Extracción y visualización de agregados proteicos después del tratamiento de Escherichia coli con un estresor proteotóxico

Las bacterias están inevitablemente expuestas a una miríada de tensiones ambientales, incluyendo pH bajo (por ejemplo, en el estómago de los mamíferos)^1,2, especies reactivas de oxígeno y cloro (ROS / RCS) (por ejemplo, durante el estallido oxidativo en los fagocitos)^3,4,5, temperaturas elevadas (por ejemplo, en aguas termales o durante el choque térmico)^6,7, y varios antimicrobianos potentes (por ejemplo, AGXX utilizado en este protocolo)⁸. Las proteínas son particularmente vulnerables a cualquiera de estos factores estresantes, y la exposición puede provocar el desplegamiento de proteínas que luego se agregan las semillas. Todos los organismos emplean sistemas de protección que les permiten hacer frente al mal plegamiento de proteínas⁹. Sin embargo, el estrés severo puede abrumar la maquinaria de control de calidad de proteínas e interrumpir la estructura secundaria y / o terciaria de las proteínas, que en última instancia inactiva las proteínas. Como consecuencia, los agregados de proteínas pueden afectar gravemente las funciones celulares críticas requeridas para el crecimiento y la supervivencia bacteriana, la resistencia al estrés y la virulencia¹⁰. Por lo tanto, la investigación centrada en la agregación de proteínas y sus consecuencias en las bacterias es un tema relevante debido a su impacto potencial en el control de enfermedades infecciosas.

El despliegue y la agregación de proteínas inducidas por el calor son a menudo reversibles⁷. Por el contrario, otras tensiones proteotóxicas, como el estrés oxidativo, pueden causar modificaciones irreversibles de las proteínas a través de la oxidación de cadenas laterales de aminoácidos específicos, lo que resulta en el desplegamiento / mal de la proteína y, eventualmente, la agregación de^{proteínas 4}. La formación inducida por estrés de agregados de proteínas insolubles ha sido ampliamente estudiada en el contexto de chaperonas moleculares y sus funciones protectoras en levaduras y bacterias^11,12,13. Se han publicado varios protocolos que utilizan una variedad de técnicas bioquímicas para el aislamiento y análisis de agregados de proteínas insolubles^14,15,16,17. Los protocolos existentes se han utilizado principalmente para estudiar la agregación de proteínas bacterianas tras el choque térmico y/o la identificación de chaperonas moleculares. Si bien estos protocolos ciertamente han sido un avance en el campo, hay algunos inconvenientes importantes en los procedimientos experimentales porque requieren (i) un gran volumen de cultivo bacteriano de hasta 10 L^14,17, (ii) procesos complicados de interrupción física, incluido el uso de disruptores celulares, prensa francesa y / o sonicación^14,15,17o (iii) procesos repetidos que consumen mucho tiempo pasos de lavado e incubación^15,16,17.

Este artículo describe un protocolo modificado que tiene como objetivo abordar las limitaciones de los enfoques anteriores y permite el análisis de la cantidad de agregados de proteínas formados en dos cepas diferentes de Escherichia coli después del tratamiento con un recubrimiento superficial antimicrobiano proteotóxico. El recubrimiento está compuesto por metal-plata (Ag) y rutenio (Ru)-acondicionado con ácido ascórbico, y su actividad antimicrobiana se logra mediante la generación de especies reactivas de oxígeno^8,18. Aquí hay una descripción detallada de la preparación del cultivo bacteriano después del tratamiento con el compuesto antimicrobiano y una comparación del estado de agregación de proteínas tras la exposición de dos cepas de E. coli con perfiles de susceptibilidad distintos a la concentración creciente del antimicrobiano. El método descrito es barato, rápido y reproducible y se puede utilizar para estudiar la agregación de proteínas en presencia de otros compuestos proteotóxicos. Además, el protocolo se puede modificar para analizar el impacto que las deleciones genéticas específicas tienen en la agregación de proteínas en una variedad de bacterias diferentes.

