El presente estudio reporta un protocolo para el tamizaje cromosómico de embriones humanos que utiliza medio de cultivo gastado, lo que evita la biopsia embrionaria y permite la identificación de ploidía cromosómica mediante NGS. El presente artículo presenta el procedimiento detallado, que incluye la preparación del medio de cultivo, la amplificación del genoma completo (WGA), la preparación de la biblioteca de secuenciación de nueva generación (NGS) y el análisis de datos.
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Artículo de método
Cribado cromosómico de embriones humanos preimplantacionales mediante el uso de medios de cultivo gastados: recogida de muestras y análisis de ploidía cromosómica
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Resumen
Resumen
En la fertilización clínica in vitro (FIV), el método predominante para el PGT-A requiere la biopsia de unas pocas células del trofoectodermo (TE). Este es el linaje que forma la placenta. Este método, sin embargo, requiere habilidades especializadas, es invasivo y sufre de falsos positivos y negativos porque el número de cromosomas en el TE y la masa celular interna (MCI), que se desarrolla en el feto, no siempre son los mismos. La NICS, una tecnología que requiere la secuenciación del ADN que se libera en el medio de cultivo tanto desde TE como desde ICM, puede ofrecer una salida a estos problemas, pero se ha demostrado previamente que tiene una eficacia limitada. El presente estudio informa el protocolo completo de NICS, que incluye métodos de muestreo en medio de cultivo, amplificación del genoma completo (WGA) y preparación de bibliotecas, y análisis de datos de NGS mediante software de análisis. Teniendo en cuenta los diferentes tiempos de criopreservación en los diferentes laboratorios de embriones, los embriólogos tienen dos métodos para recolectar el medio de cultivo de embriones que se pueden seleccionar de acuerdo con las condiciones reales del laboratorio de FIV.
Introducción
Las tecnologías de reproducción asistida (TRA) se han utilizado cada vez más para el tratamiento de la infertilidad. Sin embargo, la tasa de éxito de las TRV, como la FIV, ha sido limitada, y la tasa de pérdida de embarazos es significativamente mayor que la de la población normal1. La principal causa de estos problemas son las anomalías cromosómicas, que existen comúnmente en los embriones humanos preimplantacionales2. El PGT-A es un método eficaz para evaluar el equilibrio cromosómico de los embriones antes de la implantación 3,4. Algunos estudios han demostrad....
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Protocolo
Se obtuvo el permiso ético del Comité de Ética del Tercer Hospital de la Universidad de Pekín.
1. Preparación
NOTA: Los materiales y equipos necesarios se enumeran en la Tabla de materiales.
- Reactivos
- Precalentar y equilibrar (equilibrado) 20-30 μL de medio de gametos/medio de fertilización y medio de cultivo de escisión/blastocisto (cubierto con aceite mineral) e hialuronidasa (en un tubo bien tapado) a 37 °C, 5% de CO2 y 5% deO2 en una incubadora Tri-gas durante la noche antes de su uso.
- Precalentar hialuronidasa a 37 °C sobre una superficie de ....
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Resultados
En el presente estudio se aplicó el método propuesto a un paciente. Se obtuvo la aprobación del IRB y el consentimiento informado antes de la aplicación del análisis NICS. En el presente estudio se obtuvieron 6 blastocistos de pacientes y se realizó NICS en los 6 embriones en el medio día 4 a día 5. Las anomalías cromosómicas causadas por la translocación equilibrada de los padres se detectaron en cinco de los cromosomas con el ensayo NICS; por lo tanto, no se podían utilizar para la transferencia (F.......
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Discusión
Modificaciones y solución de problemas
Si los resultados de la NICS están contaminados con materiales genéticos parentales, asegúrese de que se eliminen todas las células del cúmulo radiata de la corona y de que se realice la ICSI para la fertilización. Se evitan los procesos inadecuados de almacenamiento en el medio o de preparación de plantillas, que pueden degradar el ADN. El espacio de trabajo se purificó a fondo con reactivos de descontaminación de DNasa y RNasa. Para evi.......
