Method Article

Despliegue de AAV de construcciones de expresión basadas en potenciadores in vivo en cerebro de ratón

DOI:

10.3791/62650

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March 31st, 2022

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1Department of Psychiatry and Behavioral Sciences, University of California, Davis, 2Department of Neurobiology, Physiology and Behavior, University of California, Davis

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo describe un nuevo ensayo de potenciador transitorio-reportero basado en rAAV. Este ensayo se puede utilizar para inducir la expresión impulsada por potenciadores in vivo en el cerebro del ratón.

Abstract

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Los potenciadores son plataformas de unión para una amplia gama de factores de transcripción que impulsan patrones de expresión específicos de genes específicos de tejidos y tipos de células. Múltiples medios para evaluar el ADN no codificante y varios estados de cromatina han demostrado ser útiles para predecir la presencia de secuencias potenciadoras en el genoma, pero validar la actividad de estas secuencias y encontrar los órganos y las etapas de desarrollo en las que están activos es un proceso laborioso. Los avances recientes en vectores de virus adenoasociados (AAV) han permitido la entrega generalizada de transgenes a tejidos de ratón, lo que permite realizar pruebas de potenciadores in vivo sin necesidad de un animal transgénico. Este protocolo muestra cómo una construcción reportera que expresa EGFP bajo el control de un promotor mínimo, que no impulsa una expresión significativa por sí sola, puede usarse para estudiar los patrones de actividad de las secuencias de potenciadores candidatos en el cerebro del ratón. Una construcción de reportero empaquetada con AAV se entrega al cerebro del ratón y se incuba durante 1-4 semanas, después de lo cual se sacrifica al animal y se observan secciones cerebrales bajo un microscopio. EGFP aparece en células en las que el potenciador probado es suficiente para iniciar la expresión génica, señalando la ubicación y la etapa de desarrollo en la que el potenciador está activo en el cerebro. Los métodos de clonación estándar, el empaquetado de AAV de bajo costo y la expansión de los serotipos de AAV y los métodos para la administración in vivo y la lectura de imágenes estándar hacen de este un enfoque accesible para el estudio de cómo se regula la expresión génica en el cerebro.

Introduction

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Los potenciadores son elementos genómicos cis-reguladores que sirven como sitios de unión al factor de transcripción y pueden conducir la expresión de un gen diana de una manera espacio-temporal específica 1,2. Son diferencialmente activos en diferentes tipos celulares, tejidos y etapas de desarrollo y pueden ser sustratos de variación genómica relacionada con el riesgo de enfermedad 3,4. Por lo tanto, la necesidad de comprender la dinámica de la función potenciadora es fundamental para el progreso en las aplicaciones de la ciencia traslacional y básica dentro de la genómica. Las predicciones in silico de la actividad potenciadora pueden servir como excelentes recursos para generar hipótesis en cuanto a la capacidad potenciadora 5,6. Tal actividad potenciadora predicha puede requerir validación e interrogación adicionales para una comprensión completa de la actividad funcional. Los ensayos de Enhancer Reporter han demostrado ser valiosos para este propósito en una variedad de sistemas, desde células hasta animales 7,8,9. Con miras a extender estos estudios en un contexto transitorio in vivo flexible y rentable, este protocolo describe el uso de métodos in vivo basados en AAV para probar secuencias potenciadoras putativas por su capacidad para impulsar la expresión de un gen reportero ectópico en el cerebro postnatal del ratón. Esta familia de métodos tiene utilidad para interrogar secuencias candidatas individuales o cribado paralelo de bibliotecas y es relevante para la investigación básica y traslacional.

Este método combina en un solo plásmido una secuencia de ADN candidato potenciador putativo con un gen reportero (aquí EGFP), bajo el control de un promotor mínimo que por sí solo no impulsa una expresión significativa. El plásmido se empaqueta en AAV recombinante (rAAV) y se inyecta en un modelo animal. Si bien la aplicación aquí es al cerebro, varios serotipos de rAAV permiten la infección a través de diferentes tipos de tejidos, de modo que este enfoque puede extenderse a otros sistemas10. Después de un período de tiempo, el cerebro puede ser recolectado y ensayado para la expresión del gen reportero. La expresión fuerte, en comparación con los controles, indica que la secuencia candidata probada fue capaz de "mejorar" la expresión del gen (Figura 1). Este diseño simple ofrece un enfoque fácil y claro para probar una secuencia de actividad potenciadora in vivo en el cerebro.

Además de probar la capacidad potenciadora de una secuencia, este método se puede combinar con técnicas para determinar la actividad potenciadora del tipo celular. En los enfoques basados en secuencias para determinar la actividad potenciadora diferencial, la clasificación de células en marcadores específicos de tipo celular antes de la secuenciación de ADN y ARN puede permitir a los investigadores determinar si diferentes tipos de células muestran actividad potenciadora diferencial, como se describió en Gisselbrecht et al.11. En los enfoques basados en imágenes, el etiquetado conjunto de imágenes con marcadores específicos del tipo de célula permite examinar si las células que exhiben fluorescencia impulsada por potenciadores también muestran marcadores de tipo celular de interés 12,13,14,15,16. Los ensayos de reportero de potenciadores permiten realizar pruebas directas de la variación alélica asociada al riesgo en los potenciadores para detectar efectos sobre la capacidad del potenciador. La gran mayoría de los loci de riesgo identificados en los estudios de asociación de genoma completo (GWAS) se encuentran en regiones no codificantes del genoma17. Los estudios de anotación funcional de estos loci de riesgo indican que una gran parte probablemente actúa como potenciadores18,19,20. El despliegue de MPRA in vivo puede permitir probar estas variantes asociadas al riesgo para la actividad potenciadora en el cerebro12,21. Finalmente, la entrega y la recolección en diferentes puntos de tiempo pueden ofrecer información sobre las etapas de desarrollo durante las cuales un potenciador está activo.

