Artículo de método

Cribado cromosómico de embriones humanos preimplantacionales mediante el uso de medios de cultivo gastados: recogida de muestras y análisis de ploidía cromosómica

DOI:

10.3791/62619

⸱

7 de septiembre de 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Reproductive Medicine, Department of Obstetrics and Gynecology, Peking University Third Hospital, 2National Clinical Research Center for Obstetrics and Gynecology(Peking University Third Hospital), 3Ministry of Education, Key Laboratory of Assisted Reproduction (Peking University), 4Beijing Key Laboratory of Reproductive Endocrinology and Assisted Reproductive Technology, 5Department of Clinical Research, Yikon Genomics Co. Ltd.

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Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El presente estudio reporta un protocolo para el tamizaje cromosómico de embriones humanos que utiliza medio de cultivo gastado, lo que evita la biopsia embrionaria y permite la identificación de ploidía cromosómica mediante NGS. El presente artículo presenta el procedimiento detallado, que incluye la preparación del medio de cultivo, la amplificación del genoma completo (WGA), la preparación de la biblioteca de secuenciación de nueva generación (NGS) y el análisis de datos.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En la fertilización clínica in vitro (FIV), el método predominante para el PGT-A requiere la biopsia de unas pocas células del trofoectodermo (TE). Este es el linaje que forma la placenta. Este método, sin embargo, requiere habilidades especializadas, es invasivo y sufre de falsos positivos y negativos porque el número de cromosomas en el TE y la masa celular interna (MCI), que se desarrolla en el feto, no siempre son los mismos. La NICS, una tecnología que requiere la secuenciación del ADN que se libera en el medio de cultivo tanto desde TE como desde ICM, puede ofrecer una salida a estos problemas, pero se ha demostrado previamente que tiene una eficacia limitada. El presente estudio informa el protocolo completo de NICS, que incluye métodos de muestreo en medio de cultivo, amplificación del genoma completo (WGA) y preparación de bibliotecas, y análisis de datos de NGS mediante software de análisis. Teniendo en cuenta los diferentes tiempos de criopreservación en los diferentes laboratorios de embriones, los embriólogos tienen dos métodos para recolectar el medio de cultivo de embriones que se pueden seleccionar de acuerdo con las condiciones reales del laboratorio de FIV.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las tecnologías de reproducción asistida (TRA) se han utilizado cada vez más para el tratamiento de la infertilidad. Sin embargo, la tasa de éxito de las TRV, como la FIV, ha sido limitada, y la tasa de pérdida de embarazos es significativamente mayor que la de la población normal1. La principal causa de estos problemas son las anomalías cromosómicas, que existen comúnmente en los embriones humanos preimplantacionales2. El PGT-A es un método eficaz para evaluar el equilibrio cromosómico de los embriones antes de la implantación 3,4. Algunos estudios han demostrado que el PGT-A puede reducir la tasa de aborto y mejorar la tasa de embarazo 5,6,7,8. Sin embargo, el PGT-A requiere conocimientos técnicos complejos que requieren formación y experiencia específicas. El procedimiento invasivo de biopsia embrionaria también podría causar daño a los embriones9. Los estudios han demostrado que la biopsia de blastómeros puede dificultar el desarrollo posterior, y el número de TE biopsiadas puede afectar las tasas de implantación10. A pesar de que el problema de la biopsia embrionaria a largo plazo aún no ha sido evaluado a fondo en humanos, los estudios en animales han demostrado sus influencias negativas en el desarrollo embrionario11,12,13.

