Artículo de método

Caracterización Unicelular De La Afluencia De Calcio Y La Infección Por VIH-1 Utilizando Una Plataforma Optofluídica Multiparámetro

DOI:

10.3791/62632

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18 de mayo de 2021

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1Department of Medicine, Division of Infectious Diseases, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Department of Genetics and Genomic Sciences, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, Icahn Institute of Data Science and Genomic Technology, 3Black Family Stem Cell Institute, Department of Genetics and Genomic Sciences, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, Icahn Institute of Data Science and Genomic Technology, 4Sema4, a Mount Sinai venture

En este artículo

Resumen

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Aquí, presentamos un protocolo en el cual las solas células se supervisan para los eventos agudos y la infección productiva HIV-1 en un dispositivo nanofluidic. Los datos de imágenes definen las interacciones virus-receptor huésped y la dinámica de la vía de señalización. Este es el primer método para el cultivo unicelular longitudinal nanofluídico de alto rendimiento y las imágenes para estudiar la cinética de señalización y las interacciones moleculares.

Resumen

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El VIH-1 causa una infección crónica que afecta a más de 37 millones de personas en todo el mundo. Las personas que viven con el virus de inmunodeficiencia humana (VIH) experimentan comorbilidad relacionada con la inflamación crónica a pesar de la terapia antirretroviral. Sin embargo, estas señales inflamatorias no se han caracterizado completamente. El papel de los eventos de entrada temprana en la activación de los eventos de señalización celular y la expresión génica aguas abajo no se ha capturado a nivel unicelular. Aquí los autores describen un método que aplica los principios de la microscopía de fluorescencia de células vivas a una plataforma unicelular automatizada que cultivos e imágenes de células a través de cursos de tiempo personalizados por el usuario, lo que permite el análisis de alto rendimiento de los procesos celulares dinámicos. Este ensayo puede rastrear la microscopía de fluorescencia en vivo unicelular de los eventos tempranos que siguen inmediatamente a la infección por VIH-1, en particular la afluencia de calcio que acompaña a la exposición al virus y el desarrollo de una infección productiva utilizando un virus reportero fluorescente. Las células MT-4 se cargan con un tinte sensible al calcio y se cultivan en plumas aisladas en un dispositivo nanofluídico. Las células cultivadas están infectadas con un virus reportero del VIH-1 (VIH-1 NLCI). Un microscopio de fluorescencia colocado por encima del dispositivo nanofluídico mide la afluencia de calcio durante un curso de tiempo de 8 minutos después de la exposición aguda al VIH-1. La infección productiva por VIH-1 se mide en esas mismas células durante un intervalo de 4 días. Los datos de imágenes de estos cursos de tiempo se analizan para definir las interacciones virus-receptor huésped y la dinámica de la vía de señalización. Los autores presentan una alternativa integrada y escalable a los métodos de imagen tradicionales utilizando una nueva plataforma optofluídica capaz de clasificar, cultivar, obtener imágenes y automatización de software unicelulares. Este ensayo puede medir la cinética de los eventos bajo diversas condiciones, incluyendo el tipo de célula, agonista, o efecto antagonista, mientras que la medición de una serie de parámetros. Este es el primer método establecido para el cultivo unicelular longitudinal nanofluídico de alto rendimiento y la imagen: Esta técnica se puede adaptar ampliamente para estudiar la cinética de señalización celular y las interacciones moleculares dinámicas.

Introducción

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La inflamación crónica es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad tempranas asociadas al VIH1,2,3. Hay mecanismos múltiples por los cuales el VIH pueda activar la señalización inflamatoria, y la evidencia reciente sugiere un papel de los receptores P2X en la entrada del VIH que son receptores de trifosfato de adenosina (ATP) de calcio-gating3,4,5,6,7,8,9,10. El subtipo P2X de receptores purinérgicos (P2XR) puede ser facilitadores importantes de esta inflamación. Sin embargo, los mecanismos moleculares de las interacciones VIH-P2XR son en gran parte desconocidos y pueden afectar los pasos tempranos y tardíos del ciclo de vida viral del VIH-1. Definir las vías y la cinética que impulsan la inflamación crónica asociada al VIH es fundamental para avanzar en las opciones de tratamiento para las personas con VIH.