Los diseños de plásmidos potenciadores-reporteros son diversos y se pueden personalizar para adaptarse a los objetivos experimentales. Hay varias opciones para promotores mínimos que se han utilizado en la investigación de potenciadores, como el promotor mínimo de β-globinahumana 22 y el promotor mínimo de ratón Hsp6823. Se sabe que estos promotores impulsan bajos niveles de expresión a menos que se combinen con un elemento potenciador para activarlos. En contraste, los elementos promotores constitutivos impulsan la expresión fuerte del transgén, útil para el control positivo o para probar la función potenciadora en un contexto de expresión robusta. Las opciones comunes para los promotores constitutivos incluyen CAG, un promotor híbrido derivado del promotor de β actina de pollo y el potenciador inmediato temprano del citomegalovirus24, o EF1α25 humano. Dado que se sabe que los potenciadores funcionan bidireccionalmente26, la orientación y la ubicación del potenciador en relación con el promotor mínimo son flexibles (Figura 2A). Los ensayos tradicionales de potenciador-reportero colocan el potenciador aguas arriba del promotor y, en las entregas de la biblioteca, incluyen una secuencia de código de barras aguas abajo del gen reportero para asociar las lecturas de secuenciación con el potenciador probado27. Sin embargo, los potenciadores también se pueden colocar en el marco de lectura abierto del gen reportero y servir como su propia secuencia de código de barras, como se hace en STARR-seq28. El protocolo descrito aquí utiliza el diseño del ensayo STARR-seq, colocando la secuencia del potenciador candidato en el UTR 3' del gen reportero. Si bien la orientación STARR-seq ofrece el beneficio de una clonación más simplificada, es menos conocida que el enfoque convencional y puede inducir una estabilidad variable del ARN entre las construcciones. Los métodos descritos pueden adaptarse fácilmente a la orientación STARR-seq o convencional con alteraciones menores en el proceso de clonación que se han descrito en otra parte27,29.

Se pueden emplear diferentes métodos de administración de AAV para personalizar aún más esta técnica para que se ajuste a los objetivos experimentales (Figura 2B). Las inyecciones intracraneales directas, descritas más adelante en este protocolo, entregan una alta concentración de virus directamente al cerebro30. Esto proporciona una alta eficiencia de transducción centrada en el sitio de inyección, lo que la convierte en una excelente técnica para experimentos que buscan maximizar la densidad de las células transducidas sobre un área de tejido. La inyección estereotáctica puede ayudar a estandarizar el sitio de inyección en animales para la transducción localizada reproducible. Las inyecciones intracraneales son más sencillas en animales postnatales tempranos. Como técnica alternativa, las inyecciones sistémicas pueden entregar transgenes utilizando AAVs con serotipos capaces de cruzar la barrera hematoencefálica31. Las inyecciones en las venas de la cola permiten que el virus circule por todo el cuerpo, lo que permite la administración generalizada a través de muchos tejidos10. Las inyecciones retroorbitarias son otra técnica de inyección sistémica que libera el virus detrás del ojo en el seno retroorbitario32. Esto ofrece una ruta más directa para el AAV desde el sistema venoso hasta el cerebro, resultando en una mayor concentración de células transducidas en el cerebro que las inyecciones en vasos sanguíneos más periféricos33.

Otro aspecto flexible de esta técnica es el método de lectura. En términos generales, las opciones pueden describirse como basadas en reporteros o en secuenciación (Figura 2C). La incorporación de un reportero fluorescente como GFP en el marco de lectura abierto del constructo da como resultado la expresión de la proteína fluorescente en cualquier célula transducida donde el potenciador candidato impulsó la expresión. Las técnicas de etiquetado e imagen, como la inmunohistoquímica, permiten la amplificación de la señal. Las técnicas de lectura basadas en la secuenciación implican la identificación de secuencias de la construcción entregada en ARN recolectado del tejido. Al cuantificar la cantidad de ADN viral que se entregó inicialmente, la comparación del ARN expresado versus el ADN entregado se puede utilizar para determinar el grado en que una secuencia potenciadora probada fue capaz de impulsar una mayor expresión del transgén, por ejemplo, en el contexto de un ensayo de reportero masivamente paralelo (MPRA). Los MPRA ofrecen una poderosa expansión de estas técnicas para probar hasta miles de potenciadores candidatos para la actividad simultáneamente y se han descrito ampliamente en la investigación genómica 12,27,34,35,36. Se logra una mayor detección de rendimiento mediante la ejecución de pasos de clonación, empaquetado, entrega y secuenciación para los potenciadores candidatos en lotes en lugar de individualmente.

La selección del potenciador candidato ofrece otra oportunidad para la flexibilidad (Figura 2D). Por ejemplo, este ensayo se puede utilizar para identificar potenciadores de un gen específico, para determinar la función de las regiones de interés del ADN no codificante, o para determinar tipos específicos de células o etapas de desarrollo durante las cuales un potenciador está activo, todo lo cual sirve para objetivos tanto en la ciencia básica como en la investigación de enfermedades. En general, la selección del potenciador candidato está impulsada por predicciones in silico de la actividad del potenciador. Comúnmente, las predicciones in silico incluyen ChIP-seq para modificaciones de histonas que indican potenciadores probables, como H3K27ac37 y mapeo de accesibilidad de cromatina38. Finalmente, un área de investigación creciente es el cribado basado en funciones de elementos potenciadores diseñados sintéticamente, lo que permite estudios de cómo la secuencia de potenciadores dirige la función39 y el diseño de potenciadores con propiedades específicas40.

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Protocol

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Este protocolo ha sido aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de UC Davis (Protocolo #22339) y el Comité Institucional de Bioseguridad de UC Davis (BUA-R1903). Este protocolo ha sido probado en ratones C57BL/6J de ambos sexos en el día postnatal 0-1.

1. Clone la secuencia candidata potenciadora en el plásmido vectorial AAV.

NOTA: Se dan los protocolos representativos, pero la estrategia de clonación tiene un alto grado de flexibilidad.

