Identificación de empalme alternativo y poliadenilación en datos de RNA-seq

Resumen

El empalme alternativo (AS) y la poliadenilación alternativa (APA) amplían la diversidad de isoformas de transcripción y sus productos. Aquí, describimos protocolos bioinformáticos para analizar RNA-seq a granel y ensayos de secuenciación final 3' para detectar y visualizar AS y APA que varían según las condiciones experimentales.

Resumen

Además del análisis típico de RNA-Seq para medir la expresión génica diferencial (DGE) en condiciones experimentales / biológicas, los datos de RNA-seq también se pueden utilizar para explorar otros mecanismos reguladores complejos a nivel de exón. El empalme alternativo y la poliadenilación juegan un papel crucial en la diversidad funcional de un gen al generar diferentes isoformas para regular la expresión génica a nivel post-transcripcional, y limitar los análisis a todo el nivel del gen puede pasar por alto esta importante capa reguladora. Aquí, demostramos análisis detallados paso a paso para la identificación y visualización del uso diferencial del exón y el sitio de poliadenilación en todas las condiciones, utilizando Bioconductor y otros paquetes y funciones, incluidos DEXSeq, diffSplice del paquete Limma y rMATS.

Introducción

RNA-seq ha sido ampliamente utilizado a lo largo de los años, generalmente para estimar la expresión génica diferencial y el descubrimiento de genes¹. Además, también se puede utilizar para estimar el uso variable del nivel de exón debido a que los genes expresan diferentes isoformas, lo que contribuye a una mejor comprensión de la regulación génica a nivel post-transcripcional. La mayoría de los genes eucariotas generan diferentes isoformas mediante empalme alternativo (AS) para aumentar la diversidad de la expresión del ARNm. Los eventos AS se pueden dividir en diferentes patrones: salto de exones completos (SE) donde un exón ("casete") se el....

Protocolo

1. Instalación de herramientas y paquetes R utilizados en el análisis

1. Conda es un administrador de paquetes popular y flexible que permite la instalación conveniente de paquetes con sus dependencias en todas las plataformas. Use 'Anaconda' (administrador de paquetes conda) para instalar 'conda' que se puede usar para instalar las herramientas / paquetes necesarios para el análisis.
2. Descargue 'Anaconda' de acuerdo con los requisitos del sistema de https://www.anaconda.com/products/individual#Downloads e instálelo siguiendo las instrucciones en el instalador gráfico. Instale todos los paquetes necesarios usando 'conda<....

Resultados

Después de ejecutar el flujo de trabajo paso a paso anterior, los resultados del análisis AS y APA y los resultados representativos se presentan en forma de tablas y gráficos de datos, generados de la siguiente manera.

COMO:
El resultado principal del análisis AS (Tabla suplementaria 1 para diffSplice; Tabla 2 para DEXSeq) es una lista de exones que muestran el uso diferencial entre condiciones, y una lista de genes que muestran una activid.......

Discusión

En este estudio, evaluamos enfoques basados en exones y eventos para detectar AS y APA en datos masivos de RNA-Seq y secuenciación final 3'. Los enfoques de EA basados en exones producen tanto una lista de exones expresados diferencialmente como una clasificación a nivel de gen ordenada por la significación estadística de la actividad general de empalme diferencial a nivel de gen (Tablas 1-2, 4-5). Para el paquete diffSplice, el uso diferencial se determina ajustando modelos lineales ponderados a nivel d.......

Materiales

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