Informes anteriores indicaron que se secretaron trazas de materiales de ADN en el medio de cultivo durante el desarrollo embrionario, y se han realizado esfuerzos para realizar un cribado cromosómico completo (CCS) utilizando el medio de cultivo de embriones gastados 14,15,16,17,18. Sin embargo, las tasas de detección y la precisión de las pruebas no han cumplido con los requisitos para un uso clínico extensivo. El presente estudio reportó una mejoría en el ensayo NICS para aumentar las tasas de detección, así como la precisión de la prueba NICS19. En los últimos años, el líquido blastocelele (BF) se ha estudiado como una muestra analítica de PGT-A mínimamente invasiva. Sin embargo, la proporción de amplificación exitosa de todo el genoma y ADN detectable en muestras de líquido blastocisto oscila entre el 34,8% y el 82%20,21,22. El volumen de LM reportado en varios estudios oscila entre 0,3 nL y 1 μL. En vista de la baja cantidad de ADN en BF, es posible aumentar la cantidad de ADN libre de células mezclando líquido de blastocisto y medio de cultivo para mejorar la tasa de éxito y la consistencia de la detección. Kuznyetsov y cols.23 y Li et al.24 trataron la zona pelúcida con un láser y liberaron líquido blastocisto en el medio de cultivo para mejorar la cantidad total de ADN embrionario, y la tasa de amplificación de las muestras combinadas de medio/BF después de WGA fue del 100% y del 97,5%, respectivamente. Jiao et al.25 también obtuvieron una tasa de éxito de amplificación del 100% utilizando el mismo método.

El presente estudio reporta un protocolo detallado que incluye la preparación de la muestra de medios gastados, la preparación de NGS y el análisis de datos. Mediante la extracción cuidadosa de células cúmulos de ovocitos, el presente estudio realizó una inyección intracitoplasmática de espermatozoides únicos (ICSI) y un cultivo de blastocisto. El medio gastado del día 4 al día 5 y al día 6 se recolectó para la preparación de la biblioteca WGA y NGS. Mediante el uso de la tecnología NICS, el presente estudio agilizó los pasos de preparación de la biblioteca WGA y NGS en aproximadamente 3 h y obtuvo resultados de CCS de forma no invasiva en aproximadamente 9 h.

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Protocolo

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Se obtuvo el permiso ético del Comité de Ética del Tercer Hospital de la Universidad de Pekín.

1. Preparación

NOTA: Los materiales y equipos necesarios se enumeran en la Tabla de materiales.

  1. Reactivos
    1. Precalentar y equilibrar (equilibrado) 20-30 μL de medio de gametos/medio de fertilización y medio de cultivo de escisión/blastocisto (cubierto con aceite mineral) e hialuronidasa (en un tubo bien tapado) a 37 °C, 5% de CO2 y 5% deO2 en una incubadora Tri-gas durante la noche antes de su uso.
    2. Precalentar hialuronidasa a 37 °C sobre una superficie de trabajo en una campana extractora.
    3. Prepare el tampón de vitrificación y los reactivos de recolección de muestras de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
  2. Herramientas
    1. Prepare pipetas de recogida y transferencia de muestras (diámetro interior de ~200 a 250 μm), pipetas de denudación/extracción (diámetro interior de ≥150 μm, ~130-140 μm y ~120 μm) y pipetas para lavado (diámetro interior de ~150 μm) tirando de pipetas Pasteur de vidrio para generar puntas finas abiertas pulidas al fuego.
      NOTA: Las pipetas utilizadas para la recolección/transferencia de muestras, la denudación y el lavado se pueden comprar directamente. Las agujas de sujeción y las agujas de inyección también se pueden comprar directamente.