  1. Seleccione o diseñe una construcción de reportero. Aquí, el candidato potenciador se inserta en la región 3' no traducida (UTR) del gen reportero EGFP, que se expresa bajo el control del promotor mínimo Hsp68.
    NOTA: Muchas construcciones de plásmidos MPRA apropiadas para este ensayo se han depositado en Addgene41 y están disponibles para uso en investigación.
  2. Diseñe cebadores de PCR para amplificar una secuencia de interés. Agregue al extremo 5' de los cebadores el brazo de homología apropiado para la clonación de Gibson (~ 35 pb correspondiente a la secuencia 5' aguas arriba de la ubicación de inserción, la hebra superior para el cebador delantero y la hebra inferior para el cebador inverso).
    NOTA: Asegúrese de que la secuencia de cebador base tenga ~ 18-24 pb de largo y ~ 50% -60% de contenido de GC con una temperatura de fusión de aproximadamente 57-59 ° C.
  3. Realice PCR a partir de una muestra de ADN utilizando los cebadores diseñados.
    1. Ensamble la mezcla de reacción de PCR en tubos de PCR de 0,2 ml como se describe en la Tabla 1.
    2. Coloque la(s) mezcla(s) de reacción de PCR en un termociclador y realice un ciclo de acuerdo con el programa mencionado en la Tabla 1.
    3. Confirme el éxito de la PCR ejecutando 5 μL de producto de PCR en un gel de agarosa al 0,7% -1% a 100 V durante 30-60 min. Compruebe el fragmento de longitud prevista.
    4. Limpie el producto de PCR utilizando un kit comercial de columna de limpieza de reacción enzimática. El eluido final es el inserto de clonación.
  4. Realice la digestión de restricción para linealizar el vector AAV en el sitio de clonación único para insertar el potenciador en el vector.
    1. El sitio de clonación en el 3' UTR de la construcción de reportero potenciador utilizado aquí está limitado por sitios de restricción únicos de PacI y AscI. Realice un resumen para linealizar el plásmido en esta ubicación de acuerdo con los siguientes parámetros (pasos 1.4.2-1.4.4).
    2. Digiera 1-10 μg de ADN vectorial usando PacI y AscI, dependiendo de cuántas reacciones de clonación se necesitarán. Prepare las reacciones utilizando el tampón suministrado de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
    3. Incubar a 37 °C durante 1-2 h para digerir el ADN vector. (Si se digieren más de 5 μg en una reacción de 50 μL, puede ser necesaria una incubación más larga).
    4. Después de 1-2 h de incubación, inactivar la enzima incubando a 65 °C durante 20 min.
    5. Separe los fragmentos de digestión de restricción mediante electroforesis en gel utilizando un gel de agarosa al 0,7%-1%, funcione a 100 V durante 30-60 min.
    6. Extirpar la banda para el vector linealizado y purificar utilizando un kit de extracción de gel comercial.
  5. Realizar reacciones de clonación de Gibson y transformar
    1. Determine la concentración del vector purificado y el inserto de clonación utilizando un espectrofotómetro.
      NOTA: El ADN absorbe la luz a 260 nm, mientras que los contaminantes absorben la luz a 230 nm y 280 nm. Las altas proporciones (>1.8) de 260/230 y 260/280 indican ADN altamente purificado.
    2. Ensamblar reacciones de clonación de Gibson en tubos de PCR de 0.2 ml: 5 μL de 2x mezcla maestra Gibson, fragmentos de ADN de 0.02-0.5 pmol en una proporción de inserción de 3: 1 al vector (la concentración óptima de ADN para la reacción debe determinarse empíricamente) y agua libre de nucleasa (elevar el volumen a 10 μL).
    3. Incubar las reacciones de Gibson a 50 °C durante 20 min en un termociclador.
  6. Transformar la recombinación deficiente (recA-) competente en Escherichia coli (E. coli).
    1. Ponga un baño maría a 42 °C y descongele las celdas competentes disponibles comercialmente en hielo.
      NOTA: Este paso se puede realizar antes del paso 1.4, y las células pueden descongelarse mientras se prepara e incuba la reacción de Gibson.
    2. Alícuota 30-50 μL de células en tubos de microcentrífuga de 2,0 ml. Añadir 2 μL de reacción de Gibson a una alícuota y etiquetar el tubo con la identidad de la Gibson. Incubar las células en hielo durante 30 min.
      NOTA: Utilice 5-10 ng de vector vacío no digerido como control positivo y agua como control negativo.
    3. Aplique un choque térmico a las células en el baño de agua a 42 °C durante 30-45 s, devuelva inmediatamente los tubos al hielo y déjelos recuperarse durante 5 minutos.
    4. Mientras esté en hielo, agregue 400-950 μL de los medios de recuperación disponibles comercialmente.
      NOTA: El medio de recuperación utilizado en estos experimentos contiene 2% de peptona vegetal, 0,5% de extracto de levadura, 10 mM de NaCl, 2,5 mM de KCl, 10 mM de MgCl2, 10 mM deMgSO4 y 20 mM de glucosa.
