos por estrés cortante en la fosforilación de SMAD28.
Aquí, ambos métodos se combinaron con el protocolo descrito anteriormente. Los HUVEC fueron sometidos a un esfuerzo cortante de 1 dina/cm2 y 30 dinas/cm2 y analizados para detectar interacciones de factores de transcripción SMAD. Mostramos que, en compara.......
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Discusión
El protocolo basado en PLA descrito aquí ofrece una forma eficiente de determinar la proximidad de dos proteínas (por ejemplo, su interacción directa) en CE expuestas a tensión cortante con resolución cuantitativa y espacial. Mediante el uso de portaobjetos de flujo con múltiples canales paralelos, se pueden examinar varias interacciones de proteínas diferentes al mismo tiempo en células en condiciones mecánicas idénticas. Por el contrario, los sistemas de cámara de flujo personalizados a menudo hacen uso de un solo cana.......
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Divulgaciones
Los autores declaran no tener conflicto de intereses.
Agradecimientos
Agradecemos a la Dra. Maria Reichenbach y al Dr. Christian Hiepen por su apoyo en el sistema de configuración de flujo y a Eleanor Fox y Yunyun Xiao por leer críticamente el manuscrito. P-L.M. fue financiado por la escuela internacional de investigación Max Planck IMPRS-Biology and Computation (IMPRS-BAC). PK recibió financiación de la DFG-SFB1444. La Figura 1 se creó utilizando BioRender.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| µ-Diapositiva VI 0.4 | ibidi | 80606 | Corredera de 6 canales |
| Cloruro de amonio | Carl Roth | K298.1 | Enfriamiento |
| la albúmina sérica bovina | Carl Roth | 8076.4 | Bloqueo |
| DAPI | Sigma Aldrich/ Merck | D9542 | Tinción ADN/Núcleos |
| DPBS | PAN Biotech | P04-53500 | PBS |
| Duolink In Reactivos de detección in situ Green | Sigma Aldrich/ Merck | DUO92014 | Kit de PLA que contiene ligasa, tampón de ligadura, polimerasa y tampón de amplificación (con oligonucleótidos marcados en verde) |
| Sonda de PLA in situ Duolink Anti-Mouse MINUS | Sonda Sigma Aldrich/ Merck | DUO92004 | MINUS |
| Sonda PLA in situ Duolink Sonda Anti-Rabbit PLUS | Sigma Aldrich/ Merck | DUO92002 | PLUS |
| Tampones de lavado in situ Duolink, fluorescencia | Sigma Aldrich/ Merck | DUO82049 | tampones de lavado PLA A y B |
| Suplemento de crecimiento de células endoteliales | Suplemento de Corning | para medio (ECGS) | |
| Ternero fetal Suplemento de suero | para medio | ||
| Software de análisis de imágenes | FIJI | ||
| Solución de formaldehído 4% tamponada | KLINIPATH/VWR | VWRK4186. BO1 | PFA |
| Medio | M199 medio basal +20 % FCS +1 % P/S + 2 nM L-Glu + 25 µ g/mL de hep + 50 y micro; g/mL ECGS | ||
| Gelatina de piel porcina, Tipo A | Sigma Aldrich | G2500 | Uso 0.1% en PBS para el recubrimiento de canales de flujo |
| GraphPad Prism v.7 | GarphPad | Programa estadístico utilizado para los gráficos y cálculos estadísticos | |
| Heparina sal sódica de mucosa intestinal porcina | Sigma Aldrich | H4784-250MG | suplemento para |
| HUVECs | medios (Hep) | ||
| ibidi Medio de montaje | ibidi | 50001 | Medio de montaje líquido |
| ibidi Sistema de bomba ibidi | 10902 | bomba neumática | |
| Leica TCS SP8 | Microscopio confocal | Leica | |
| L-Glutamin 200mM | PAN Biotech | P04-80100 | suplemento para medio (L-Glu) |
| Medio 199 | Sigma Aldrich | M2154 | Medio |
| ratón anti-SMAD1 Anticuerpo | Abcam | ab53745 | Adecuado para PLA |
| anti-SMAD2/3 Anticuerpo | BD Bioscience | 610843 | No apto para PLA en combinación con CST 9515 |
| ratón anti-SMAD4 Anticuerpo | Sanata Cruz Biotechnology | sc-7966 | Adecuado para |
| PLA Penicilina 10.000U/ml /Estreptomicina 10mg/ml | PAN Biotech | P06-07100 | suplemento para medio (P/ S) |
| Set de perfusión BLANCO | ibidi | 10963 | Tubos utilizados para 1 dyn/cm2 |
| Juego de perfusión AMARILLO y VERDE | ibidi | 10964 | Tubos utilizados para 30 dyn/cm2 |
| conejo antifosfo SMAD1/5 Anticuerpo | Tecnologías de señalización celular 9516 | Adecuado para | |
| PLA conejo anti-SMAD2/3 XP | Tecnologías de señalización celular | 8685 | Adecuado para PLA |
| conejo anti-SMAD4 | Tecnologías de señalización celular de | 9515 | No apto para PLA en combinación con BD |
| 610843 Conector serie para µ-Slides Tubos de | ibidi | 10830 | Triton |
| X-100 | Carl Roth | 6683.1 | Permeabilización |
Referencias
- Yadin, D., Knaus, P., Mueller, T. D. Structural insights into BMP receptors: Specificity, activation and inhibition. Cytokine and Growth Factor Reviews. 27, 13-34 (2016).
- Sieber, C., Kopf, J., Hiepen, C., Knaus, P. Recent advances in BMP receptor sig....
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Reimpresiones y permisos