Para evaluar si el VIH-1 agoniza directamente los receptores P2X, la activación de P2XR y la infección por VIH-1 deben medirse en paralelo. Los análisis de la actividad de P2XR y de la infección VIH-1 se han establecido independientemente: La afluencia celular del calcio es un indicador de la activación de P2XR, y la infección productiva VIH-1 se puede cuantificar por abundancia del ARN. La detección de fluorescencia de la afluencia de calcio es posible con el colorante sensible al calcio Fluo-4, y la infección por VIH-1 se puede visualizar con el virus reportero fluorescente mCherry VIH-NLCI11,12,13,14,15.

Debido a que estos indicadores de activación de P2X (afluencia celular aguda de calcio) y la infección por VIH-1 (síntesis de ARN VIH-1) ocurren en diferentes escalas de tiempo (minutos versus días), no hay un método de alto rendimiento que permita el análisis emparejado de la activación de P2XR y la infección por VIH-1. Las técnicas experimentales estándar de alto rendimiento, como la citometría de flujo, permiten el análisis de la población, pero no pueden evaluar la relación entre los eventos agudos y longitudinales en células individuales. Alternativamente, la proyección de imagen unicelular con microscopia estándar de la fluorescencia es de bajo rendimiento. Estas limitaciones experimentales presentan una necesidad de técnicas nuevas, de alto rendimiento para medir las asociaciones entre los eventos celulares agudos y longitudinales directamente.

Un sistema optofluídico descrito es una nueva plataforma capaz de clasificación y aislamiento unicelular, cultivo, imágenes y automatización de software16,17,18,19. Este sistema presenta una alternativa integrada y de alto rendimiento a las limitaciones de los métodos de imagen tradicionales. La plataforma Beacon consiste en una incubadora de dióxido de carbono (CO2)y temperatura controlada que soporta las células contenidas en un chip. El chip posee transistores fotosensibles que generan un gradiente eléctrico en respuesta a la luz dirigida. Esta fuerza dielectroforética resultante se utiliza para mover células individuales a través del chip nanofluídico a las regiones deseadas. Las células se clasifican en bolígrafos en el chip, que proporcionan una barrera para aislar las células individuales físicamente. El flujo laminar continuo de medios de crecimiento a través del chip evita la migración celular de las plumas al tiempo que permite la difusión de partículas pequeñas de nutrientes y reactivos específicos del experimento. Un microscopio de fluorescencia se encuentra por encima del chip. La automatización de software se utiliza para capturar imágenes del chip en el punto de tiempo especificado por el usuario.

Toda la caracterización celular se realizó utilizando un sistema optofluídico para la selección y manipulación unicelular. Este sistema consiste en componentes mecánicos, microfluídicos y ópticos integrados que permiten la manipulación unicelular, el ensayo, el cultivo y la obtención de imágenes. Las células se cargan y cultivan en el dispositivo nanofluídico desechable que consta de 3.500 cámaras individuales (bolígrafos), cada una capaz de contener el volumen sub-nanolitro. Las células pueden colocarse dentro de corrales utilizando "jaulas" dielectroforéticas inducidas por la luz y cultivarse en condiciones controladas por temperatura y CO2. La microfluídica permite la perfusión de medios o tampones en el chip para el cultivo celular o el tratamiento farmacológico. Una aguja accionada permite la importación y exportación de células de placas de pozo incubadas y obturadas. El área del chip se puede tomar imágenes a un aumento de 4x o 10x en canales fluorescentes y de campo brillante (incluidos DAPI, FITC, TRed o Cy5) para caracterizar fenotipos celulares o análisis funcional. Todo el sistema está automatizado mediante software que se puede utilizar para flujos de trabajo prediseñados o experimentos personalizados.