    5. Después de la recuperación en hielo, recuperar completamente las células incubando a 37 °C con una agitación suave de 250 RPM durante 30-60 min.
    6. Granular las células por centrifugación a 5.000 x g durante 5 min y eliminar 400 μL del sobrenadante, dejando ~50 μL de bacterias en la placa.
    7. Planchar en medios selectivos e incubar a 37 °C durante la noche.
      NOTA: El medio selectivo utilizado en estos experimentos contiene 1.0% de triptona, 0.5% de extracto de levadura, 1.0% de cloruro de sodio, 1-2% de agar, 96-97% de agua y carbenicilina a una concentración de 100 μg / ml. Utilice siempre cepas deficientes en recombinación de bacterias para clonar plásmidos virales porque las repeticiones terminales invertidas virales (RTI) tienen secuencias coincidentes y pueden sufrir una recombinación homóloga. Sin embargo, las cepas recA- de bacterias todavía experimentan bajos niveles de recombinación. El plásmido reportero utilizado aquí es un AAV autocomplementario, donde la secuencia de uno de los RTI ha sido alterada y ya no coincide perfectamente con el otro RTI. También se recomienda cultivar las bacterias a 30 °C para disminuir aún más la tasa de recombinación homóloga.
  7. Verificar clones y recuperar plásmidos.
    1. Prepare una mezcla maestra de PCR utilizando cebadores directos e inversos (Tabla de materiales) que se inclinan hacia el vector, flanqueando la ubicación del inserto. Alícuota 10 μL de volúmenes en tubos de tira de PCR de 0,2 ml.
    2. En tubos de fondo redondo de 14 ml, preparar 5 ml de alícuotas de caldo LB selectivo antibiótico, una para cada colonia que se está probando mediante PCR y control negativo.
    3. Use un palillo de dientes estéril o una punta de pipeta para elegir una colonia individual y raspe aproximadamente la colonia en el fondo de un tubo de PCR.
    4. Cuando la colonia se haya disociado en la mezcla maestra de PCR, coloque el palillo o la punta en una de las alícuotas de LB y etiquete el tubo de 14 ml con la reacción de Gibson y el número de tubo de PCR.
    5. Coloque las reacciones de PCR de colonias en un termociclador y realice un ciclo con el programa descrito en la Tabla 2.
    6. Incubar los cultivos líquidos de 5 ml inoculados con palillos de dientes o puntas de pipeta en una incubadora agitadora a 37 °C y 180 RPM.
    7. Ejecute las reacciones de PCR de colonias en un gel de agarosa al 0,7% -1% a 100 V durante 30-60 min y visualice las bandas en un sistema de imágenes de gel doc.
    8. Deseche los cultivos de 5 ml que no muestran la banda de PCR prevista.
    9. Para cada clon integrado con éxito, permita que los cultivos de 5 ml crezcan durante la noche y luego realice una mini preparación de plásmidos de 4.5 ml usando un kit comercial. Reserve 0,5 ml del cultivo líquido y guárdelo a -80 °C como cepa de glicerol.
    10. Confirmar que los transgenes contenidos dentro de los plásmidos están libres de mutaciones indeseables utilizando la secuenciación de Sanger42.
    11. Después de que se haya confirmado que la construcción del reportero se clonó con éxito, use el stock de glicerol guardado para inocular un cultivo iniciador de 5 ml y crezca durante 8-16 h en una incubadora de agitación a 30 °C y 180 RPM.
    12. Una vez que el caldo esté turbio, diluir el cultivo iniciador 1,000x en 250-300 ml de caldo LB selectivo fresco e incubar al menos durante la noche en una incubadora agitadora a 30 ° C y 180 RPM. Luego purificar el plásmido usando un maxi kit de plásmido comercial.
      NOTA: Las bacterias crecerán más lentamente a 30 °C en comparación con 37 °C, pero esta es la mejor temperatura para disminuir la tasa de recombinación espontánea cuando se cultivan cultivos grandes.
    13. Realice un resumen de XmaI para probar la recombinación de los RTI utilizando los pasos 1.4.2-1.4.5, sustituyendo XmaI en lugar de PacI y AscI. Visualice las bandas en un sistema de imágenes de gel doc.
      NOTA: Un plásmido rAAV con ambos ITR presentes producirá dos bandas en un gel después de este compendio: una de la longitud del genoma de rAAV y la otra de la longitud del resto de la columna vertebral del plásmido. Si solo hay una banda, entonces los ITR han sufrido una recombinación homóloga y el plásmido rAAV no será capaz de empaquetar partículas virales. La columna vertebral del plásmido rAAV descrita aquí ha sido diseñada para que los sitios XmaI solo se encuentren en los RTI. Si el inserto candidato a potenciador también contiene sitios XmaI, actualice los resultados de la banda prevista y el análisis en consecuencia.

