Uso de placas base y un miniscopio preanclado con una lente objetiva para la investigación transitoria de calcio en ratones

Summary

La contracción del cemento dental durante el curado desplaza la placa base. Este protocolo minimiza el problema al crear una base inicial del cemento dental que deja espacio para cementar la placa base. Semanas más tarde, la placa base se puede cementar en posición en este andamio con poco cemento nuevo, reduciendo así la contracción.

Abstract

Los neurocientíficos usan microscopios en miniatura (miniscopios) para observar la actividad neuronal en animales que se comportan libremente. El equipo de Miniscopios de la Universidad de California, Los Ángeles (UCLA) proporciona recursos abiertos para que los investigadores construyan miniscopios ellos mismos. El V3 UCLA Miniscope es uno de los miniscopios de código abierto más populares actualmente en uso. Permite obtener imágenes de los transitorios de fluorescencia emitidos por neuronas modificadas genéticamente a través de una lente objetiva implantada en la corteza superficial (un sistema de una lente), o en áreas cerebrales profundas a través de una combinación de una lente de relé implantada en el cerebro profundo y una lente objetiva que está preanclada en el miniscopio para observar la imagen transmitida (un sistema de dos lentes). Incluso en condiciones óptimas (cuando las neuronas expresan indicadores de fluorescencia y la lente del relé se ha implantado correctamente), un cambio de volumen del cemento dental entre la placa base y su unión al cráneo tras el curado con cemento puede causar una desalineación con una distancia alterada entre el objetivo y las lentes del relé, lo que resulta en una mala calidad de imagen. Una placa base es una placa que ayuda a montar el miniscopio en el cráneo y fija la distancia de trabajo entre el objetivo y las lentes del relé. Por lo tanto, los cambios en el volumen del cemento dental alrededor de la placa base alteran la distancia entre las lentes. El presente protocolo tiene como objetivo minimizar el problema de desalineación causado por los cambios de volumen en el cemento dental. El protocolo reduce la desalineación mediante la construcción de una base inicial de cemento dental durante la implantación de lentes de relé. El tiempo de convalecencia después de la implantación es suficiente para que la base del cemento dental cure completamente la placa base, por lo que la placa base se puede cementar en este andamio utilizando la menor cantidad de cemento nuevo posible. En el presente artículo, describimos estrategias para el recubrimiento de base en ratones para permitir la obtención de imágenes de la actividad neuronal con una lente objetiva anclada en el miniscopio.

Introduction

Los reporteros de actividad fluorescente son ideales para obtener imágenes de la actividad neuronal porque son sensibles y tienen grandes rangos dinámicos ^1,2,3. Por lo tanto, un número creciente de experimentos están utilizando microscopía de fluorescencia para observar directamente la actividad neuronal 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 ^....

Protocol

Todos los procedimientos realizados en este estudio fueron aprobados por el Comité Nacional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Taiwán (Nº de aprobación: NTU-109-EL-00029 y NTU-108-EL-00158).

1. Evaluación de la alteración volumétrica del cemento dental

NOTA: Los cambios en el volumen de cemento dental ocurren durante el proceso de curado. Pruebe los cambios de volumen del cemento dental antes de la implantación y el revestimiento base. Los investigadores pueden probar cualquier marca de cemento dental y usar la marca con el cambio de volumen más bajo para cementa....

Results

Evaluación de la alteración del volumen de cemento dental
Dado que el volumen del cemento dental cambia durante el proceso de curado, puede afectar significativamente la calidad de la imagen, dado que la distancia de trabajo de una lente GRIN es de aproximadamente 50 a 350 μm ^4,8. Por lo tanto, se probaron dos cementos dentales disponibles comercialmente en este caso, Tempron y Tokuso, antes del procedimiento de implantación y recubrimiento ba.......