2. Protocolo 1: Recogida de muestras

  1. Pretratamiento del complejo ovocito-corona-cúmulo (OCCCs) antes de la digestión con hialuronidasa
    1. Logre la estimulación ovárica con preparaciones de hormona estimulante del folículo (FSH) y gonadotropina menopáusica humana (hMG). Cuando el folículo principal esté >18 mm, use 10,000 UI de gonadotropina coriónica (hCG) para la maduración final del ovocito.
    2. Realizar la extracción de ovocitos 36 h después del disparo gatillo. Recoja y transfiera los ovocitos a placas de cultivo de tejidos con 2,5 ml de m-HTF precalentado cubierto por aceite mineral.
    3. Transferir rápidamente los OCCC al pocillo central de una placa de cultivo de órganos que contenga 1 mL de medio de fertilización utilizando una pipeta de transferencia y luego incubar con los ovocitos a 37 °C en una incubadora de 5% de CO 2 y 5% de O 2 durante2-4 h.
  2. Digiera los OCCC con hialuronidasa añadiendo 1 ml de hialuronidasa precalentada a 37 °C (80 UI/ml) al pocillo central de una placa de cultivo de órganos que contenga OCCC (paso 2.1.3). Mantenga la concentración final de hialuronidasa en 40 UI/ml y mezcle bien.
    1. Incubar los OCCC en una plataforma térmica a 37 °C durante 2 min. Observe los cambios bajo un microscopio cada 30 s hasta que solo queden 1-2 capas de células de la granulosa.
  3. Denudación de las células de la granulosa
    1. Transfiera rápidamente los OCCC digeridos en la placa de cultivo para su manipulación de ovocitos y cúbralos con aceite mineral en cada pocillo.
    2. Observe las células de la granulosa separadas bajo un microscopio. Aspire suavemente y libere los ovocitos 5 veces para eliminar las células residuales de la granulosa alrededor de los ovocitos.
    3. Repita el paso anterior en los 3 pocillos restantes para eliminar completamente las células de la granulosa.
      NOTA: Los pasos anteriores (2.1-2.3) se pueden realizar de acuerdo con la operación rutinaria de cada laboratorio.
  4. Evaluación del ovocito
    1. Evalúe la integridad de la extracción de células de la granulosa con un microscopio. Si las células no se pudieron eliminar por completo, entonces la retención de 5 o menos células de la granulosa es aceptable en este momento.
      NOTA: Si las células del cúmulo todavía están adheridas al ovocito, el remanente se puede eliminar más tarde en el día 3 antes de que el embrión se transfiera del medio de cultivo en etapa de escisión al medio de cultivo en etapa de blastocisto.
  5. Después de realizar la inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI)26, transferir los ovocitos a microgotas de medio de cultivo embrionario de escisión de 20-30 μL (un ovocito corresponde a una microgota) utilizando pipetas de transferencia e incubar en una incubadora de 37 °C, 5% CO2 y 5%O2 .
    1. Registre el día de ICSI como día 0. Comprobar los embriones y puntuar según el taller de consenso de Estambul sobre evaluación embrionaria del día 1 para la fecundación (aproximadamente 18 h), el día 2 (aproximadamente 45 h) y el día 3 (aproximadamente 68 h) para la escisión embrionaria27.
  6. Lavado de embriones
    1. Preparar 20-30 μL de microgotas de medio de cultivo de blastocisto para cada embrión cubierto con aceite mineral en placas de cultivo de tejidos en el día 2 en una incubadora a 37 °C, 5% CO 2 y 5% O2.
    2. Prepare otras tres microgotas cubiertas con aceite mineral y etiquete las nuevas placas de cultivo de tejidos para el lavado No. 1-3.