2. Obtenga rAAV empaquetado.

  1. Utilice rAAV empaquetado (profesional o interno) para los experimentos en este estudio.
    NOTA: Hay muchas opciones para empaquetar un rAAV. Un rAAV se puede empaquetar profesionalmente en una empresa o en una instalación central universitaria. El rAAV también se puede empaquetar internamente utilizando diferentes técnicas que varían en complejidad y necesidad de equipos especializados43,44. La principal preocupación es obtener un vector que sea de alta calidad y que el título infeccioso se haya determinado con un alto grado de certeza. Tanto los rAAV empaquetados profesionalmente como los empaquetados internamente se utilizaron para diferentes experimentos descritos en este estudio.

3. Inyecte intracranealmente plásmido empaquetado con rAAV en ratones neonatos.

  1. Prepare la mezcla de rAAV para la entrega.
    1. Si la intención es comparar los patrones de expresión entre diferentes virus informadores potenciadores, iguale los títulos de todos los virus que se compararán diluyendo todos para que coincidan con el virus menos concentrado.
    2. Mezcle una proporción de 2:1 o 3:1 del virus reportero potenciador y el virus reportero de control expresado constitutivamente y agregue una pequeña cantidad (0.06% de concentración final) de colorante verde rápido.
      NOTA: Fast Green es un colorante que se usa ampliamente en inyecciones de animales de experimentación, incluso con AAV, para visualizar el sitio de inyección durante e inmediatamente después del procedimiento45,46,47,48. Si bien este es un paso importante de garantía de calidad, es posible que la adición de tinte pueda interferir con la transducción. Reconsiderar el uso de tinte de inyección puede ser importante para la optimización del protocolo en ciertos casos. El virus de control impulsado constitutivamente es absolutamente crítico para comparar inyecciones independientes. Las inyecciones de virus variarán en ubicación y extensión de transducción de animal a animal. El control constitutivo permitirá excluir las inyecciones fallidas del análisis y proporcionará un estándar para la normalización de la variación en la administración del virus.
    3. Rompa la punta de una pipeta de vidrio estéril, hecha de un tubo capilar graduado con μL, perforándola suavemente a través de una delicada toallita esterilizada empapándola en etanol al 70% y dejando secar por completo. Luego inserte la pipeta de vidrio tirado en el conjunto del aspirador que consiste en un dispositivo para aplicar presión conectado a un tubo de goma de 15 pulgadas de largo que termina con una junta de goma para sostener una pipeta microcapilar.
      NOTA: El "dispositivo para aplicar presión" puede ser una jeringa o una boquilla. Si se va a utilizar una jeringa, se requerirá que una segunda persona aplique presión a través de la jeringa mientras el experimentador manipula la pipeta en una mano y el animal en la otra. Si se utiliza una boquilla, que permite al experimentador un control fino tanto de las posiciones del animal y la pipeta como de la presión aplicada a la jeringa, se requiere un cuidado especial para evitar la contaminación por virus.
    4. Aplique presión negativa a través del conjunto del aspirador para extraer un pequeño volumen (~0.2-0.5 μL) de aceite mineral en la pipeta de vidrio.
      NOTA: Este paso es muy importante para proporcionar una barrera para evitar que las partículas virales en aerosol contaminen el conjunto del aspirador.
    5. Deje a un lado el conjunto del aspirador preparado y mantenga el virus en hielo hasta que esté listo para inyectarse.
  2. Crioanestesiar a los ratones neonatos en un plato de plástico seco parcialmente sumergido en hielo hasta el cese del reflejo de retirada del pedal (~ 5 min). Asegúrese de que los ratones no estén en contacto directo con el hielo.
  3. Use presión negativa a través del conjunto del aspirador para extraer la mezcla de virus en la pipeta de vidrio tirado hasta que el menisco pase la marca de marca de 2 μL.
  4. Retire el ratón de la cámara fría y colóquelo en la mesa de trabajo. Localice los sitios de inyección bilateral a medio camino entre lambda y bregma y a medio camino entre la sutura sagital y cada ojo. Desinfecte ambas áreas con una toallita con alcohol.
  5. Use la pipeta de vidrio tirado para perforar el cráneo de los ratones neonatos y aplique suavemente presión positiva a través del conjunto del aspirador a medida que la aguja ingresa al cerebro. Observe el menisco de la mezcla de virus. La resistencia a la presión aplicada disminuirá cuando la punta de la pipeta llegue al ventrículo lateral. Dispensar 1 μL del virus, retirar la pipeta y repetir para el otro ventrículo lateral.
  6. Coloque el ratón sobre una almohadilla térmica o una cámara de calentamiento para recuperarse. Una vez despierto y activo, devuelva al animal a su jaula de origen.