Se han estudiado las relaciones entre la infección por VIH-1 y P2XR, pero no se ha informado de un procedimiento de alto rendimiento para caracterizar directamente estas interacciones en paralelo. Aquí, los autores describen una metodología para estudiar las interacciones VIH-P2XR a través del seguimiento de la afluencia aguda de calcio y la posterior infección productiva por VIH-1 a nivel unicelular. En particular, esto establece una herramienta novedosa que permite la medición directa, de alto rendimiento y longitudinal de múltiples objetivos en celdas individuales.

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Protocolo

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1. Preparación de células para la proyección de imagen

  1. Prepare la solución de carga fresca Fluo-4 AM: Agregue 25 μL de disolvente detergente concentrado 100x, luego agregue 2.5 μL de Fluo-4 AM 1000x a un tubo de 1.5 mL. Vórtice para mezclar.
  2. Pipetear 2,5 mL de medios de cultivo en la solución de carga e invertir para mezclar. Proteger de la luz.
  3. Centrífuga 2 x 106 células MT-4 a 500 x g durante 3 min.
  4. Retire el medio y resuspend el pellet en 2 mL de la solución de carga Fluo-4 AM preparada. Proteger de la luz.
  5. Pipeta resuspended las células en una placa de Petri de 35 milímetros. Incubar a 37 °C durante 15-30 min, luego incubar durante 15-30 min adicionales a temperatura ambiente.
  6. Transfiera la suspensión de la célula a un tubo de centrífuga. Centrífuga las células a 500 x g durante 3 min y retire el sobrenadante que consiste en la solución de carga.
  7. Resuspend el pellet celular pipeteando en 1 mL del medio de cultivo y centrífuga a 500 x g durante 3 min para lavar.
  8. Resuspend el pellet celular pipeteando en el medio de cultivo a una concentración de 2 x 106 células/mL (mínimo 50 μL). Proteger de la luz.

2. Preparación del sistema optofluídico, carga celular y penning celular

  1. Prepare un chip con la solución humectante, lo que facilita el penning celular.
    1. Para ello, cargue tubos centrífugos que contengan 2 mL de solución humectante y 50 mL de agua DI en el instrumento con un nuevo chip optofluídico y ejecute la función Wet Chip. Esta función inundará automáticamente el chip con la solución humectante a través del sistema fluídico, incubará el chip a 50, °C y enjuagará el chip con agua 3 veces.
    2. Una vez que se haya realizado el lavado de agua, enjuague el chip con 3 ciclos de 250 μL de medio de cultivo.
  2. Complemente la suspensión celular del paso 1.8 con soluto detergente 1:100 F-127 antes de la carga para reducir la probabilidad de que las células se peguen a los canales de la viruta.
  3. Utilice la aguja de exportación del instrumento para importar celdas de un tubo centrífuga de 1,5 mL utilizando la operación de carga y la importación de volumen pequeño para un volumen de paquete de celdas de 5 μL.
  4. Celdas de pluma que utilizan un voltaje de posicionamiento optoelectrónico optimizado (OEP) de 4,3 V y 5 μm/s de velocidad de jaula. Penning se produce mediante OEP. Realice el penning usando la función Autopen, que detectará automáticamente las células individuales, las rodeará con una jaula OEP y las moverá a una pluma cercana. Si las celdas de interés permanecen después del etiquetado automático, utilice la función Lápiz manual para seleccionar las celdas de destino (con un clic del mouse) y un lápiz de destino (con un clic posterior del mouse).
  5. Una vez que se haya completado el penning (ya sea cuando se complete la función Autopen o cuando se haya alcanzado el número deseado de celdas colgadas), enjuague el chip con 3 ciclos de 250 μL de medios de cultivo para eliminar cualquier celda restante sin colgar del chip.