1. Tratamiento de estrés de las cepas de E. coli MG1655 y CFT073

1. Inocular 5 ml de caldo de lisogenia (LB) medio con una sola colonia de cepa commensal de E. coli MG1655 y cepa uropatógena de E. coli (UPEC) CFT073, respectivamente, e incubar durante 14-16 h (durante la noche) a 37 °C y 300 rpm.
   NOTA: Escherichia coli CFT073 es un patógeno humano. El manejo de CFT073 debe realizarse con las medidas de bioseguridad apropiadas en un laboratorio certificado de Bioseguridad Nivel-2.
2. Diluir cada cepa en un matraz de 500 ml que contenga 70 ml de ácido 3-( N-morfolino)propanosulfónico (MOPS)-glucosa (MOPS-g) (Tabla 1) medio a una densidad óptica a 600 nm (OD₆₀₀) valor de 0,1. Incubar a 37 °C y 300 rpm hasta que se alcance la fase logarítlica media (OD₆₀₀ = 0.5-0.55).
3. Transfiera 20 ml de cada cultivo a tres matraces precalentados de 125 ml e incube a 37 °C y 300 rpm durante 2 min.
   NOTA: Como se requiere el procesamiento oportuno de las muestras, no maneje más de 6 cultivos a la vez.
4. Preparar una solución de compuesto antimicrobiano en medio MOPS-g a una concentración de 2 mg/ml. Añadir el antimicrobiano a cada cultivo para alcanzar las concentraciones indicadas. Para el control no tratado, agregue el volumen requerido de medio MOPS-g.
   NOTA: Vórtice la solución antimicrobiana de 2 mg/ml para permitir una distribución uniforme de las partículas compuestas y evitar la sedimentación.
5. Incubar los cultivos durante 45 min a 37 °C y 300 rpm.

Figura 1: Tratamiento del estrés por Escherichia coli. Los cultivos bacterianos se cultivan en MOPS-g y se tratan con las concentraciones indicadas del antimicrobiano que contiene plata-rutenio cuando se alcanza la fase logarítrica media. Abreviaturas: LB = caldo de lisogenia; Ag-Ru = plata-rutenio; MOPS-g = 3-( N-morfolino)ácido propanosulfónico (MOPS)-glucosa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Recolección de muestras de células bacterianas

1. Después de 45 min de tratamiento de estrés, determine el OD₆₀₀ de cada cultivo. Para cada muestra, células de cosecha equivalentes a 4 mL de OD₆₀₀ = 1 en tubos centrífugo de 15 mL por centrifugación durante 15 min a 3.000 × g y 4 °C.
2. Retire completamente el sobrenadante y resuspón los gránulos celulares en 50 μL de tampón de lisis helado (Tabla 1). Incubar las muestras durante 30 min sobre hielo.
   NOTA: Este paso de lisis degrada la capa de peptidoglicano. Utilice siempre un tampón de lisis recién preparado.
3. Transfiera las muestras a tubos de microcentrífuga de 1,7 ml. Congelar a -80 °C hasta su uso posterior.

Figura 2: Recolección de muestras bacterianas. Las muestras celulares se cosechan por centrifugación y se resuspenden en tampón de lisis seguido de almacenamiento a -80 ° C. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Extracción de los agregados de proteínas insolubles

1. Descongelar muestras en hielo.
   NOTA: El ciclo de congelación-descongelación contribuye a la lisis celular.
2. Añadir 360 μL de tampón helado A (Tabla 1) y mezclar suavemente mediante pipeteo.
   NOTA: El choque osmótico también contribuirá a la lisis celular.
3. Transfiera la muestra a un tubo de microcentrífuga de 2 ml que contenga ~ 200 μL de perlas de vidrio de 0,5 mm. Incubar durante 30 min a 8 °C en un termomezclador con agitación a 1.400 rpm.
   NOTA: Este paso da como resultado la interrupción física de la célula. Se puede usar un inhibidor de la proteasa para minimizar la degradación de proteínas. La interrupción se puede realizar a 4 °C. Tenga en cuenta que se ha informado que el uso de perlas de vidrio induce la agregación de un pequeño subconjunto de proteínas en la levadura¹⁹.
4. Incubar durante 5 min sobre hielo sin agitar para asentar las perlas de vidrio. Transfiera 200 μL del lisato celular a tubos de microcentrífuga de 1,7 ml.
   NOTA: Evite la transferencia de las cuentas de vidrio.
5. Centrifugadora a 16.000 × g y 4 °C durante 20 min. Recoja el sobrenadante, que contiene proteínas solubles, y proceda a la sección 4.
6. Resuspend el pellet en 200 μL de tampón helado A (Tabla 1) utilizando la pipeta. Centrifugadora a 16.000 × g y 4 °C durante 20 min. Retire con cuidado el sobrenadante por completo.
7. Añadir 200 μL de tampón B helado (véase la Tabla 1 y la Tabla de Materiales)y resuspender cuidadosamente el pellet mediante pipeteo.
   NOTA: El detergente no iónico solubiliza la proteína de membrana.
8. Repetir la centrifugación a 16.000 × g y 4 °C durante 20 min. Retire con cuidado el sobrenadante.
9. Resuspend el pellet en 200 μL de tampón frío A (Tabla 1) mediante pipeteo. Centrifugadora a 16.000 × g y 4 °C durante 20 min. Retire completamente el sobrenadante.
10. Vuelva a colocar el pellet en 100 μL de tampón de muestra SDS reductor 1x (Tabla 1) y hierva durante 5 min a 95 °C en un termomezclador.
11. Guarde la muestra a -20 °C para continuar más tarde o cargarla inmediatamente en un gel de poliacrilamida SDS para su separación.

