Este protocolo describe la extracción y visualización de proteínas agregadas y solubles de Escherichia coli después del tratamiento con un antimicrobiano proteotóxico. Seguir este procedimiento permite una comparación cualitativa de la formación de agregados proteicos in vivo en diferentes cepas bacterianas y/o entre tratamientos.
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Artículo de método
Extracción y visualización de agregados proteicos después del tratamiento de Escherichia coli con un estresor proteotóxico
En este artículo
Resumen
Resumen
La exposición de los organismos vivos a tensiones ambientales y celulares a menudo causa interrupciones en la homeostasis de las proteínas y puede resultar en la agregación de proteínas. La acumulación de agregados de proteínas en las células bacterianas puede conducir a alteraciones significativas en el comportamiento fenotípico celular, incluida una reducción en las tasas de crecimiento, resistencia al estrés y virulencia. Existen varios procedimientos experimentales para el examen de estos fenotipos mediados por factores estresantes. Este artículo describe un ensayo optimizado para la extracción y visualización de proteínas agregadas y solubles de diferentes cepas de Escherichia coli después del tratamiento con un antimicrobiano que contiene plata-rutenio. Se sabe que este compuesto genera especies reactivas de oxígeno y causa una agregación generalizada de proteínas.
El método combina una separación basada en centrifugación de agregados de proteínas y proteínas solubles de células tratadas y no tratadas con la posterior separación y visualización por electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE) y tinción de Coomassie. Este enfoque es simple, rápido y permite una comparación cualitativa de la formación de agregados proteicos en diferentes cepas de E. coli. La metodología tiene una amplia gama de aplicaciones, incluida la posibilidad de investigar el impacto de otros antimicrobianos proteotóxicos en la agregación de proteínas in vivo en una amplia gama de bacterias. Además, el protocolo se puede utilizar para identificar genes que contribuyen a aumentar la resistencia a las sustancias proteotóxicas. Las bandas de gel se pueden utilizar para la identificación posterior de proteínas que son particularmente propensas a la agregación.
Introducción
Las bacterias están inevitablemente expuestas a una miríada de tensiones ambientales, incluyendo pH bajo (por ejemplo, en el estómago de los mamíferos)1,2, especies reactivas de oxígeno y cloro (ROS / RCS) (por ejemplo, durante el estallido oxidativo en los fagocitos)3,4,5, temperaturas elevadas (por ejemplo, en aguas termales o durante el choque térmico)6,7, y varios antimicrobianos potentes (por ejemplo, AGXX utilizado en este protocolo)8
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Protocolo
1. Tratamiento de estrés de las cepas de E. coli MG1655 y CFT073
- Inocular 5 ml de caldo de lisogenia (LB) medio con una sola colonia de cepa commensal de E. coli MG1655 y cepa uropatógena de E. coli (UPEC) CFT073, respectivamente, e incubar durante 14-16 h (durante la noche) a 37 °C y 300 rpm.
NOTA: Escherichia coli CFT073 es un patógeno humano. El manejo de CFT073 debe realizarse con las medidas de bioseguridad apropiadas en un laboratorio certificado de Bioseguridad Nivel-2. - Diluir cada cepa en un matraz de 500 ml que contenga 70 ml de ácido 3-( N-morfolino)propanosulfónico (MOPS)-glucosa (MOPS-g) (T....
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Resultados
Figura 6: Resultados representativos de la agregación de proteínas inducida por antimicrobianos en la cepa commensal de Escherichia coli MG1655 y la cepa UPEC CFT073. Las cepas de E. coli MG1655 y CFT073 se cultivaron a 37 °C y 300 rpm a OD600= 0,5-0,55 en medios MOPS-g antes de ser tratadas con las concentraciones indicadas (-, 0.......
