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Artículo de método

Preparación de virus de la influenza aviar H5 pseudotipificados con el método de transfección de fosfato de calcio y medición de la actividad neutralizante de anticuerpos

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DOI:

10.3791/62626

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22 de noviembre de 2021

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1Nanjing Advanced Academy of Life and Health, 2Institute of Animal Bio-technology, Jilin Academy of Agricultural Sciences, 3National Clinical Research Center for Infectious Diseases, Shenzhen Third People’s Hospital, Southern University of Science and Technology, 4CAS Key Laboratory of Molecular Virology and Immunology, Institut Pasteur of Shanghai, Chinese Academy of Sciences, University of Chinese Academy of Sciences

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Aquí describimos un protocolo para el empaquetado de pseudovirus y la medición de la actividad neutralizante de anticuerpos.

Resumen

Desde 1996, los virus H5 de la influenza aviar altamente patógena (HPAI) de linaje A/ganso/Guangdong/1/96 han estado causando brotes de influenza en aves de corral y aves silvestres. Ocasionalmente, los humanos también son víctimas de ella, lo que resulta en una alta mortalidad. No obstante, la investigación del virus HPAI a menudo se ve obstaculizada, teniendo en cuenta que debe manejarse dentro de los laboratorios de nivel 3 de bioseguridad. Para abordar este problema, los pseudovirus se adoptan como una alternativa a los virus de tipo salvaje en algunos experimentos de estudios de HPAI H5. Los pseudovirus demuestran ser las herramientas ideales para estudiar anticuerpos neutralizantes contra los virus H5 HPAI. Este protocolo describe los procedimientos y pasos críticos de las preparaciones de pseudovirus H5 HPAI y los ensayos de neutralización de pseudovirus. Además, se analiza la solución de problemas, la limitación y las modificaciones de estos ensayos.

Introducción

Desde 1996, los virus H5 de la influenza aviar altamente patógena (HPAI) de linaje A/goose/Guangdong/1/96 han estado causando brotes continuos de gripe en aves de corral y aves silvestres, lo que representa enormes pérdidas socioeconómicas en la industria avícola mundial. A veces, los humanos también se infectan con ella, enfrentándose a una alta tasa de mortalidad 1,2. Sin embargo, la investigación del virus HPAI a menudo se ve obstaculizada, dado que no se puede manejar fuera de los laboratorios de nivel 3 de bioseguridad. Para abordar este problema, los pseudovirus se adoptan como una alternativa a los virus de tipo salvaje en algunos experimentos de estudios de HPAI H5. Los pseudovirus son lo suficientemente seguros como para practicarlos en laboratorios de nivel 2 de bioseguridad.

Los pseudovirus H5 HPAI pertenecen a virus quiméricos que consisten en núcleos de virus sustitutos, envolturas lipídicas con glicoproteínas de superficie de los virus de la influenza y genes reporteros. Los núcleos de pseudovirus generalmente se derivan del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) lentiviral, retrovirus como el virus de la leucemia murina (MLV) y el virus de la estomatitis vesicular (VSV)3. Específicamente, el sistema de empaquetado del VIH-1 es ampliamente utilizado para producir pseudovirus de la influenza, donde los genes primarios proporcionados son gag y pol. El gen gag del VIH expresa proteínas centrales. El gen pol expresa la integrasa y la transcriptasa inversa, las cuales son necesarias para la expresión del gen reportero en las células transducidas. Imitando el genoma del virus sustituto, el gen reportero se adopta en el núcleo del pseudovirus en forma de ARN. El gen reportero expresará la proteína en las células huésped. Los niveles de expresión génica de los genes reporteros pueden ser utilizados para medir la eficiencia de la infección por pseudovirus 3,4. El reportero principal es luciferasa luciérnaga para medir las unidades de luminiscencia relativa (RLU) o la actividad relativa de luciferasa (RLA) en células transducidas. También se utilizan otros reporteros como lacZ, Gaussia y Renilla luciferasa, solo que en menor medida5.