Figura 3: Extracción de agregados proteicos insolubles. La extracción de agregados de proteínas implica una serie de pasos que incluyen la interrupción celular, la separación de agregados de proteínas de proteínas de proteínas solubles, la solubilización de proteínas de membrana y el lavado. Abreviatura: SDS = dodecil sulfato de sodio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

4. Preparación de muestras de proteína soluble

1. Mezclar 1 volumen de ácido tricloroacético (TCA) 100% con 4 volúmenes de muestra de proteína soluble del paso 3.6.
   NOTA: El manejo de TCA requiere una campana extractora de humos y equipo de protección personal y un procedimiento de eliminación de desechos aprobado.
2. Incubar durante 10 min a 4 °C para permitir la precipitación de proteínas.
   NOTA: El precipitado blanco aparecerá muy pronto.
3. Centrifugar para precipitar a 21.000 × g y 4 °C durante 5 min y retirar el sobrenadante. Lave el pellet con 200 μL de acetona helada para eliminar los desechos celulares. Centrifugar a 21.000 × g y 4 °C durante 5 min y retirar el sobrenadante. Repita estas acciones en el paso 4.3 un total de tres veces.
4. Coloque los tubos de la microcentrífuga con tapas abiertas en un termomezclador a 37 °C para eliminar la acetona restante del pellet.
   NOTA: La incubación de más de 5 min puede reducir la solubilidad del pellet de proteína.
5. Añadir 100 μL de tampón SDS reductor 1x (Tabla 1) y disolver completamente el pellet. Hervir la muestra durante 5 min a 95 °C.
6. Almacene la muestra a -20 °C para continuar más tarde o cargue inmediatamente en un gel de poliacrilamida SDS para su separación.

Figura 4: Preparación de proteínas solubles. La preparación de proteína soluble implica un paso de precipitación con ácido tricloroacético y un lavado repetido con acetona helada. Abreviaturas: TCA = ácido tricloroacético; SDS = dodecil sulfato de sodio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