Discussion

El presente informe describe un protocolo experimental detallado para los investigadores que utilizan el sistema de miniscopio UCLA de dos lentes. Las herramientas diseñadas en nuestro protocolo son relativamente asequibles para cualquier laboratorio que desee probar imágenes de calcio in vivo . Algunos protocolos, como la inyección viral, la implantación de lentes, el recubrimiento base ficticio y el recubrimiento base, también podrían usarse para otras versiones del sistema de miniscopio para mejorar la tasa d.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
broca de 0,7 mm	#19008-07 Herramientas de	ciencia fina; EE. UU	para cirugía
0.1– 10 μ l puntas de pipeta	104-Q; QSP	Fisher Scientific; Singapur	para probar cemento dental
20 G IV cathater	#SR-OX2032CA	Terumo Corporation; Tokio, Japón	para cirugía
aguja de 27 G	AGANI, AN*2713R	Terumo Corporation; Tokio, Japón	para cirugía
AAV9-syn-jGCaMP7s-WPRE	#104487-AAV9; 1.5 * 10 ^ 13	Addgene preparación viral; MA, EE.UU	. para la inyección viral
sulfato		Astart; Hsinchu, Taiwán	para cirugía/revestimiento ficticio/revestimiento
Placa	V3	http://miniscope.org	para revestimiento
BLU TACK	#30840350	Bostik; Chelsea, Massachusetts, EE.UU	Arcilla adhesiva reutilizable; para cirugía/revestimiento ficticio/revestimiento
Bone Rongeur Friedman	13 cm	Diener; Tuttlingen, Alemania	para el recubrimiento base
de Buprenorfina		INDIVIOR; Reino Unido	para cirugía
Carprofeno	Rimadyl	Zoetis; Exton,	PA analgesia
Ceftazidime		Taiwan Biotech; Taiwán	previene la infección
PCB de adquisición de datos para el miniscopio de UCLA comprado	en https://www.labmaker.org/collections/neuroscience/products/data-aquistion-system-daq		para el
conjunto de cemento dental	Tempron	GC Corp; Tokio, Japón	para probar cemento dental
Juego de cemento dental	Tokuso Curefast	Tokuyama Dental Corp.; Tokio, Japón	para probar cemento dental / cirugía / revestimiento base ficticio /
base Dual Lab Standard con adaptadores de ratón y rata	# 51673	Stoelting Co; Illinois, EE. UU.	para cirugía/revestimiento ficticio/recubrimiento
ungüento		Alcon; Ginebra, Suiza	para cirugía/base de maniquí/base de
Ibuprofeno		YungShin; Analgesia de Taiwán
Isoflurano		Panion & BF Biotech INC.; Taoyuan, Taiwán	para cirugía/revestimiento ficticio/revestimiento
Inscopix	Sistema nVista	Inscopix; Palo Alto, CA	para comparar con V3 UCLA Miniscope
Ketamine		Pfizer; NY, NY	para la eutanasia
Suero fisiológico			normal para cirugía
Pinzas Micro bulldog	#12.102.04	Dimedo; Tuttlingen, Alemania	para la implantación de lentes
Microjeringas de Microlitros, 2.0 y micro; L, calibre 25	#88400	Hamilton; Bonaduz, Suiza	para
el caucho de silicona de moldeo por	ZA22 Thixo	Zhermack; Badia Polesine, Italia	para el enchapado base ficticio
Lente de índice de gradiente de objetivo (GRIN)	#64519	Edmund Optics; NJ, EE. UU.	para revestimiento de maniquíes/revestimiento de base
Parafilm	#PM996	Bemis; Neenah, EE. UU
succión portátil	ficticia#DF-750	Doctor's Friend Medical Instrument Co., Inc., Taichung, Taiwán	para la cirugía
Relé GRIN lens	#1050-002177	Inscopix; Palo Alto, CA, EE. UU	. para revestimiento de maniquíes/revestimiento de base
Tornillos de anclaje de acero inoxidable de	1,00 mm de diámetro, longitud total 3,00 mm		para cirugía
Microscopio estereoscópico	#SL720	Sage Vison; Nueva ciudad de Taipei, Taiwán	para cirugía/maniquí baseplating/baseplating
Aparato estereotáxico	#51673	Stoelting; IL, EE. UU	. para cirugía / revestimiento de base /
de base Adhesivo de curado UV	# 3321	Loctite; Dü sseldorf, Alemania	para probar el cemento dental
V3 UCLA Miniscope	comprado en https://www.labmaker.org/products/miniscope-complete-set-of-components		para cirugía/revestimiento ficticio/revestimiento de base
Xylazine	X1126	Sigma-Aldrich; St. Louis, MO	para la eutanasia
Spray de bomba de xilocaína 10%		AstraZeneca; Sö dertä lje, Suecia	para cirugía