Artículo de método
Aquí, presentamos un protocolo en el cual las solas células se supervisan para los eventos agudos y la infección productiva HIV-1 en un dispositivo nanofluidic. Los datos de imágenes definen las interacciones virus-receptor huésped y la dinámica de la vía de señalización. Este es el primer método para el cultivo unicelular longitudinal nanofluídico de alto rendimiento y las imágenes para estudiar la cinética de señalización y las interacciones moleculares.
El VIH-1 causa una infección crónica que afecta a más de 37 millones de personas en todo el mundo. Las personas que viven con el virus de inmunodeficiencia humana (VIH) experimentan comorbilidad relacionada con la inflamación crónica a pesar de la terapia antirretroviral. Sin embargo, estas señales inflamatorias no se han caracterizado completamente. El papel de los eventos de entrada temprana en la activación de los eventos de señalización celular y la expresión génica aguas abajo no se ha capturado a nivel unicelular. Aquí los autores describen un método que aplica los principios de la microscopía de fluorescencia de células vivas a una plataforma unicelular automatizada que cultivos e imágenes de células a través de cursos de tiempo personalizados por el usuario, lo que permite el análisis de alto rendimiento de los procesos celulares dinámicos. Este ensayo puede rastrear la microscopía de fluorescencia en vivo unicelular de los eventos tempranos que siguen inmediatamente a la infección por VIH-1, en particular la afluencia de calcio que acompaña a la exposición al virus y el desarrollo de una infección productiva utilizando un virus reportero fluorescente. Las células MT-4 se cargan con un tinte sensible al calcio y se cultivan en plumas aisladas en un dispositivo nanofluídico. Las células cultivadas están infectadas con un virus reportero del VIH-1 (VIH-1 NLCI). Un microscopio de fluorescencia colocado por encima del dispositivo nanofluídico mide la afluencia de calcio durante un curso de tiempo de 8 minutos después de la exposición aguda al VIH-1. La infección productiva por VIH-1 se mide en esas mismas células durante un intervalo de 4 días. Los datos de imágenes de estos cursos de tiempo se analizan para definir las interacciones virus-receptor huésped y la dinámica de la vía de señalización. Los autores presentan una alternativa integrada y escalable a los métodos de imagen tradicionales utilizando una nueva plataforma optofluídica capaz de clasificar, cultivar, obtener imágenes y automatización de software unicelulares. Este ensayo puede medir la cinética de los eventos bajo diversas condiciones, incluyendo el tipo de célula, agonista, o efecto antagonista, mientras que la medición de una serie de parámetros. Este es el primer método establecido para el cultivo unicelular longitudinal nanofluídico de alto rendimiento y la imagen: Esta técnica se puede adaptar ampliamente para estudiar la cinética de señalización celular y las interacciones moleculares dinámicas.
La inflamación crónica es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad tempranas asociadas al VIH1,2,3. Hay mecanismos múltiples por los cuales el VIH pueda activar la señalización inflamatoria, y la evidencia reciente sugiere un papel de los receptores P2X en la entrada del VIH que son receptores de trifosfato de adenosina (ATP) de calcio-gating3,4,5,6,7,8,....
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1. Preparación de células para la proyección de imagen
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La Figura 1 ilustra el formato del chip y los datos de imágenes en bruto adquiridos a través del microscopio de fluorescencia. La identificación y agrupación de células no infectadas e infectadas a través de la medición de mCherry se muestran en la Figura 2. Estos grupos se analizan para la cinética de influjo de calcio en la Figura 3,que demuestra la afluencia temprana de calcio en las células infectadas por el VIH.
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La metodología descrita para estudiar la relación entre la afluencia de calcio y la infección productiva por VIH-1 en células individuales puede adaptarse para estudiar la cinética intracelular del calcio en respuesta a otros agonistas o antagonistas de interés. La preparación de las células para la obtención de imágenes es simple, requiere un tiempo mínimo, y los reactivos están disponibles en kits convenientes de fabricantes ampliamente utilizados. La medición de calcio basada en Fluo-4 está bien descrita en la literat.......
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R.P.S. es un empleado de Sema4. Los otros autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Estamos agradecidos por las discusiones científicas con el Dr. Benjamin Chen. Este trabajo fue financiado por K08AI120806 (THS), R01DA052255 (THS y KB) y R21AI152833 (THS y KB).
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| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Sistema optofluídico de baliza | Berkeley Lights | ||
| Suero Fetal Bovino | Gibco | ||
| Software de | código abierto | PMID: 22743772, 22930834 | |
| Kit de imágenes de calcio Fluo-4 Thermo | Fisher | F10489 | |
| VIH-1 NLCINL4-3 | Laboratorio de Benjamin Chen | PMID: 28148796 | |
| Solución de estreptomicina de pennecilina Hyclone | GE Healthcare Ciencias de la vida | SV30010 | |
| Células MT-4 | el SIDA de los NIH | ARP-120 | |
| OptoSelect 3500 chip | Berkeley Lights | ||
| Puntas de pipeta | Denville Scientific | P3020-CPS | |
| Prisma 9.0.0 | GraphPad | ||
| RPMI-1640 Medio | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Pipetas serológicas | marca Fisher | 13-678-11E | |
| Campana de cultivo de tejidos | Varios modelos | ||
| Matraces T75 | Corning | 3073 |
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