Los pseudovirus son herramientas ideales para estudiar anticuerpos neutralizantes contra los virus H5 HAPI. Para medir la potencia de los anticuerpos neutralizantes, se utilizan ensayos de neutralización de pseudovirus (PN)6. La hemaglutinina (HA) y la neuraminidasa (NA) son glicoproteínas en la superficie del virus de la gripe A 7,8. El AH está compuesto por un dominio globular de la cabeza para la unión al receptor y un dominio del tallo para la fusión de la membrana. La proteína NA tiene la actividad sialidasa para facilitar la liberación del virus 7,8. Un ensayo de PN puede medir anticuerpos neutralizantes dirigidos a proteínas HA. Los anticuerpos neutralizantes dirigidos a la región de la cabeza y el tallo de HA también se pueden detectar mediante ensayos de unión viral y entrada. En comparación con los virus de tipo salvaje, los experimentos de neutralización de pseudovirus tienen valores de detección más sensibles, se pueden manejar de manera segura en un laboratorio de bioseguridad de Nivel 2 y, en general, son más fáciles de operar en la práctica.

Este protocolo presenta en detalle los procedimientos y pasos críticos de las preparaciones de pseudovirus H5 HPAI y los ensayos de PN. Además, se analiza la solución de problemas, la limitación y las modificaciones de estos ensayos. En este estudio, se utilizó como ejemplo la cepa A/Thailand/1(KAN)-1/2004(TH) de los virus H5N1 HPAI. Para obtener los sueros inmunes utilizados en los ensayos, este protocolo seleccionó la proteína HA procedente de la cepa TH como inmunógeno para inmunizar ratones.

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Protocolo

Todas las operaciones experimentales relacionadas con pseudovirus se realizaron bajo la condición ABSL2 en el Instituto Pasteur de la Academia China de Ciencias de Shanghai (IPS, CAS). Los experimentos con animales se realizaron con base en los protocolos animales aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de IPS, CAS.

1. Envasado de pseudovirus con transfección de fosfato de calcio

  1. Hacer suspensiones unicelulares de células HEK293FT (9 x 105 por ml) en medio DMEM completo (Tabla 1). Añadir 10 ml de las suspensiones unicelulares a un matraz T75, incubar las células en una incubadora de dióxido de carbono (CO2) al 5% a 37 °C durante 20 h antes de la transfección.
    NOTA: Se recomienda HEK293FT paso bajo (<20 pasajes). Asegúrese de que la monocapa celular sea 80-90% confluente.
  2. Reemplace el medio con 10 ml de medio completo fresco que contenga cloroquina (100 μM) 2 h antes de la transfección.
  3. Mezclar los reactivos y el ADN plásmido como se muestra en la Tabla 2 y la Figura 1: ddH 2 O, pCMV/R-HA, pCMV/R-NA, pHR-Luc, pCMV Δ 8.9, 2.5 M CaCl2y 2x tampón HEPES. Pipetear hacia arriba y hacia abajo 5 veces suavemente, incubar la mezcla a temperatura ambiente (RT) durante 20 min.
  4. Transfiera la mezcla al medio por encima de las células y balancee el matraz suavemente. Incubar las células en la incubadora de células durante 15 h.
  5. Reemplace el medio con 15 ml de medio DMEM completo fresco. Incubar las células en una incubadora deCO2 a 37 °C, 5% durante 65 h.
    NOTA: El color del medio será naranja claro o ligeramente amarillo, y al menos el 80% de la célula debe mostrar el efecto citopático (CPE) bajo el microscopio de luz invertida.
  6. Cosechar el sobrenadante y centrifugarlo a 2095 x g durante 20 min a 4 °C. Recoger el sobrenadante, alícuota y almacenarlo a -80 °C.