4. Recolectar tejido y realizar inmunohistoquímica.

  1. Después de suficiente tiempo después de la transducción del virus, anestesiar a los ratones y sacrificar por perfusión transcárdica.
    NOTA: Muchos experimentos, incluidos los resultados representativos que se muestran aquí, permiten un período de 4 semanas o más para que el virus transduzca. Sin embargo, los AAV autocomplementarios pueden mostrar una fuerte expresión tan pronto como a los 7 días12. El período de incubación deseado puede necesitar ser optimizado dependiendo de técnicas experimentales específicas y objetivos.
    1. Prepare una bomba peristáltica con tubo de infusión intravenosa y una aguja de 25 G.
    2. Prepare 1x PBS y paraformaldehído al 4% (PFA) y colóquelos en hielo.
    3. Coloque el extremo de admisión del tubo en el PBS 1x helado. Ajuste el caudal (2,5 ml/min para ratones P7, 3,5 ml/min para ratones P28) y haga funcionar la bomba hasta que el tampón se extraiga completamente a través del tubo y se limpie de burbujas. Deje la aguja a un lado hasta que esté lista para la perfusión.
    4. Dentro de una campana extractora, pipetea un pequeño volumen de isoflurano sobre una toalla de papel en el fondo de una cámara de frasco. Coloque el ratón previamente inyectado en una rejilla sobre la toalla de papel, asegurándose de que no entre en contacto directo con el isoflurano. Selle la cámara para anestesiar al ratón. Espere ~ 5 minutos y luego abra la cámara y verifique si hay un reflejo de extracción del pedal. Proceda una vez que el animal esté inconsciente.
      NOTA: Durante toda la perfusión, el ratón debe mantenerse en isoflurano con un cono nasal para evitar recuperar la conciencia.
    5. Use tijeras quirúrgicas para abrir el abdomen y el pecho del ratón, retire la caja torácica y exponga el corazón.
    6. Use un par de microtijeras de iris para hacer una pequeña incisión en la aurícula derecha del ratón, inserte la aguja intravenosa en el ventrículo izquierdo y active la bomba peristáltica.
    7. Perfundir al animal con 1x PBS helado hasta que la sangre que sale de la incisión en la aurícula derecha se aclare. Limpiar el tejido de sangre es muy importante porque los glóbulos rojos tienen autofluorescencia y los vasos sanguíneos pueden afectar la capacidad de obtener imágenes de las células que expresan el reportero.
    8. Pause la bomba peristáltica y mueva el tubo de admisión del PBS al PFA al 4%. Reactive la bomba y perfunda 1 ml / g de peso corporal, ~ 25 ml para un ratón adulto.
      NOTA: Los temblores de fijación deben ser observables, y el cuerpo del ratón debe ponerse rígido.
  2. Diseccionar y post-arreglar el cerebro.
    1. Retire la cabeza del ratón con tijeras quirúrgicas.
    2. Usando tijeras quirúrgicas pequeñas, comience en la base del cráneo y haga una incisión a lo largo de la línea media de la cabeza y retire la piel y el tejido subyacente para exponer el cráneo.
    3. Usando tijeras de iris, corte cuidadosamente la parte posterior del cráneo, comenzando en el foramen magnum y continuando hacia y a lo largo de la sutura sagital hasta que se pasen los bulbos olfativos.
    4. Inserte las tijeras en el cráneo sobre los bulbos olfatorios y haga dos cortes horizontales en el cráneo. Haga un par similar de cortes horizontales en el hueso occipital. Los cortes horizontales y de la línea media crean un par de solapas en forma de puerta en la parte superior del cráneo.
    5. Despegue las aletas del cráneo para exponer completamente el cerebro. Use un par de pinzas para cortar los bulbos olfativos del cráneo y cortar los nervios craneales, liberando el cerebro del cráneo.
    6. Deje caer el cerebro en un tubo cónico de 15 ml con 3-5 ml de PFA al 4% en PBS. Post-fix 6 h a toda la noche. No fije demasiado el tejido.
  3. Preparar los cerebros para la criosección.
    1. Transfiera el cerebro fijo a un nuevo tubo cónico de 15 ml con 12-14 ml de sacarosa al 30% en PBS para la deshidratación. Incubar a 4 °C hasta que el cerebro se hunda hasta el fondo del tubo (2-3 días).
    2. Sumergir el cerebro fijo y deshidratado en un compuesto de temperatura de corte óptima (OCT) en un criomolde de 15 mm x 15 mm x 5 mm. Agregue OCT hasta que el cerebro esté completamente cubierto.
    3. Coloque criomold en un bloque de hielo seco y congele la muestra en un bloque sólido de OCT (~ 5 min).
      NOTA: Los bloques OCT se pueden almacenar a -80 °C durante meses o años.
    4. Etiquete el criomold con el nombre de la muestra y la orientación del cerebro.
  4. Obtener secciones coronales utilizando un micrótomo criostato.
    1. Marque la orientación del cerebro en el bloque OCT con lápiz y retire el bloque del criomold dentro del criostato.
    2. Coloque el bloque OCT de modo que el cerebro esté orientado con los bulbos olfativos orientados hacia la hoja del criostato y adhiera el bloque al soporte del objeto del criostato con un poco de OCT fresco.
    3. Una vez congelado en su lugar, comience a cortar secciones de 50 μm a través del bloque siguiendo los pasos 4.4.4-4.4.6.
    4. No utilice la placa estabilizadora. Las secciones se curvarán en rollos apretados a medida que se cortan y se recogerán en la parte superior del bloque o caerán debajo en una bandeja de recolección.
    5. Observe la forma del bloque en los primeros cortes que se hacen. Realiza cortes verticales a través del bloque, produciendo una cara uniforme al comenzar a cortar. Ajuste el ángulo con los brazos de ajuste de la muestra si es necesario.