    3. Transfiera los embriones del día 3 a las microgotas de lavado. Aspirar suavemente y liberar los embriones 3 veces en cada gota utilizando pipetas de denudación.
      NOTA: Este procedimiento también puede ayudar a eliminar las células granulares residuales adheridas al embrión.
    4. Observar y evaluar los embriones bajo un microscopio el día 3 antes de que el medio se cambiara de medio de cultivo en etapa de escisión a medio de cultivo de blastocisto para la puntuación morfológica. Si las células del cúmulo todavía estaban unidas al embrión, pipetear apropiadamente hacia arriba y hacia abajo en otra gota de medio de cultivo de blastocisto precalentada y equilibrada cubierta con aceite mineral con una pipeta separadora hasta que las células del cúmulo se eliminaron por completo.
      NOTA: Todas las células del cúmulo adheridas tuvieron que ser extraídas por completo el día 3 antes de que el embrión se transfiriera de la placa de medio de cultivo en etapa de escisión a la placa de medio de cultivo en etapa de blastocisto. Cualquier cúmulo restante interferirá en el análisis final y dará resultados falsos negativos.
  7. Dos opciones para la recolección del medio de cultivo
    NOTA: El centro de FIV puede elegir uno de los dos métodos para la recolección del medio de cultivo en función de los recursos, demandas y preferencias del centro.
    1. Opción 1: Lavado y cultivo de embriones
      NOTA: Esta opción es para los laboratorios de FIV que realizan vitrificación en la mañana del día 5.
      1. Transfiera el embrión a microgotas precalentadas (37 °C) de medio de cultivo y lave suavemente cada embrión en serie en 3 microgotas pipeteando el día 4 por la tarde.
      2. Transfiera cada embrión a una única microgota precalentada (37 °C) de medio de cultivo para la recogida de muestras. El volumen de una sola gota de medio de cultivo no puede exceder de 25 μL.
      3. Realizar cultivo embrionario de blastocisto el día 5/día 6 a 37 °C, 5% CO 2 y 5% O2.
    2. Opción 2: Lavado y cultivo de embriones
      NOTA: Esta opción es para laboratorios de FIV que realizan vitrificación el día 5 por la tarde o el día 6.
      1. Transfiera el embrión a microgotas precalentadas (37 °C) de medio de cultivo de 10-15 μL y lave suavemente cada embrión en serie en 3 microgotas pipeteando el día 5.
      2. Transfiera cada embrión a una única microgota precalentada (37 °C) de medio de cultivo para la recogida de muestras. El volumen de una sola gota de medio de cultivo no puede exceder de 15 μL.
      3. Realizar cultivo embrionario de blastocisto el día 5/día 6 a 37 °C y 5% de CO2.
  8. Recogida de muestras
    1. Ajuste suavemente el ICM a una distancia considerable del punto objetivo del rayo láser, que se enfoca en la unión celular del trofoectodermo para generar un pequeño orificio en el trofoectodermo para liberar el líquido de la cavidad del blastocelo. A continuación, los embriones se trasladan a una solución de congelación para su criopreservación según el proceso convencional.
    2. Transfiera el medio de cultivo de cada embrión cultivado a un tubo de PCR libre de RNasa/DNasa que contenga 5 μL de tampón de lisis celular.
    3. Recolectar la misma cantidad de medio de cultivo sin ser utilizado para el cultivo de embriones como control negativo. Congelar todas las muestras recogidas inmediatamente en nitrógeno líquido y luego almacenarlas a -80 °C después de recogerlas hasta que se sometan al ensayo NICS.
  9. Realice la vitrificación como se describe en el protocolo.