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Discusión
Este protocolo describe una metodología optimizada para el análisis de la formación de agregados proteicos después del tratamiento de diferentes cepas de E. coli con un antimicrobiano proteotóxico. El protocolo permite la extracción simultánea de fracciones de proteínas insolubles y solubles de células de E. coli tratadas y no tratadas. En comparación con los protocolos existentes para el aislamiento de agregados de proteínas de las células14,
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por los fondos de inicio de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Estatal de Illinois, la Subvención de la Iniciativa de Nueva Facultad de la Universidad Estatal de Illinois y la subvención del NIAID R15AI164585 (a J.-U. D.). G.M.A. fue apoyado por el Programa de Apoyo a la Investigación de Pregrado de la Universidad Estatal de Illinois (a G.M.A.). K. P. H. fue apoyado por una beca RISE proporcionada por el Servicio Alemán de Intercambio Académico (DAAD). Los autores agradecen al Dr. Uwe Landau y al Dr. Carsten Meyer de Largentech Vertriebs GmbH por proporcionar el polvo AGXX. Las Figuras 1, Figura 2,
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Químicos/Reactivos | |||
| Acetona | Fisher Scientific | 67-64-1 | |
| 30% Acrilamida/Bisacrilamida solución 29:1 | Bio-Rad | 1610156 | |
| Persulfato de amonio | Millipore Sigma | A3678-100G | |
| Benzonasa nucleasa | Sigma | E1014-5KU | |
| Bluestain 2 Escalera de proteínas, 5-245 kDa | GoldBio | P008-500 | |
| β-mercaptoetanol | Millipore Sigma | M6250-100ML | |
| Bromofenol azul | GoldBio | B-092-25 | |
| Coomassie Azul Brillante R-250 | MP Biomedicals LLC | 821616 | |
| D-Glucosa | Millipore Sigma | G8270-1KG | |
| D-Sacarosa | Acros Organics | 57-50-1 | |
| Ácido etilendiamina tetraacético (EDTA) | Sigma-Aldrich | SLBT9686 | |
| Ácido acético glacial | Millipore Sigma | ARK2183-1L | |
| Glicerol, 99% | Sigma-Aldrich | G5516-1L | |
| Glicina | GoldBio | G-630-1 | |
| Ácido clorhídrico, reactivo ACS | Sigma-Aldrich | 320331-2.5L | |
| Isopropanol (2-Propanol) | Sigma | 402893-2.5L | |
| Caldo LB (Miller) | Millipore Sigma | L3522-1KG | |
| Caldo LB con agar (Miller) | Millipore Sigma | L2897-1KG | |
| Lysozyme | GoldBio | L-040-25 | |
| 10x Tampón MOPS | Teknova | M2101 | |
| Nonidet P-40 | Thomas Scientific | 9036-19-5 | |
| Fosfato de potasio, dibásico | Sigma-Aldrich | P3786-1KG | |
| Fosfato de potasio, monobásico | Acros Organics | 7778-77-0 | |
| Dodecil sulfato de sodio (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771-500G | |
| Tetrametiletilendiamina (TEMED) | Millipore Sigma | T9281-50ML | |
| Tiamina | Sigma-Aldrich | T4625-100G | |
| 100% Ácido tricloroacético | Millipore Sigma | T6399-100G | |
| Tris base | GoldBio | T-400-1 | |
| Material/Equipo | |||
| centrífuga (15 mL) | Matraz Erlenmeyer Alkali Scientific | JABG-1019 | |
| (125 mL) | Matraz | Carolina 726686 | |
| Erlenmeyer (500 mL) | Congelador Carolina | 726694 | |
| : -80 ° C | Fisher Scientific | ||
| Perlas de vidrio (0,5 mm) | BioSpec Products | 1107-9105 | |
| Microcentrífuga | Hermle | Z216MK | |
| Tubos de microcentrífuga (1,7 mL) | VWR International | 87003-294 | |
| Tubos de microcentrífuga (2,0 mL) | Axygen Maxiclear Microtubos | MCT-200-C | |
| Cubetas | de plásticoFischer Scientific | 14-377-012 | |
| Fuente de alimentación | ThermoFisher Scientific | EC105 | |
| Rocker | Alkali Scientific | RS7235 | |
| Incubadora agitadora (37 ° C) | Benchmark Scientific | ||
| Placa de vidrio pequeña | Bio-Rad | 1653311 | |
| Placas espaciadoras (1 mm) | Bio-Rad | 1653308 | |
| Espectrofotómetro | Thermoscientific | 3339053 | |
| Centrífuga de sobremesa para tubos de centrífuga de 15 mL | Beckman-Coulter | ||
| Cámara de electroforesis de gel vertical | Bio-Rad | ||
| Vortexer | Fisher Vortex Genie 2 | 12-812 | |
| Thermomixer | Benchmark Scientific | H5000-HC | |
| 10 peine de pocillos | Bio-Rad | 1653359 |
Referencias
- Dahl, J. -U., et al. HdeB functions as an acid-protective chaperone in bacteria. Journal of Biological Chemistry. 290 (1), 65-75 (2015).
- Foit, L., George, J. S., Zhang, B. W., Brooks, C. L., Bardwell, J. C. A. Chaperone activation ....
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Reimpresiones y permisos