5. Separación y visualización de agregados proteicos extraídos utilizando SDS-PAGE

1. Prepare un gel de poliacrilamida SDS al 12%.
   1. Para dos geles separadores, pipetee 5,1 ml de agua de doble destilación (ddH₂O), 3,75 ml de solución de Tris-HCl (pH 8,8), 7,5 ml de SDS al 20% (p/v), 6 ml de solución de acrilamida/bisacrilamida al 30 % (29:1), 75 ml de persulfato de amonio al 10% y 10 ml de tetrametilendiamina (TEMED) en un tubo de centrífuga de 15 ml y mezcle suavemente sin introducir burbujas de aire. Vierta el gel con una pipeta de 1 ml dentro de las placas de vidrio, dejando los 2 cm superiores libres de la mezcla. Agregue un 70% de etanol en la parte superior del gel separador y permita una interfaz uniforme entre las dos capas.
   2. Después de la polimerización del gel separador, prepare el gel de apilamiento pipeteando 1.535 mL de ddH₂O, 625 mL de Solución de Tris-HCl (pH 6.8), 12.5 mL de SDS al 20% (p/v), 335 mL de solución de acrilamida/bisacrilamida al 30% (29:1), 12.5 mL de persulfato de amonio al 10% y 2.5 mL de TEMED. Retire el etanol de los geles separadores y agregue la solución de gel de apilamiento. Inserte un peine con el número deseado de bolsillos sin introducir burbujas de aire. Permitir la polimerización durante 20-30 min.
2. Cargue 4 μL de cada muestra y escalera de proteínas en pozos separados y ejecute el gel (s) en el tampón tris-Glycine (Tabla 1) a 144 V durante 45 min a temperatura ambiente.
   NOTA: Detenga el gel cuando la banda de bromofenoles esté a punto de migrar fuera del gel.
3. Manche el gel o geles en una solución A de Fairbanks precalenada (Tabla 1) durante 30 min en un balancín.
4. Decolore el gel (s) en una solución D de Fairbanks precalentada(Tabla 1)hasta el fondo deseado (por ejemplo, durante la noche) en un balancín.

Figura 5: Separación y visualización de proteínas. Las muestras se separan por SDS-PAGE y se visualizan mediante tinción de Coomassie. Abreviatura: SDS-PAGE = electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Resultados representativos de la agregación de proteínas inducida por antimicrobianos en la cepa commensal de Escherichia coli MG1655 y la cepa UPEC CFT073. Las cepas de E. coli MG1655 y CFT073 se cultivaron a 37 °C y 300 rpm a OD600= 0,5-0,55 en medios MOPS-g antes de ser tratadas con las concentraciones indicadas (-, 0 mg/mL; +, 175 mg/mL; ++, 200 mg/mL) del antimicrobiano durante 45 min. Se prepararon muestras de proteínas solubles e insolubles como se describe en el protocolo y en la Figura 1, Figura 2, Figura 3 y Figura 4 y se visualizaron en un gel de poliacrilamida SDS al 12%(Figura 5). La formación de agregados proteicos (fracción insoluble) se incrementó en ambas cepas en presencia del antimicrobiano, mientras que las cantidades de proteínas solubles disminuyeron. En general, el antimicrobiano tuvo un efecto mucho más potente sobre MG1655 que sobre CFT073. Abreviaturas: M= Marcador de proteína; UPEC = E. coli uropatógena; MOPS-g = 3-( N-morfolino)ácido propanosulfónico (MOPS)-glucosa; SDS = dodecil sulfato de sodio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Aquí, se utilizaron dos cepas de E. coli que difieren en su susceptibilidad a un antimicrobiano proteotóxico que contiene plata-rutenio para demostrar este protocolo. Los datos preliminares de supervivencia revelaron que la cepa de E. coli commensal MG1655 es significativamente más sensible al antimicrobiano generador de ROS que la cepa UPEC CFT073 (datos no mostrados). Ambas cepas se cultivaron en medios MOPS-g a 37 °C y 300 rpm. En la fase de logarítmica media, las células se dejaron sin tratar o se trataron con 175 μg/ml y 200 μg/ml del antimicrobiano, respectivamente, y se incubaron durante 45 min. Posteriormente, las células fueron lisadas, y los agregados de proteínas celulares se separaron de las proteínas solubles. Las proteínas en ambas fracciones se separaron por SDS-PAGE y se visualizaron mediante tinción de Coomassie. La fracción insoluble que se muestra en la Figura 6 representa la cantidad de agregados de proteínas formados, que se incrementó cuando las células se incubaron en presencia del antimicrobiano en comparación con las células no tratadas. El aumento en la formación de agregados proteicos fue independiente del fondo de la cepa, aunque se detectó un aumento mucho más pronunciado en la formación de agregados en la cepa más sensible MG1655. Por el contrario, se observaron cantidades más bajas de proteínas solubles (fracción soluble) después del tratamiento antimicrobiano de las células en comparación con la contraparte no tratada. Este resultado fue esperado dados los datos preliminares que mostraron una tolerancia sustancialmente mayor del antimicrobiano en CFT073 que mg1655.

Tabla 1: Búfer, medios y soluciones. Recetas para búfer, medios y soluciones utilizadas en este protocolo.

Los autores no tienen nada que revelar.