3. Protocolo 2: Construcción de la biblioteca

  1. Lisis del medio de cultivo
    1. Diluir 1 μL de control positivo (10 ng de ADNg humano) con 199 μL de medio de cultivo fresco. Mezclar bien y centrifugar el tubo brevemente (200 x g durante 5 s).
    2. Transfiera 10 μL de medio de cultivo de blastocistos de 5 a 6 días, control positivo diluido y medio de cultivo fresco a tubos de PCR nuevos de 0,2 ml.
    3. Añadir 1 μL de MT Enzyme Mix a cada tubo de PCR y mezclar bien pipeteando y centrifugando inmediatamente durante 2-3 s a 200 x g.
    4. Coloque los tubos de PCR del paso 3.1.3 en una estación de preparación de muestras NICS precalentada y ejecute el programa de lisis de la siguiente manera: 10 min a 75 °C; 4 min a 95 °C; mantener a 22 °C.
      NOTA: La estación de preparación de muestras es comparable a una máquina de PCR estándar.
      1. Haga clic en el icono Lysis para ingresar a la pantalla de configuración.
      2. Seleccione Tubo para el modo de control; entrada 10 μL para el volumen de la muestra; seleccione Activado para el control de tapa caliente e introduzca 105 °C para la temperatura. Seleccione No para Pausa en el primer intervalo. Haga clic en Aceptar para continuar.
      3. Espere hasta que el tiempo restante muestre --:-- :--, que indica el final del programa y, a continuación, haga clic en Detener para finalizar el programa.
    5. Detenga el programa una vez finalizado el proceso. Continúe con el siguiente paso inmediatamente.
  2. Preparación previa a la biblioteca
    1. Descongele el tampón Pre-Lib a RT. Mezcle bien pipeteando y centrifugue inmediatamente durante 2-3 s a 200 x g.
    2. Prepare una mezcla maestra para la reacción de prebiblioteca de la siguiente manera: agregue 2 μL de mezcla de enzimas Pre-Lib a 60 μL de tampón Pre-Lib, mezcle bien la reacción y centrifugue brevemente.
    3. Agregue 60 μL de mezcla de reacción de prebiblioteca en cada muestra de medio pretratada del paso anterior. Mezclar bien pipeteando y centrifugar inmediatamente durante 2-3 s a 200 x g.
    4. Coloque los tubos de PCR del paso 3.2.3 en la estación de preparación de muestras y ejecute el programa de prebiblioteca de la siguiente manera: 95 °C durante 2 min; 12 ciclos de 15 °C durante 40 s, 22 °C durante 40 s, 33 °C durante 30 s, 65 °C durante 30 s, 72 °C durante 40 s, 95 °C durante 10 s y 63 °C durante 10 s; y mantener a 4 °C.
      1. Haga clic en el icono Pre_Lib para entrar en la pantalla de configuración.
      2. Seleccione Tubo para el modo de control; entrada 70 μL para el volumen de la muestra; seleccione Activado para Control de tapa caliente e introduzca 105 °C para la temperatura. Seleccione No para Pausa en el primer intervalo. Haga clic en Aceptar para continuar.
      3. Espere hasta que el tiempo restante muestre --:-- :--, que indica el final del programa, y haga clic en Detener para finalizar el programa.
    5. Detenga el programa cuando se complete el proceso. Continúe con el siguiente paso inmediatamente.
  3. Preparación de la biblioteca
    1. Descongele el tampón de biblioteca a RT. Mezcle bien pipeteando y centrifugue inmediatamente durante 2-3 s a 200 x g.
    2. Prepare una mezcla maestra para la reacción de biblioteca de la siguiente manera: agregue 1,6 μL de mezcla de enzimas de biblioteca a 60 μL de tampón de biblioteca, mezcle bien la reacción y centrifugue brevemente.
    3. Agregue 60 μL de mezcla de reacción de biblioteca y 2 μL de cebador de código de barras a cada producto de prebiblioteca del paso 3.2.3. Mezcle bien la reacción y centrifugue brevemente.
    4. Coloque los tubos de PCR del paso 3.2.3 en el termociclador y ejecute el programa de preparación de la biblioteca de la siguiente manera: 94 °C durante 30 s; 17 ciclos de 94 °C durante 25 s, 62 °C durante 30 s y 72 °C durante 45 s); y luego mantener a 4 °C.
      1. Haga clic en el icono Lib_Prep para entrar en la pantalla de configuración.