2. Detección de la expresión de la proteína HA, NA y VIH-1 p24 del pseudovirus de la gripe

  1. Detectar la expresión de la proteína HA mediante el ensayo de hemaglutinina (HA).
    1. Agregue 50 μL de PBS en las columnas 2-12, filas A, B y C de una placa de fondo redondo de 96 pocillos.
      NOTA: Las filas A, B y C pertenecen a 3 pruebas de replicación independientes, y la columna 12 se utiliza como control negativo.
    2. Añadir 100 μL de pseudovirus en los pocillos de la columna 1. Transfiera 50 μL de la columna 1 a la columna 2, mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo 5 veces, realice las diluciones dobles hasta la última columna 11 y deseche los 50 μL adicionales de la columna 11.
    3. Añadir 50 μL de eritrocitos al 0,5% en cada pocillo, pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo dos veces. Incubar la placa durante 30-60 min en RT o hasta que los eritrocitos del control negativo formen las manchas regulares en el fondo del pozo.
    4. Observar y registrar los títulos de HA del pseudovirus.
      NOTA: La unidad HA de los pseudovirus es el factor de dilución más alto del virus que puede causar el 100% de hemaglutinación de los glóbulos rojos.
  2. Detectar la expresión de proteínas HA y NA mediante el ensayo de Western blot.
    NOTA: Todos los pasos de Western blot se realizan de acuerdo con el manual de clonación molecular (4ª edición).
  3. Detectar la expresión de la proteína VIH-1 p24 mediante el kit ELISA VIH-1 p24 (Tabla de materiales).
    1. Añadir 50 μL del tampón de lisis en 450 μL de muestra de pseudovirus. Mézclalo bien.
    2. Agregue 300 μL del tampón de lavado a cada pocillo de la microplaca. Golpee la placa invertida para eliminar el tampón de lavado por completo. Repita el lavado 5 veces.
    3. Agregue 200 μL del patrón y muestree a cada pocillo por separado. Incubarlos a 37 °C durante la noche o durante 2 h.
    4. Aspirar el contenido de la placa y lavarla como se describe en el paso 2.3.2.
      NOTA: Deje un pocillo de la placa de ensayo vacío para usarlo como sustrato en blanco.
    5. Agregue 200 μL de anticuerpos del detector p24 a cada pocillo. Incubarlos a 37 °C durante 1 h. Aspirar y lavar la placa como se describe en el paso 2.3.2.
    6. Añadir 100 μL de la solución de trabajo estreptavidina-peroxidasa a cada pocillo e incubarlos a 37 °C durante 30 min. Aspirar y lavar la placa como se describe en el paso 2.3.2.
    7. Añadir 100 μL de la solución de trabajo del subestado a cada pocillo, incluido el pocillo en blanco del sustrato, e incubarlos a 37 °C durante 30 min.
      NOTA: El color azul se desarrollará en los pozos.
    8. Agregue 100 μL del tope de parada a cada pocillo.
      NOTA: El color azul cambiará a amarillo inmediatamente.
    9. Lea la densidad óptica a 450 nm en 15 min. Registrar los títulos de p24 del pseudovirus