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Divulgaciones
Yaxin Yao, Jieliang Ma, Jing Wang y Sijia Lu son empleados de Yikon Genomics Co., Ltd.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer a Shiping Bo y Shujie Ma por su ayuda en el análisis de datos de NGS. Financiamiento: este trabajo fue apoyado por el Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave (Subvención No. 2018YFC1003100).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Se recomiendan tubos EP de 1,5 mL, tubos de PCR de 0,2 mL | Axygen | MCT-150-C, PCR-02-C | sin DNasa/RNasa, tubos de PCR de baja unión y tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. |
| 10 y micro; L, 200 y micro; L, 1000 y micro; L Puntas sin DNasa / RNasa | Axygen | T-300-R-S, T-200-Y-R-S, T-1000-B-R-S | Esto puede ser reemplazado por otra marca / Para la transferencia de muestras |
| 100% etanol | Sinopharm Chemical | 10009218 | Esto puede ser reemplazado por otra marca / Para la purificación de bibliotecas de ADN Imprimación |
| de código de barras1-48 | Reactivo de genómica Yikon | en NICSipt kit de preparación de bibliotecas | para el plato |
| cultivo de órganos de amplificador BD Falcon, Estéril | BD Bioscience | 363037 | Esto puede ser reemplazado por otra marca / Para el cultivo de embriones |
| BD Falcon Platos de cultivo de tejidos (fácil agarre), | BD Bioscience | 353001 | Esto puede ser reemplazado por otra marca / Para el cultivo de embriones |
| BD Falcon Platos de cultivo de tejidos, estériles | BD Bioscience | 353002 | Esto puede ser reemplazado por otra marca / Para el cultivo de embriones |
| Tampón de lisis celular | Yikon Reactivo de genómica | en NICSikit de preparación de bibliotecas | para el pretratamiento del medio de cultivo |
| Enzima de lisis celular | Reactivo de Yikon Genomics | en NICSikit de preparación de bibliotecas | pretratamiento de medios de cultivo |
| Software ChromGo | Yikon Genomics Análisis de | datos | |
| CMPure Magbeads | Reactivo de Yikon Genomics | en NICSipta de preparación de bibliotecas | Para la purificación de bibliotecas |
| Cryotop open systerm | KITAZATO BioPharma | 81110 | Este puede ser reemplazado por otra marca/Para la vitrificación de embriones |
| Agua destilada | Reactivo de Yikon Genomics | en NICSitorio kit de preparación de la biblioteca | Para disolver ADN |
| ES (kit de vitrificación) | KITAZATO BioPharma | Reactivo inKit de vitrificación | Puede ser sustituido por otra marca/Para vitrificación de embriones |
| HOLDNIG | ORIGIO | MPH-MED-35 | Puede ser sustituido por otra marca/Para |
| solución de hialuronidasa ICSI, 80 U/mL | SAGE | ART4007-A | Puede ser sustituido por otra marca/Digest complejo ovocito-corona-cúmulo |
| ICSI | ORIGIO | MPH-35-35 | Esto puede ser reemplazado por otra marca / Para ICSI |
| Illumina MiSeq & reg; Sistema | Illumina | SY-410-1001 | Para secuenciación de bibliotecas |
| Incubadora | Labotect | Inkubator C16 | Esto puede ser reemplazado por otra marca/Para cultivo de embriones |
| Tampón de biblioteca | Reactivo de genómica Yikon en | NICSikit de preparación de bibliotecas | de biblioteca |
| enzimas de biblioteca | Reactivo de genómica Yikon en | NICSIn kit de preparación de bibliotecas | para bibliotecas Soporte magnético amplificaton |
| DynaMagTM-2 | 12321D | Para la purificación de bibliotecas | |
| Microscopio | OLYMPUS | 1X71 | Puede ser sustituido por otra marca/Para la observación de embriones |
| Minicentrífuga | ESSENSCIEN | ELF6 | Para la separación |
| MT Enzyme Mix | Yikon Genomics | Reactivo en NICSigenio de preparación de bibliotecas | Para el pretratamiento del medio de cultivo |
| NICSigenia de preparación | de bibliotecas Yikon Genomics | KT1000800324 | Amplificación del genoma completo y construcción de bibliotecas |
| NICSe estación de preparación de muestras | Yikon Genomics | ME1001003 | Amplificar DNA |
| Nunc IVF 4-well Dish Thermo | Scientific | 144444 | Esto puede ser reemplazado por otra marca/Para el lavado de embriones y el cultivo de blastocisto |
| Pasteur Pipeta | Oirgio | MXL3-IND-135 | Esto puede ser reemplazado por otra marca/Para pipetas de Tansfer |
| Pasteur | ORIGIO | PP-9-1000 | Esto puede ser reemplazado por otra marca/Para laboratorio de FIV |
| Pre-Lib Buffer | Yikon Genomics | Reagent en NICSimente kit de preparación de bibliotecas Preparación | previa |
| Pre-Lib Enzyme | Yikon Genomics | Reagent en NICSipta de preparación | de bibliotecas |
| Qubit® 3.0 Fluorímetro | Thermo Scientific | Q33216 | Para la cuantificación de bibliotecas |
| Quinn's Advantage Blastocyst Medium | SAGE | ART-1029 | Para el cultivo de embriones en estadio de blastocisto |
| Quinn's Advantage Cleavage Medium | SAGE | ART-1026 | Esto puede ser reemplazado por otra marca/Para el cultivo en etapa de escisión de embriones |
| Quinn's Advantage Fertilización Medio | SAGE | ART-1020 | Este puede ser reemplazado por otra marca/Para la fertilización de ovocitos y espermatozoides |
| Quinn's Advantage m-HTF Medium con HEPES | SAGE | ART-1023 | Esto puede ser reemplazado por otra marca/Para el desorden de embriones |
| Quinn's Advantage SPS Serum Protein Substitute Kit | SAGE | ART-3010 | Esto puede ser reemplazado por otra marca/Para desnudar el ovocito |
| Ventaja de Quinn Aceite mineral para cultivo de tejidos | SAGE | ART-4008P | Este puede ser reemplazado por otra marca/Para cubrir el medio de cultivo |
| PUNTAS DE DECAPANTE | ORIGIO | MXL3-IND-135 | Este puede ser reemplazado por otra marca/Para desnudar las células de la granulosa |
| Vitrificación Cryotop Open systerm | KIZTAZATO | 81111 | Este puede ser reemplazado por otra marca/Para la vitrificación de embriones Kit |
| de vitrificación KITAZATO BioPharma | VT101 | Esto puede ser reemplazado por otra marca/Para vitrificación de embriones | |
| Vortexer | Qilinbeier | DNYS8 | Sample mix |
| VS (Kit de vitrificación) | KITAZATO BioPharma | Reactivo inKit de vitrificación | Esto puede ser reemplazado por otra marca/Para la vitrificación de embriones |
| Sistema láser ZILOS-tk | Láser Hamilton Thorne | CLASE 1 | Esto puede ser reemplazado por otra marca/Para el colapso artificial de blastoceleo |
Referencias
- Barlow, P. Early pregnancy loss and obstetrical risk after in-vitro fertilization and embryo replacement. Human Reproduction. 3 (5), 671-675 (1988).