      2. Seleccione Tubo para el modo de control; entrada 130 μL para el volumen de la muestra; seleccione Activado para el control de la tapa caliente e introduzca 105 °C para la temperatura correspondiente. Seleccione No para Pausa en el primer intervalo. Haga clic en Aceptar para continuar.
      3. Espere hasta que el tiempo restante muestre --:-- :--, que indica el final del programa, y haga clic en Detener para finalizar el programa.
  4. Purificación de la biblioteca
    1. Retire las Magbeads del almacenamiento a 2-8 °C durante al menos 20 minutos antes de la etapa de purificación. Vórtice y mezcle las Magbeads durante 20 s. Dispense suficientes perlas para el paso de purificación en un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y caliente las perlas a RT.
    2. Añade 1x Magbeads a cada biblioteca. Mezclar pipeteando hacia arriba y hacia abajo ≥10 veces e incubar a RT durante 5 min.
      NOTA: Por ejemplo, agregue 100 μL de Magbeads a 100 μL de muestra de biblioteca.
    3. Después de la incubación, centrifugue el tubo brevemente y colóquelo en un soporte magnético.
    4. Espere aproximadamente 5 minutos hasta que la solución se aclare. Mientras mantiene el tubo en el soporte magnético, aspire con cuidado la solución y deséchela.
    5. Añadir 200 μL de etanol al 80% recién preparado al tubo. Incubar a RT durante 30 s y retirar con cuidado el sobrenadante. Repite una vez más.
    6. Retire el etanol lo más completamente posible. Secar al aire las cuentas en el soporte magnético durante aproximadamente 5-10 minutos a RT.
    7. Retire el tubo del soporte magnético, agregue 17,5 μL de tampón de elución y haga un vórtice en el tubo para volver a suspender las perlas. Centrifugar el tubo brevemente e incubar a RT durante 5 min.
    8. Coloque el tubo en el soporte magnético y espere hasta que la solución se aclare. Transfiera con cuidado 15 μL de sobrenadante a un tubo nuevo.
  5. Cuantificación de bibliotecas
    1. Cuantifique las bibliotecas purificadas utilizando el fluorómetro de acuerdo con la guía del usuario de los kits de ensayo qubit dsDNA HS28. El rendimiento de las bibliotecas oscila entre ~15 y 300 ng.
  6. Agrupación de bibliotecas
    1. Utilice 10 nanogramos de cada muestra de biblioteca para la agrupación.
  7. Secuenciación
    1. Consulte la guía del usuario de secuenciación (15027617 v01)29.
    2. Las secuencias de biblioteca purificadas de 50 pb en un solo extremo de la plataforma produjeron aproximadamente 2 millones de lecturas para cada muestra, y se recomendó una profundidad de secuenciación de 0,03 ×.
  8. Análisis de datos
    1. Introduzca el nombre y la contraseña de los usuarios en la página de inicio de sesión
    2. Después de iniciar sesión en el sistema, haga clic en Análisis y aparecerá una nueva página. Haga clic en Crear envío en la pestaña NICS-A. A continuación, elija NGS para la plataforma, seleccione corporación, elija NICSInst para el reactivo, introduzca la información del proyecto en el cuadro de ID de proyecto, establezca las preferencias de análisis y cargue los archivos. Una vez que todos los archivos de secuenciación se hayan cargado correctamente, haga clic en Enviar para iniciar el análisis (Figura 3A).
    3. Haga clic en Ver envíos para mostrar la lista de proyectos enviados. Una vez finalizado el análisis, el estado de un proyecto pasará a ser Completado y aparecerá un botón Mostrar en el campo del informe. Haga clic en el botón Mostrar para ver la tabla de resumen del análisis de NICS (Figura 3B).
    4. Haga clic en el botón Exportar informe para guardar los informes (Figura 3C).
      NOTA: Se exportarán tres tipos de archivos para cada análisis. Un archivo gráfico que incluye todos los gráficos de variación del número de copias (CNV) para cada cromosoma y genoma completo, que se almacenará en la carpeta "graph"; una hoja de cálculo que contiene los detalles de control de calidad de muestra de esta ejecución de análisis; un archivo de documento que contiene los informes NICS personalizados por el usuario; y una hoja de cálculo que contiene la información de resumen de ejemplo de esta ejecución de análisis.