3. Titulación de pseudovirus

  1. Haga suspensiones unicelulares de células MDCK (5 x 104 por ml) en medio DMEM completo, agregue 1250, 2500, 5000, 10000, 20000 y 40000 células a diferentes pocillos de una placa de fondo plano de 96 pocillos. Incubar las células en una incubadora deCO2 al 5% a 37 °C durante 20 h.
  2. Saque el pseudovirus del refrigerador a -80 °C, descongélelo en el hielo y haga un vórtice con el pseudovirus.
  3. Agregue 6 pseudovirus HAU (6x unidades HA) a cada pocillo de placa de fondo redondo de 96 pocillos y reponga cada pocillo con DMEM completo de hasta 120 μL.
  4. Pipetear arriba y abajo de la mezcla 5 veces para mezclar bien. Incubar la placa de mezcla en una incubadora deCO2 a 37 °C, al 5 % durante 1 hora.
  5. Transfiera 100 μL de la mezcla a las células en la placa de 96 pocillos. Vuelva a colocar la placa de cultivo celular en la incubadora durante 48 h, 60 h y 72 h después de la infección por virus.
  6. Saque la placa de la incubadora y realice el ensayo de luciferasa (Tabla de materiales).
  7. Retire el medio de los pocillos de la placa con cuidado. Enjuague las células con 200 μL de PBS y retire el PBS tanto como sea posible.
    NOTA: Voltea la placa y desecha el sobrenadante golpeándolo hacia atrás sobre papel absorbente. Si la línea celular de prueba no pudo adherirse firmemente a la parte inferior, retire la aspiración del medio con cuidado.
  8. Agregue 50 μL del tampón de lisis a cada pocillo y balancee la placa de cultivo varias veces. Conservar el plato a -80 °C durante la noche.
    NOTA: Mezcle 1 volumen de tampón de lisis 5x con 4 volúmenes de agua para hacer el tampón de lisis 1x. Equilibre el búfer de lisis 1x a RT antes de usarlo. Balancee la placa para asegurarse de que las células estén cubiertas completamente con el tampón de lisis. El proceso único de congelación-descongelación puede ayudar a que la célula se lise por completo.
  9. Sacar el plato, equilibrar a RT durante 2 h.
    NOTA: La célula debe ser lisada completamente.
  10. Balancee la placa varias veces suavemente y transfiera todos los lisados celulares a placas opacas de 96 pocillos.
  11. Agregue 50 μL del sustrato a cada pocillo, balancee la placa varias veces suavemente y mezcle bien el sustrato y el tampón de lisis.
  12. Mida la luz producida en 5 minutos con un luminómetro. Registre los títulos de luciferasa del pseudovirus.
    NOTA: Cuando se agrega un sustrato adecuado, la luz se emite como un subproducto a través de una reacción química en la que la luciferina se convierte en oxiluciferina por la enzima luciferasa. La cantidad de luz producida es proporcional a la cantidad de la enzima luciferasa.

4. Preparación de sueros inmunes

NOTA: El suero inmune se utilizará para experimentos relacionados con células, y la operación experimental debe llevarse a cabo en condiciones asépticas.

  1. Prepare 12 ratones hembra BALB/c de ocho semanas de edad. Divida por igual a los ratones en dos grupos.
    NOTA: Un grupo fue el grupo DDV y el otro fue el grupo de control negativo.
  2. Inmunización del grupo DDV: Prepare dos veces por vía intramuscular con 100 μg de un plásmido de ADN optimizado para codón que codifica la proteína HA A/Thailand/(KAN-1)/2004 (TH) en la semana 0 y la semana 3 y aumente una vez por vía intraperitoneal con 512 partículas similares al virus HAU TH (VLP) en la semana 6.
  3. Inmunización del grupo control: Prepara dos veces por vía intramuscular con 100 μg de ADN plásmido vectorial vacío en la semana 0 y la semana 3 y aumenta una vez por vía intraperitoneal con VLP gag VIH-1 en la semana 6.
  4. Recolectar la sangre del ratón 2 semanas después de la última inmunización.
    NOTA: Aquí, los ratones fueron anestesiados con pentobarbital sódico (65 mg / kg) en el momento de la recolección de sangre. Después de la recolección de sangre de la vena submandibular, los ratones fueron sacrificados inmediatamente conCO2.
  5. Mantener la sangre en RT durante 2 h, luego 4 °C durante la noche. Centrifugar a 900 x g durante 10 min a 4 °C y recoger el sobrenadante. Inactivar el suero colocándolo a 56 °C durante 30 min.
  6. Guarde los sueros inmunes en una nevera de -80 °C para su uso.
    NOTA: Consulte la Figura suplementaria 1 para el diagrama de flujo que describe los principales procedimientos de inmunización en ratones.