    6. Cuando los bulbos olfativos sean visibles, preste mucha atención a la forma de las secciones. Si uno parece más grande que el otro, los cortes están en un ángulo relativo al cerebro, y es necesario enderezar la orientación del cerebro contra la cuchilla utilizando los brazos de ajuste de la muestra.
      NOTA: Si se corta en línea recta, la corteza debe comenzar a aparecer sobre cada bulbo olfativo al mismo tiempo.
    7. Una vez que el bulbo olfatorio haya sido seccionado y el tejido cerebral rostral sea visible, reduzca el grosor del corte a 30-35 μm y comience a recolectar las secciones flotantes. Siga los pasos 4.4.8-4.4.13 para seccionar el cerebro.
    8. Cepille todas las secciones anteriores del bloque y del soporte del objeto para que caigan en la bandeja colectora. Cepíllelos a un lado de la bandeja y manténgalos separados. Si la pila es demasiado grande, vacíe la bandeja.
    9. Dispense 1 ml de PBS en cada pocillo de una placa de 24 pocillos. Etiqueta 1 fila para cada cerebro.
    10. Corte 6 secciones coronales. Recupere las secciones con pinzas frías y colóquelas en la etapa de criostato. Repita este paso 2 o 3 veces, manteniendo los grupos de 6 secciones separados.
    11. Moje un pincel de tamaño 000 con PBS y elimine el exceso de líquido en un pañuelo de papel sin pelusa o una toalla de papel. Use el pincel para recoger suavemente cada sección, una a la vez, y colóquela en los pocillos apropiados de la placa de 24 pocillos.
    12. Coloque una de las 6 secciones del grupo de rodajas en cada uno de los 6 pocillos en una fila de la placa de 24 pocillos. Esto asegura que cada pocillo contenga secciones representativas que abarcan el área seccionada del cerebro.
    13. Continuar seccionando en grupos de 6 hasta que se haya seccionado el extremo caudal de la corteza cerebral.
    14. Para el almacenamiento, sellar la placa de 24 pocillos con parafilm y almacenar a 4 °C.
      NOTA: Las secciones son estables durante 1-2 meses a 4 °C. Se puede usar una solución de PBS con azida de sodio al 0,1% para inhibir el crecimiento bacteriano y prolongar la vida útil de las secciones. Sin embargo, si las secciones se van a almacenar durante más de 2 meses, deben colocarse en una solución crioprotectora y congelarse a -20 °C para obtener mejores resultados.
  5. Realizar inmunohistoquímica para la amplificación de la señal del gen reportero.
    NOTA: Todos los pasos, excepto la recuperación de antígenos, deben realizarse utilizando agitación suave a moderada (~ 100 RPM) en un agitador orbital. Para preservar la fluorescencia nativa del reportero de control (mRuby3), todos los pasos deben protegerse de la luz tanto como sea posible.
    1. Prepare los amortiguadores necesarios como se describe en la Tabla 3.
    2. Prepare una nueva placa de 24 pocillos con una fila para cada cerebro que se tiñe. En la primera columna de pozos, agregue 1 ml de PBS a cada pozo.
    3. Con un pincel de tamaño 000, transfiera suavemente 1 pocillo de secciones del pocillo de recolección original al PBS fresco en la nueva placa de 24 pocillos para un enjuague rápido y eliminar el compuesto OCT residual.
    4. Agregue 1 ml de ARB al siguiente pozo en la placa de 24 pozos y transfiera las secciones a este pozo. Incubar en un horno a 60 °C durante 1 h.
    5. Deje que la placa se enfríe a temperatura ambiente (RT) durante 20 minutos.
    6. Agregue 1 ml de PB al siguiente pocillo y transfiera las secciones a este pozo. Incubar a RT durante 20 min.
    7. Agregue 500 μL de BB al siguiente pocillo y transfiera las secciones a este pozo. Incubar en RT durante 1 h.
    8. Agregue 2 ml de WB al BB y luego pipetear ~ 2 ml de solución y desechar, dejando una solución de BB diluida en el pozo. Repita hasta que las secciones sean claramente visibles.
    9. Diluir el anticuerpo primario (Chicken IgY anti-GFP, 1:1000) en BB. Agregue 350-500 μL de solución de anticuerpos primarios al siguiente pocillo y transfiera las secciones a este pocillo. Sellar la placa con parafilm e incubar a 4 °C durante la noche.
    10. Diluir BB con WB como se hizo anteriormente hasta que las secciones sean claramente visibles.
    11. Agregue 1 ml de WB al siguiente pozo y transfiera las secciones a este pozo. Incubar a RT durante 20 min.
    12. Retire ~800-900 μL de tampón y deséchelo. Añadir 1 ml de WB fresco e incubar 20 min. Reemplace 1 ml de WB 4 veces más para un total de 5 lavados, 20 min cada uno.
    13. Diluir el anticuerpo secundario (Burro anti-pollo Alexa Fluor 488 conjugado, 1:500) en BB. Agregue 350-500 μL de la solución de anticuerpos secundarios a un nuevo pocillo. Incubar a RT durante 45 min a 1 h.
      NOTA: Este es el séptimo pozo, por lo que si se manchan secciones de más de 2 cerebros, se necesitará una nueva placa en este punto.
    14. Diluir BB con WB como anteriormente y transferir las secciones a un nuevo pozo lleno con 1 ml de WB. Lave las secciones como se hizo anteriormente durante 20 minutos 3 veces.
    15. Preparar una solución de trabajo de DAPI en PBS (concentración final 0.04-0.8 μg/mL). Proteja la solución de la luz.
    16. Agregue 1 ml de solución DAPI al siguiente pozo y transfiera las secciones a este pozo. Incubar a RT durante ~5 min.
    17. Transfiera las secciones de nuevo a WB y móntelas suavemente en portaobjetos de microscopio con un pincel de tamaño 000. Deje que los portaobjetos se sequen al aire.
    18. Aplique cubreobjetos con un medio de montaje adecuado. Permita que las diapositivas se curen en RT en la oscuridad durante la noche.