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Resultados

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En el presente estudio se aplicó el método propuesto a un paciente. Se obtuvo la aprobación del IRB y el consentimiento informado antes de la aplicación del análisis NICS. En el presente estudio se obtuvieron 6 blastocistos de pacientes y se realizó NICS en los 6 embriones en el medio día 4 a día 5. Las anomalías cromosómicas causadas por la translocación equilibrada de los padres se detectaron en cinco de los cromosomas con el ensayo NICS; por lo tanto, no se podían utilizar para la transferencia (F...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modificaciones y solución de problemas

Si los resultados de la NICS están contaminados con materiales genéticos parentales, asegúrese de que se eliminen todas las células del cúmulo radiata de la corona y de que se realice la ICSI para la fertilización. Se evitan los procesos inadecuados de almacenamiento en el medio o de preparación de plantillas, que pueden degradar el ADN. El espacio de trabajo se purificó a fondo con reactivos de descontaminación de DNasa y RNasa. Para evi...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yaxin Yao, Jieliang Ma, Jing Wang y Sijia Lu son empleados de Yikon Genomics Co., Ltd.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores desean agradecer a Shiping Bo y Shujie Ma por su ayuda en el análisis de datos de NGS. Financiamiento: este trabajo fue apoyado por el Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave (Subvención No. 2018YFC1003100).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Se recomiendan tubos EP de 1,5 mL, tubos de PCR de 0,2 mLAxygenMCT-150-C, PCR-02-Csin DNasa/RNasa, tubos de PCR de baja unión y tubos de microcentrífuga de 1,5 mL.
10 y micro; L, 200 y micro; L, 1000 y micro; L Puntas sin DNasa / RNasaAxygenT-300-R-S, T-200-Y-R-S, T-1000-B-R-SEsto puede ser reemplazado por otra marca / Para la transferencia de muestras
100% etanolSinopharm Chemical10009218Esto puede ser reemplazado por otra marca / Para la purificación de bibliotecas de ADN Imprimación
de código de barras1-48Reactivo de genómica Yikonen NICSipt kit de preparación de bibliotecaspara el plato
cultivo de órganos de amplificador BD Falcon, EstérilBD Bioscience363037Esto puede ser reemplazado por otra marca / Para el cultivo de embriones
BD Falcon Platos de cultivo de tejidos (fácil agarre),BD Bioscience353001Esto puede ser reemplazado por otra marca / Para el cultivo de embriones
BD Falcon Platos de cultivo de tejidos, estérilesBD Bioscience353002Esto puede ser reemplazado por otra marca / Para el cultivo de embriones
Tampón de lisis celularYikon Reactivo de genómicaen NICSikit de preparación de bibliotecaspara el pretratamiento del medio de cultivo
Enzima de lisis celularReactivo de Yikon Genomicsen NICSikit de preparación de bibliotecaspretratamiento de medios de cultivo
Software ChromGoYikon Genomics Análisis dedatos
CMPure MagbeadsReactivo de Yikon Genomicsen NICSipta de preparación de bibliotecasPara la purificación de bibliotecas
Cryotop open systerm  KITAZATO BioPharma81110Este puede ser reemplazado por otra marca/Para la vitrificación de embriones
Agua destiladaReactivo de Yikon Genomicsen NICSitorio kit de preparación de la bibliotecaPara disolver ADN
ES (kit de vitrificación)  KITAZATO BioPharmaReactivo inKit de vitrificaciónPuede ser sustituido por otra marca/Para vitrificación de embriones
HOLDNIGORIGIOMPH-MED-35Puede ser sustituido por otra
marca/Para
solución de hialuronidasa ICSI, 80 U/mLSAGEART4007-APuede ser sustituido por otra marca/Digest complejo ovocito-corona-cúmulo
ICSIORIGIOMPH-35-35Esto puede ser reemplazado por otra marca / Para ICSI
Illumina MiSeq & reg; SistemaIlluminaSY-410-1001Para secuenciación de bibliotecas
IncubadoraLabotectInkubator C16Esto puede ser reemplazado por otra marca/Para cultivo de embriones
Tampón de bibliotecaReactivo de genómica Yikon enNICSikit de preparación de bibliotecasde biblioteca
enzimas de bibliotecaReactivo de genómica Yikon enNICSIn kit de preparación de bibliotecaspara bibliotecas Soporte magnético amplificaton
DynaMagTM-212321DPara la purificación de bibliotecas
MicroscopioOLYMPUS1X71Puede ser sustituido por otra marca/Para la observación de embriones
MinicentrífugaESSENSCIENELF6Para la separación
MT Enzyme MixYikon GenomicsReactivo en NICSigenio de preparación de bibliotecasPara el pretratamiento del medio de cultivo
NICSigenia de preparaciónde bibliotecas Yikon GenomicsKT1000800324Amplificación del genoma completo y construcción de bibliotecas
NICSe estación de preparación de muestrasYikon Genomics  ME1001003Amplificar DNA
Nunc IVF 4-well Dish ThermoScientific144444Esto puede ser reemplazado por otra marca/Para el lavado de embriones y el cultivo de blastocisto
Pasteur PipetaOirgio  MXL3-IND-135Esto puede ser reemplazado por otra marca/Para pipetas de Tansfer
PasteurORIGIOPP-9-1000Esto puede ser reemplazado por otra marca/Para laboratorio de FIV
Pre-Lib BufferYikon GenomicsReagent en NICSimente kit de preparación de bibliotecas Preparaciónprevia
Pre-Lib EnzymeYikon GenomicsReagent en NICSipta de preparaciónde bibliotecas
Qubit® 3.0 FluorímetroThermo ScientificQ33216Para la cuantificación de bibliotecas
Quinn's Advantage Blastocyst MediumSAGEART-1029Para el cultivo de embriones en estadio de blastocisto
Quinn's Advantage Cleavage MediumSAGEART-1026Esto puede ser reemplazado por otra marca/Para el cultivo en etapa de escisión de embriones
Quinn's Advantage Fertilización MedioSAGEART-1020Este puede ser reemplazado por otra marca/Para la fertilización de ovocitos y espermatozoides
Quinn's Advantage m-HTF Medium con HEPESSAGEART-1023Esto puede ser reemplazado por otra marca/Para el desorden de embriones
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Referencias