5. Ensayo de neutralización de pseudovirus (PN)

  1. Haga suspensiones unicelulares de células MDCK (5 x 104 por ml) en medio DMEM completo, y agregue 100 μL de la suspensión celular a cada pocillo de una placa de fondo plano de 96 pocillos. Incubar las células en una incubadora deCO2 al 5% a 37 °C durante 20 h.
  2. Saque el pseudovirus y los sueros del refrigerador a -80 ° C, descongélelos en el hielo y haga un vórtice a fondo.
  3. Diluir los sueros en el medio completo 20 veces y agregar 100 μL de medio DMEM completo a los pocillos de una placa de fondo redondo de 96 pocillos de las columnas 2-10.
  4. Añadir 200 μL de sueros diluidos en los pocillos de la columna 2, transferir 100 μL de la columna 2 a la columna 3, diluir los sueros como 1:20, 1:40, 1:80, etc., a 1:10240 sucesivamente de la columna 2 a la columna 10, y desechar los 100 μL de la columna 10.
  5. Añadir 100 μL de medio completo DMEM a los pocillos de la columna 11 como control negativo.
  6. Añadir 100 μL de pseudovirus a cada pocillo, pipetear hacia arriba y hacia abajo de la mezcla 5 veces a fondo, e incubar la placa de mezcla a 37 °C, 5% deCO2 durante 1 h.
  7. Transfiera 100 μL de la mezcla de la placa de fondo redondo de 96 pocillos al pocillo correspondiente de la placa de cultivo celular de 96 pocillos. Volver a colocar la placa en la incubadora (37 °C, 5%CO2) durante 60 h.
  8. Saque el plato de la incubadora. Realice el ensayo de luciferasa como se describe en los pasos 3.7-3.12.

6. Ensayo de unión de pseudovirus

  1. Haga suspensiones unicelulares de células MDCK (4 x 104 por ml) en medio DMEM completo, y agregue suspensiones celulares de 100 μL a cada pocillo en una placa de fondo plano de 96 pocillos. Incubar las células a 37 °C, 5%CO2 durante 20 h.
  2. Incubar el pseudovirus con sueros en DMEM que contenga 1% de BSA a 4 °C durante la noche.
    NOTA: El volumen de la mezcla es de 100 μL.
  3. Bloquear las células MDCK con 100 μL por pocillo de DMEM que contenga 1% de BSA a 4 °C durante 1 h.
  4. Inocular la mezcla de pseudovirus y suero (100 μL) en la monocapa de MDCK e incubarla a 4 °C durante 2 h.
  5. Lave la placa celular 4 veces con PBS que contenga 1% de BSA para eliminar cualquier virus no unido.
  6. Lise las células con 100 μL de tampón de lisis luciferasa a RT durante 30 min.
  7. Cuantificar la cantidad de virus unido en las células con un kit ELISA VIH-1 p24 como se describió anteriormente (sección 2.3).

7. Evaluación de la entrada viral

  1. Haga suspensiones unicelulares de células MDCK (5 x 104 por ml) en medio DMEM completo, y agregue 100 μL de la suspensión celular a cada pocillo de una placa de fondo plano de 96 pocillos. Incubar las células a 37 °C, 5% deCO2 durante 20 h antes del ensayo.
  2. Inocular el pseudovirus (100 μL) en una monocapa de MDCK en una placa de 96 pocillos a 4 °C durante 6 h.
  3. Lave la placa celular 4 veces con PBS que contiene 1% de BSA para eliminar los pseudovirus no unidos.
  4. Añadir 100 μL de sueros inmunes diluidos en serie o sueros de ratones de vacunación simulada en DMEM que contiene 1% de BSA a la monocapa, e incubar la célula a 4 °C durante 2 h.
  5. Retire el sobrenadante celular y lave la placa de cultivo celular 4 veces con PBS que contenga 1% de BSA.
  6. Añadir DMEM fresco a las células e incubar durante 60 h en una incubadora de 37 °C, 5% de CO2 .
  7. Mida la actividad relativa de la luciferasa (RLA) de las células como se describe en los pasos 3.7-3.12.
    NOTA: La entrada viral, según lo indicado por RLA, se expresó como un porcentaje de la lectura obtenida en ausencia de sueros, que se fijó en 100%.

