Describimos un método para generar retinoblastoma humano (RB) mediante la introducción de mutaciones bialélicas RB1 en células madre embrionarias humanas (hESC). Las líneas celulares RB también podrían cultivarse con éxito utilizando el RB aislado en una placa.
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Artículo de método
Reconstruir el retinoblastoma humano in vitro
En este artículo
Resumen
Resumen
La RB humana es un cáncer pediátrico, que es letal si no se administra tratamiento. Como RB se origina a partir de precursores de conos, lo cual es relativamente raro en modelos de roedores, mientras que con respecto a las diferencias entre especies entre humanos y roedores, un modelo de enfermedad derivado de humanos es más beneficioso para descubrir los mecanismos de RB humano y buscar los objetivos de la terapia. En este documento, el protocolo describe la generación de dos líneas hESC editadas genéticamente con una mutación puntual RB1 bialélica (RB1 Mut/Mut) y una mutación knockout RB1 (RB1-/-), respectivamente. Durante el proceso de desarrollo de la retina, se observa la formación de RB. Las líneas celulares RB también se establecen segregando de los organoides RB. En conjunto, al diferenciar las líneas hESC editadas genéticamente en los organoides retinianos utilizando un protocolo de diferenciación combinada 2D y 3D, hemos reconstruido con éxito el RB humano en un plato e identificado su origen precursor de conos. Proporcionaría un modelo de enfermedad útil para observar la génesis, proliferación y crecimiento del retinoblastoma, así como para desarrollar nuevos agentes terapéuticos.
Introducción
El retinoblastoma humano (RB) es un tumor raro y mortal derivado de los precursores del cono retiniano 1,2,3, es el tipo más común de neoplasia maligna intraocular en la infancia4. La inactivación homocigótica del gen RB1 es la lesión genética iniciadora en RB5. Sin embargo, los ratones con mutaciones RB1 no logran formar el tumor retiniano2. Aunque los tumores de ratón podrían generarse con la combinación de mutaciones Rb1 y otras modificaciones genéticas, todavía carecen de la....
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Protocolo
Este estudio está aprobado por el Comité de Ética institucional del Hospital Tongren de Beijing, Universidad Médica Capital. Las hESC H9 se obtienen del Instituto de Investigación WiCell.
1. Generación de hESC mutado RB1
- Vector de focalización CRISPR/Cas9 para el knockout (KO) de RB1.
- Diseña un par de sgRNA. Para la ablación de RB1, diríjase al primer exón de este gen. La secuencia de cebador hacia adelante es CACCGCGGTGGCGGCCGTTTTTCGG, y la secuencia de cebador inversa es AAACCCGAAAAACGGCCGCCACCGC.
NOTA: Para la mutación RB1 específica, también se requiere una plantilla reparada. E....
- Diseña un par de sgRNA. Para la ablación de RB1, diríjase al primer exón de este gen. La secuencia de cebador hacia adelante es CACCGCGGTGGCGGCCGTTTTTCGG, y la secuencia de cebador inversa es AAACCCGAAAAACGGCCGCCACCGC.
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Resultados
El procedimiento de generación de RB se dilucida en la Figura 1, que combina el cultivo adherente y flotante. Fue posible cosechar el RB humano de RB1-KO hESC y obtener la línea celular RB aislando los organoides RB.
Aquí, el protocolo proporciona los detalles de la diferenciación en diferentes etapas (Figura 2). Las esferas huecas se forman en los primeros 3 días que se adhieren a la superficie de cultivo y luego se expanden.......
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Discusión
El retinoblastoma humano (RB) es causado por la inactivación de RB1 y la disfunción de la proteína Rb. En este protocolo, el RB1-KO hESC es el paso fundamental para la generación de RB en un plato. Mientras que incluso con RB1-/- hESC, es posible que no haya formación de RB debido a los métodos de diferenciación de organoidesretinianos 10. En este protocolo, la transferencia de la cultura adherente a la cultura flotante es esencial en el proceso de diferenciac.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen conocimiento de ninguna afiliación, membresía, financiamiento o tenencia financiera que pueda afectar la objetividad de este estudio.
Agradecimientos
Agradecemos al equipo 502 por toda la ayuda. Este trabajo cuenta con el apoyo parcial de la Fundación Municipal de Ciencias Naturales de Beijing (Z200014) y el Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China (2017YFA0105300).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 2-mercaptoetanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| Anti-ARR3 | Sigma HPA063129 | Anticuerpo | |
| Anti-CRX (M02) | Abnove | ABN-H00001406-M02 | Anticuerpo |
| Anti-Ki67 | Abcam | ab15580 | Anticuerpo |
| Anti-Syk (D3Z1E) | Tecnología de señalización celular | 13198 | Anticuerpo |
| BbsI | NEB | R3539S | Enzimas de restricción |
| Dispasa (1U/mL) | Tecnologías de células madre | 7923 | |
| DMEM básico | Gibco | 10566-016 | |
| DMEM/F-12-GlutaMAX | Gibco | 10565-042 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| DPBS | Gibco | C141905005BT | |
| EDTA | Thermo | 15575020 | |
| Suero Fetal Bovino (FBS), Calificado para la Industria Biológica de Células Madre Embrionarias Humanas | 04-002-1A | ||
| Glutamina | Gibco | 35050-061 | |
| Mezcla de Nutrientes para Jamón F-12 (Jamones F12) | Gibco | 11765-054 | |
| MEM Solución de aminoácidos no esenciales (100X) | Sigma | M7145 | |
| Medio Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| P3 Célula Primaria 4D-Nucleofector X Kit S | Lonza | V4XP-3032 | Kit de nucleofección |
| Pluma Strep | Gibco | 15140-122 | |
| gen | la puromicina | ISY1130- 0025MG | |
| Kit de purificación QIAquick PCR | QIAGEN | 28104 | |
| ncEpic-hiPSC/hESC medio de cultivo | Nuwacell | RP01001 | ncEpic-hiPSC/hESC en 1.2.1 |
| Factor de crecimiento reducido Matriz de membrana basal | BD | 356231 | Matrigel en 1.2.1 |
| Enzima de disociación celular | Gibco | 12563-011 | TrypLE Express en 1.2.8 |
| RNeasy Midi Kit | QIAGEN | 75144 | |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | |
| Suplemento A Life | Technologies | 17502-048 | N-2 Suplemento (100X), líquido, supplemet in medum I |
| Suplemento B | Life Technologies | 17105-041 | B-27 Suplemento (50X),líquido, supplemet in medum I,II,III |
| T4 Polinucleótido quinasa | Life Technologies | EK0032 | |
| Taurina | Sigma | T-8691-25G | |
| Y-27632 2HCl | Selleck | S1049 | |
| pX330-U6- Quimérico BB-CBh-hSpCas9-2A-Puro | Addgene | 42230 | |
| Nucleofector 4D | Lonza | ||
| RPMI | Sigma | R0883-500ML |
Referencias
- Liu, H., et al. Human embryonic stem cell-derived organoid retinoblastoma reveals a cancerous origin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (52), 33628-33638 (2020).
- Singh, H. P., et al.
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Reimpresiones y permisos