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Reimpresiones y permisos

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Erratum

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Chromosome Screening of Human Preimplantation Embryos by Using Spent Culture Medium: Sample Collection and Chromosomal Ploidy Analysis
Posted by JoVE Editors on 10/01/2021. Citeable Link.

An erratum was issued for: Chromosome Screening of Human Preimplantation Embryos by Using Spent Culture Medium: Sample Collection and Chromosomal Ploidy Analysis. The Protocol and Representaive Results sections were updated.

In the Protocol, step 3.8.2 was updated from:

After logging into the system, click Create Submission under the NICS tab. Then, select the sequencing platform, choose ChromInst for the reagent, enter the project information in the box under Project ID, set the analysis preferences and upload the files. Once all sequencing files are successfully uploaded, click Submit to start the analysis (Figure 3A).

to:

After logging into the system, click Create Submission under the NICS-A tab. Then, choose NGS for the platform, select corporation, choose ChromInst for the reagent, enter the project information in the box under Project ID, set the analysis preferences and upload the files. Once all sequencing files are successfully uploaded, click Submit to start the analysis (Figure 3A).

In the Representative Results, Figure 3 was updated from:

Data analysis software screenshots, report export, computational results, chromatography data analysis.
Figure 3. Data Analysis. (A) The page of Create Submission. There are different options for the user application. For sequencing platform, users can choose Illumina or Ion Torrent. For analysis criterion, there are two length detection resolution for selection, the whole chromosome and whole arm level. The users also can choose whether the mosaicism or gender information is reported. Finished the above parameter setting,click on the box under File upload and choose the appropriate sequencing files to upload. For Illumina, choose the files with an extension of fastq.gz. For Ion Torrent platform, choose files with an extension of bam. Click Submit to start the analysis after successfully upload. (B) The view of summary table. The summary table consists of following information: Sample Name: The name of each NICS sample is listed; Data QC: Indicates whether the sequencing file passes the QC for NICS analysis; Conclusion: Indicates whether the NICS analysis is normal or abnormal, "N/A" indicates no conclusive result is available; Gender: If the user chooses to report the sex information, this column will appear in the summary table; Karyotype: Shows the analysis results; CNV plot (Whole Genome): View the CNV profiles of all chromosomes; CNV plot (By Chromosome): View the CNV profiles of each chromosome. (C) The Save Report Page. Click Export report button next to the Summary of Results. Select the information you want to show on the final report and click Export. Select Save File in the appearing dialog window and then click OK. The reports will be saved to the Download folder of the computer. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Data analysis software interface for embryo implantation potential; input form, result summary, export options.
Figure 3. Data Analysis. (A) There are different options for the user application. For sequencing platform corporation, users can choose Illumina, Ion Torrent or MGI. The users can choose whether the gender information is reported. Finished the above parameter setting, click on the box under File upload and choose the appropriate sequencing files to upload. For Illumina, choose the files with an extension of fastq.gz. Click Submit to start the analysis after successfully upload. (B) The view of summary table. The summary table consists of following information: Sample Name: The name of each NICS sample is listed; Data QC: Indicates whether the sequencing file passes the QC for NICS analysis; AI Rating: The rating (A, B or C) for each NICS sample; AI_Rating Interpretation: Evaluation of embryo implantation potential; AI Grading: The score for each NICS sample; CNV plot (Whole Genome): View the CNV profiles of all chromosomes; (C) The Save Report Page. Click Export report button next to the Summary of Results. Select the information you want to show on the final report and click Export. The reports will be saved to the Download folder of your computer. Please click here to view a larger version of this figure.

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