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Resultados

Expresión de la proteína HA, NA y VIH-1 p24 del pseudovirus de la gripe
Para identificar la eficiencia del empaquetado viral, las existencias de pseudovirus de la influenza se detectaron primero mediante el ensayo de AH (Figura 2A). Las unidades de AH por mililitro de pseudovirus de influenza son 643 (Tabla 3). Se utilizó el ensayo Western blot y los ensayos ELISA sándwich para probar la expresión de la proteína p24 de HA, NA y VIH-1. Luego se calcularon ...

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Discusión

HEK293FT células se utilizan generalmente como células de empaquetamiento para producir pseudovirus. La detección regular de micoplasmas es esencial durante el cultivo celular. La contaminación por micoplasma puede disminuir drásticamente los rendimientos de pseudovirus y, a veces, cerca de cero. En comparación con otras contaminaciones, las contaminaciones por micoplasma no provocan cambios en el valor del pH ni en la turbidez del medio de cultivo celular. Incluso una alta concentración de micoplasma no es visible a sim...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por las becas de investigación del Proyecto de Desarrollo de Capacidades de Innovación de la provincia de Jiangsu (BM2020019), el Proyecto Científico y Tecnológico de Shenzhen (No. JSGG20200225150702770), el Programa de Investigación Estratégica Prioritaria de la Academia China de Ciencias (XDB29030103), el Proyecto Científico y Tecnológico de Guangdong (No. 2020B1111340076) y el Programa de Investigación Abierta del Laboratorio de la Bahía de Shenzhen (No. SZBL202002271003).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Reactivo al 1% Biocanal de eritrocitos de ChikenBC-RBC-C001Placas
cultivo celular de 96 pocillos (fondo plano)Material consumible167008Thermo fisher scientific
Placas de cultivo celular de 96 pocillos (fondo redondo)consumibleThermo fisher scientific163320
Reja Allegra X-15RBeckman -Equipo / Centrífuga
BD Jeringas de insulinaBD324910material consumible
Cloruro de calcio anhidroAMRESCO1B1110-500GReactivo
cloroquina difosfatoSelleckS4157Reactivo
Dulbecco' s Medio de águila modificado (DMEM)Gibco12100-046Reactivo
Suero fetal bovinoGibco16000-044Reactivo
HEK293FTGibcoR700-07Línea celular
HEPES FREE ACIDAMRESCO0511-250GReactivo
VIH-1 p24 ELISAAntígeno ZeptoMetrix801111Kit de reactivos
Sistema de ensayo de luciferasa Congelador PackPromegaE4530Kit de reactivos
MDCK.1ATCCCRL-2935Tubo
de microcentrífuga para líneas celulares 1,5 mLconsumibleThermo fisher scientific509-GRD-Q
Tubos de centrífuga cónicos Nunc 15 mLconsumibleThermo fisher scientific339650
centrífuga cónicos Nunc 50 mLThermo fisher scientific339652material consumible
Nunc EasYFlask 75 cm2Thermo fisher scientific156499 material consumible
Penicilina-EstreptomicinaGibco15140-122Puntas
(10 μ L)material consumibleThermo fisher scientificTF102-10-Q
(100 μ L)Thermo fisher scientificTF113-100-Qmaterial consumible
Puntas de pipeta (1000 μ L)consumibleThermo fisher scientificTF112-1000-Q
Pipetas serológicas (5 mL)consumibleThermo fisher scientific170355N
Pipetas serológicas (10 mL)consumibleThermo fisher scientific170356N
Tripsina/EDTAGibco25200-072Reactivo
Varioskan FlashThermo fisher scientific--Equipo/Lector de microplacas
Incubadora de camisa de aguaThermo fisher scientific3111Equipo/Incubadora
células Pentobarbital sal sódicaSigma57-33-0Reactivo
de de Material Material Material Tubos de de pipeta de reactivo Puntas de pipeta de Material Material Material de

Referencias

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