5. Imagen y análisis de secciones de tejido cerebral para mejorar la actividad.

  1. Utilice una lente de objetivo de bajo aumento (5x) para grabar imágenes de fluorescencia que abarcan la sección del cerebro.
  2. Localice el lugar de inyección y evalúe la extensión de la transducción del virus en función de la densidad e intensidad de las células fluorescentes rojas. Tenga cuidado de comparar animales que fueron transducidos de manera similar.
  3. Grabe imágenes fluorescentes detalladas con una lente de objetivo de mayor aumento (≥25x) si lo desea.
    NOTA: Asegúrese siempre de utilizar los mismos ajustes para los parámetros de adquisición, como la intensidad de la luz de excitación, los filtros y el tiempo de exposición entre las muestras que se van a comparar.
  4. Procese las imágenes utilizando un software de análisis de imágenes.
    NOTA: El procesamiento se puede realizar en cualquier paquete de software de análisis de imágenes. Los siguientes pasos son sugerencias para determinar si una secuencia actúa como un potenciador en el contexto de construcción del reportero (una pregunta de sí o no) utilizando la distribución FIJI de código abierto de ImageJ. Una fotometría más profunda puede ser apropiada cuando se comparan grados de actividad entre variantes de potenciadores. Las imágenes de diferentes muestras siempre deben procesarse de manera consistente para ser comparadas.
    1. Aplique filtros para reducir el ruido. En Fiyi, seleccione la opción Desmotear en el menú Procesar > ruido .
      NOTA: Este es un filtro mediano de 3 x 3.
    2. Restar la fluorescencia de fondo siguiendo los pasos 5.4.3-5.4.6.
    3. Separe los canales de una imagen multicanal. En Fiyi, seleccione la opción Dividir canales en el menú Imagen > color .
    4. Utilice la herramienta de selección de rectángulos o círculos para dibujar una forma pequeña en un área de la imagen que no tenga celdas fluorescentes y medir la intensidad media de píxeles del fondo mediante Analizar > medir. Repita para muestrear varias áreas.
      NOTA: Asegúrese de que el valor gris medio está seleccionado en el menú Analizar > establecer medidas .
    5. Promedia el valor gris medio de 5-8 áreas de fondo y elimina el punto decimal. Resta este valor de cada píxel de la imagen usando Process > Math > Restar.
      NOTA: El redondeo al número entero más cercano podría sobrestimar el fondo a restar. Es más conservador simplemente eliminar el punto decimal. Por ejemplo, 6.4 se redondearía a 6, pero 6.5 también debería redondearse a 6 para evitar el riesgo de restar 0.5 unidades de señal real de cada píxel.
    6. Si lo desea, vuelva a combinar los canales en una imagen multicanal. En Fiyi, utilice Imagen > Color > Combinar canales.
    7. Cose las imágenes superpuestas. En Fiyi, use Plugins > Costura > Costura de cuadrícula/colección.
    8. Ajuste el brillo y el contraste. En Fiyi, utilice Imagen > Ajustar > brillo/contraste.
      NOTA: Utilice siempre los mismos valores mínimos y máximos para cada imagen a comparar.
    9. Contar el número de células fluorescentes verdes siguiendo los pasos 5.4.10-5.4.12. Estas son las celdas en las que la secuencia del potenciador candidato fue capaz de impulsar la expresión del reportero.
    10. Comience ocultando el canal verde y use la herramienta de selección de forma libre para dibujar una forma alrededor de la región del cerebro que expresa fluorescencia roja. Usando la función Medir en Fiji, mida el área, la densidad integrada y el valor gris medio del canal rojo en esta zona.
    11. Con la herramienta de selección multipunto, cuente el número de celdas verdes en esta zona.
    12. Normalizar el número de celdas verdes por la densidad integrada del canal rojo. El brillo local del canal rojo es una medida indirecta de la magnitud de la exposición al virus, lo que permite la comparación de la actividad potenciadora entre diferentes animales transducidos.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Usando estos métodos, se probó una secuencia de 915 pb en el tercer intrón asociado al riesgo psiquiátrico del gen CACNA1C19,49,50 para determinar la actividad potenciadora en el cerebro postnatal del ratón. Esta secuencia fue descubierta en un MPRA de 345 secuencias candidatas potenciadoras centradas en SNPs de riesgo psiquiátrico y neurológico12 y los experimentos de caracterización se describe...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo describe un método basado en rAAV para el despliegue de transgenes impulsados por potenciadores en el cerebro postnatal del ratón. En este protocolo generalizado, un potenciador candidato, un promotor mínimo, un gen reportero y una secuencia de código de barras opcional se clonan en una columna vertebral de plásmidos AAV. Estos experimentos se pueden hacer con una sola secuencia potenciadora candidata o con muchas secuencias en paralelo. El plásmido se empaqueta en un rAAV y se administra al cerebro postna...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores declaran que no hay intereses financieros contrapuestos.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La secuenciación se realizó en el UC Davis DNA Technologies Core. Agradecemos al laboratorio de Lin Tian en UC Davis por la capacitación en el empaque de rAAV y por regalarnos generosamente plásmidos de AAV helper y rep / cap. Este trabajo fue apoyado por NIH/NIGMS R35GM119831.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10x Tampón de citratoSigma-AldrichC9999-1000ML
5'-gatcactctcggcatggac-3'IntegratedDNA TechnologiesN/A: Imprimación Forward diseñada a medidapara verificar clones después de la transformación. Estos cebadores son específicos para el vector utilizado y fueron diseñados para el vector específico utilizado en nuestros experimentos.
5'-gatggctggcaactagaagg-3'IntegratedDNA TechnologiesN/A: Imprimación inversa diseñada a medidapara verificar clones después de la transformación. Estos cebadores son específicos para el vector utilizado y fueron diseñados para el vector específico utilizado en nuestros experimentos.
AgarosaVWRVWRVN605-500G
Conjuntos de tubos de aspiraciónSigma-AldrichA5177-5EApara la administración manual de rAAV
Placas bacteriológicas de PetriThermo Fisher Scientific08-757-100D
CarbenicillinaSigma-AldrichC1389-5G
Pollo IgY anti-GFPThermo Fisher ScientificA10262
Microscopio confocalZeissLSM900Las imágenes se tomaron en el modelo LSM800, pero Zeiss lanzó el modelo LSM900 en los últimos años para reemplazar al LSM800.
Tubos de centrífuga cónicos 15 mLThermo Fisher Scientific12-565-269
CryomoldsThermo Fisher ScientificNC9806558Estos moldes son adecuados para el cerebro del ratón P28. Otros tamaños pueden ser más adecuados para tejidos más grandes o más pequeños.
DAPISigma-AldrichD9542-10MG
Tijeras de disección, 4.5"VWR82027-578
Burro anti-pollo AlexaFlour-488Jackson ImmunoResearch703-545-155
PBS de Dulbecco 1xThermo Fisher ScientificMT21031CV
Eppendorf Tubos de microcentrífuga 2.0 mLThermo Fisher Scientific
Tubos de fondo redondo Falcon 14 mLThermo Fisher Scientific352059
Fast Green dyeGraingerF0099-1G
Juego de pinceles para detalles finosArtbrush TowerB014GWCLFO
Gibson Assembly Master Mix NEBE2611S
vidrioDrummond Scientific Company5-000-2005
Kit Maxi de plásmido HiSpeedQIAGEN12663Kit de preparación para maxi plásmido comercial
HyClone HyPure Agua de grado de biología molecularVWRSH30538.03
IV de infusión de mariposa con tubo de 12" y aguja de 25GThermo Fisher Scientific26708
KimwipesKimberly Clark34155Toallita sin pelusa
LB AgarPremezcla de agar Thermo Fisher ScientificBP1425-500LB para medios selectivos
Tijera de iris McPherson VannasIntegra LifeSciences360-215
Aceite mineralSigma Life Science69794-500ML
NEB Estable E. coli competenteNEBC3040I
NucleoSpin Gel y PCR Clean-upTakara740609.5Kit para reacción enzimática limpieza y extracción de gel
OCT medio VWR25608-930
Agitador orbitalCole Parmer60-100
ParaformaldehídoSigma-Aldrich158127-500G
Tubos de tiras de PCR 0,2 mLVWR490003-692
Bomba peristálticaGilsonF155005
Solución salina tamponada con fosfato (PBS) 10xThermo Fisher Scientific70011044
Phusion Hot Start II ADN polimerasa de alta fidelidadThermo Fisher ScientificF549L
Leche en polvoSunny Select
ProLong Gold Mountant AntidecoloraciónThermo Fisher ScientificP36934
QIAquick PCR Kit de purificaciónQIAGEN28106
rCutSmart TampónNEBB6004STampón para la digestión de restricción con PacI, AscI y XmaI
Enzima de restricción: AscINEBR0558L
Enzima de restricción: PacINEBR0547L
Enzima de restricción: XmaINEBR0180L
Medio de excrecencia SOCNEBB0920S Medio derecuperación después de la transformación
Sacarosa ( Libre de RNasa/DNasa)Millipore Sigma033522.5KG
Tampón TAEApex20-194
Tubo de transferenciaGilsonF1179941para bomba peristáltica
Triton X100Sigma-AldrichX100-100ML
Wizard Plus SV Minipreps Sistema de purificación de ADNThermo Fisher ScientificA1460Mini kit de preparación de plásmido
22431048 Tubos capilares de

References

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