- Munne, S. Chromosome abnormalities and their relationshi....
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Reimpresiones y permisos
Erratum
Formal Correction: Erratum: Chromosome Screening of Human Preimplantation Embryos by Using Spent Culture Medium: Sample Collection and Chromosomal Ploidy Analysis
Posted by JoVE Editors on 10/01/2021. Citeable Link.
An erratum was issued for: Chromosome Screening of Human Preimplantation Embryos by Using Spent Culture Medium: Sample Collection and Chromosomal Ploidy Analysis. The Protocol and Representaive Results sections were updated.
In the Protocol, step 3.8.2 was updated from:
After logging into the system, click Create Submission under the NICS tab. Then, select the sequencing platform, choose ChromInst for the reagent, enter the project information in the box under Project ID, set the analysis preferences and upload the files. Once all sequencing files are successfully uploaded, click Submit to start the analysis (Figure 3A).
to:
After logging into the system, click Create Submission under the NICS-A tab. Then, choose NGS for the platform, select corporation, choose ChromInst for the reagent, enter the project information in the box under Project ID, set the analysis preferences and upload the files. Once all sequencing files are successfully uploaded, click Submit to start the analysis (Figure 3A).
In the Representative Results, Figure 3 was updated from:
Figure 3. Data Analysis. (A) The page of Create Submission. There are different options for the user application. For sequencing platform, users can choose Illumina or Ion Torrent. For analysis criterion, there are two length detection resolution for selection, the whole chromosome and whole arm level. The users also can choose whether the mosaicism or gender information is reported. Finished the above parameter setting,click on the box under File upload and choose the appropriate sequencing files to upload. For Illumina, choose the files with an extension of fastq.gz. For Ion Torrent platform, choose files with an extension of bam. Click Submit to start the analysis after successfully upload. (B) The view of summary table. The summary table consists of following information: Sample Name: The name of each NICS sample is listed; Data QC: Indicates whether the sequencing file passes the QC for NICS analysis; Conclusion: Indicates whether the NICS analysis is normal or abnormal, "N/A" indicates no conclusive result is available; Gender: If the user chooses to report the sex information, this column will appear in the summary table; Karyotype: Shows the analysis results; CNV plot (Whole Genome): View the CNV profiles of all chromosomes; CNV plot (By Chromosome): View the CNV profiles of each chromosome. (C) The Save Report Page. Click Export report button next to the Summary of Results. Select the information you want to show on the final report and click Export. Select Save File in the appearing dialog window and then click OK. The reports will be saved to the Download folder of the computer. Please click here to view a larger version of this figure.
to:
Figure 3. Data Analysis. (A) There are different options for the user application. For sequencing platform corporation, users can choose Illumina, Ion Torrent or MGI. The users can choose whether the gender information is reported. Finished the above parameter setting, click on the box under File upload and choose the appropriate sequencing files to upload. For Illumina, choose the files with an extension of fastq.gz. Click Submit to start the analysis after successfully upload. (B) The view of summary table. The summary table consists of following information: Sample Name: The name of each NICS sample is listed; Data QC: Indicates whether the sequencing file passes the QC for NICS analysis; AI Rating: The rating (A, B or C) for each NICS sample; AI_Rating Interpretation: Evaluation of embryo implantation potential; AI Grading: The score for each NICS sample; CNV plot (Whole Genome): View the CNV profiles of all chromosomes; (C) The Save Report Page. Click Export report button next to the Summary of Results. Select the information you want to show on the final report and click Export. The reports will be saved to the Download folder of your computer. Please click here to view a larger version of this figure.