3. Infección unicelular e imágenes funcionales

  1. Después de escribir las células, obtenga imágenes fluorescentes de células en los canales FITC, Texas Red y DAPI para medir la línea de base Fluo-4, mCherry y autofluorescencia.
  2. Infundir el VIH-1 en el microchip a una concentración de 13 ng de VIH-1 NL-CI por 2 x 106 células pipeteando lentamente la suspensión en el chip a través de la aguja de exportación.
  3. Inmediatamente después de la adición del VIH-1, obtenga repetidamente imágenes en los canales FITC y DAPI durante un curso de tiempo de 10 minutos.
  4. Obtenga imágenes en los canales Texas Red y DAPI a los 1, 2, 3 y 4 días después de la infección (DPI).

4. Análisis de datos de imágenes funcionales unicelulares con el software FIJI

  1. En cada punto de tiempo de cada canal de imagen de interés, utilice la herramienta Fiji Point Selection y la función Measure para medir las señales Fluo-4, mCherry y autofluorescencia de cada célula. Mida simultáneamente la fluorescencia de fondo calculando la intensidad media de fluorescencia (IMF) de la pluma y el chip que contiene cada célula.
  2. Controle la fluorescencia y la autofluorescencia de fondo mediante la función Medir para encontrar la IMF en una selección de región y restar este valor del valor de fluorescencia celular.
  3. Normalizar la fluorescencia de fondo de cada imagen de chip: Mida la IMF del chip en cada campo. A continuación, reste la IMF del chip con la menor fluorescencia de fondo de todas las demás mediciones de MFI de chip.
  4. Normalizar la fluorescencia de fondo de cada pluma que contiene células: mida la IMF de la pluma de cada célula en cada campo de visión. A continuación, reste este valor de la IMF sin procesar de la celda para cada campo.
  5. Control para la autofluorescencia celular: Restar el día 0 y el día 4 DAPI MFI de cada célula del día 0 y día 4 mCherry MFIs.

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Resultados

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La Figura 1 ilustra el formato del chip y los datos de imágenes en bruto adquiridos a través del microscopio de fluorescencia. La identificación y agrupación de células no infectadas e infectadas a través de la medición de mCherry se muestran en la Figura 2. Estos grupos se analizan para la cinética de influjo de calcio en la Figura 3,que demuestra la afluencia temprana de calcio en las células infectadas por el VIH.

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Discusión

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La metodología descrita para estudiar la relación entre la afluencia de calcio y la infección productiva por VIH-1 en células individuales puede adaptarse para estudiar la cinética intracelular del calcio en respuesta a otros agonistas o antagonistas de interés. La preparación de las células para la obtención de imágenes es simple, requiere un tiempo mínimo, y los reactivos están disponibles en kits convenientes de fabricantes ampliamente utilizados. La medición de calcio basada en Fluo-4 está bien descrita en la literat...

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Divulgaciones

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R.P.S. es un empleado de Sema4. Los otros autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

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Estamos agradecidos por las discusiones científicas con el Dr. Benjamin Chen. Este trabajo fue financiado por K08AI120806 (THS), R01DA052255 (THS y KB) y R21AI152833 (THS y KB).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
  Sistema optofluídico de balizaBerkeley Lights
  Suero Fetal BovinoGibco
  Software decódigo abiertoPMID: 22743772, 22930834
  Kit de imágenes de calcio Fluo-4 ThermoFisher  F10489
  VIH-1 NLCINL4-3Laboratorio de Benjamin ChenPMID: 28148796
  Solución de estreptomicina de pennecilina HycloneGE Healthcare Ciencias de la vida  SV30010
  Células MT-4el SIDA de los NIH  ARP-120
  OptoSelect 3500 chipBerkeley Lights
  Puntas de pipetaDenville Scientific  P3020-CPS
  Prisma 9.0.0GraphPad
  RPMI-1640 MedioSigma-Aldrich  R8758
Pipetas serológicasmarca Fisher  13-678-11E
Campana de cultivo de tejidosVarios modelos
Matraces T75Corning3073
FIJI Reactivo para

Referencias

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