Los macrófagos asociados a tumores (TAM) similares a M2 se asocian con progresión tumoral y mal pronóstico en el cáncer. Este protocolo sirve como una guía detallada para diferenciar y polarizar de manera reproducible las células similares a los monocitos THP-1 en macrófagos similares a M2 en un plazo de 14 días. Este modelo es la base para investigar los efectos antiinflamatorios de la TAM dentro del microambiente tumoral.
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Diferenciación y polarización de macrófagos en un fenotipo similar a M2 utilizando una línea celular de leucemia THP-1 similar a monocitos humanos
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Resumen
Resumen
Los macrófagos asociados a tumores (TAM) pueden cambiar su expresión y perfil de citoquinas de acuerdo con los estímulos externos. Esta notable plasticidad permite a TAM adaptarse a los cambios en curso dentro del microambiente tumoral. Los macrófagos pueden tener principalmente atributos proinflamatorios (similares a M1) o antiinflamatorios (similares a M2) y pueden cambiar continuamente entre estos dos estados principales. Los macrófagos similares a M2 dentro del entorno tumoral se asocian con la progresión del cáncer y el mal pronóstico en varios tipos de cáncer. Se utilizan muchos métodos diferentes para inducir la diferenciación y polarización de las células THP-1 para investigar los mecanismos celulares e intercelulares y los efectos de TAM dentro del microambiente de los tumores. Actualmente, no existe un modelo establecido para la polarización de macrófagos similares a M2 utilizando la línea celular THP-1, y los resultados de la expresión y los perfiles de citoquinas de los macrófagos debido a ciertos estímulos in vitro varían entre los estudios. Este protocolo sirve como guía detallada para diferenciar las células similares a los monocitos THP-1 en macrófagos M0 y para polarizar aún más las células en un fenotipo similar a M2 dentro de los 14 días. Demostramos los cambios morfológicos de células similares a monocitos THP-1, macrófagos diferenciados y macrófagos polarizados similares a M2 utilizando microscopía de luz. Este modelo es la base para los modelos de línea celular que investigan los efectos antiinflamatorios de TAM y sus interacciones con otras poblaciones celulares del microambiente tumoral.
Introducción
Los macrófagos asociados a tumores (TAM) y su papel en la inflamación crónica, la aparición del cáncer y el desarrollo de tumores son objetivos importantes en investigaciones recientes1,2. Los monocitos de sangre periférica que se reclutan en el microambiente tisular del tumor en desarrollo se diferencian en macrófagos y pueden polarizarse en dos subtipos principales de macrófagos3. El macrófago activado clásicamente representa el fenotipo M1 principalmente proinflamatorio y el subtipo similar a M2 activado alternativamente muestra características predominantemente antiinflamatorias4. Los macrófagos pueden cambiar dinámicamente entre estos dos fenotipos principales dependiendo de su metabolismo celular, con subtipos intermedios que tienen atributos inflamatorios y antiinflamatorios5. TAM representa una población heterogénea de ambos fenotipos. Sin embargo, una función promotora de tumores y un mal pronóstico en diferentes tipos de cáncer se asocian particularmente con macrófagos similares a M26,7,8.
Los perfiles funcionales de los macrófagos y su interacción con otras células dentro del microambiente tumoral son complejos y difíciles de capturar en un entorno en constante cambio durante el desarrollo continuo del tumor. Las líneas celulares pueden proporcionar una población celular homogénea con viabilidad estable en cultivo, lo que puede facilitar el proceso de demostración de mecanismos celulares e intercelulares definidos. La línea celular THP-1 similar a un monocitos es un sistema modelo legítimo para monocitos humanos primarios9. Esta línea celular inmortalizada espontáneamente se ha obtenido de la sangre periférica de un lactante de un año con leucemia monocítica aguda9,10. La diferenciación y polarización de las células THP-1 han sido reportadas por varios estudios y se han realizado de múltiples maneras diferentes11,12,13,14. La activación y, por tanto, la polarización de los macrófagos en un fenotipo tipo M1 es seguida por un mecanismo de rebote antiinflamatorio compensatorio, promoviendo un fenotipo tipo M2 a través de citoquinas producidas por macrófagos inflamatorios, como la interleucina 6 (IL-6) o el itaconato15,16. Esto podría servir como un mecanismo de ruptura para atenuar una respuesta inflamatoria excesiva después de la activación celular17. El proceso de diferenciar y polarizar monocitos y células similares a monocitos THP-1 en un fenotipo antiinflamatorio similar a M2 también se acompaña de estímulos proinflamatorios que deben superarse. Una respuesta inflamatoria de citoquinas puede ser causada por estrés mecánico18,como cambiar los medios para realimentar las células, o agregar compuestos químicos para diferenciar las células THP-1, como forbol 12-miristato 13-acetato (PMA), e inducir la producción de factor de necrosis tumoral α (TNFα), interleucina 1β (IL-1β) o IL-619. Este perfil alterado de expresión de citoquinas como respuesta a la PMA puede afectar y prevenir la polarización posterior de los macrófagos20. Los períodos de descanso adecuados, como se informó antes después del tratamiento con PMA, permiten que estas respuestas inflamatorias disminuyan y faciliten la polarización celular en un fenotipo 21 distinto similar aM2.
Este protocolo demuestra un método para diferenciar y polarizar las células similares a los monocitos THP-1 en un fenotipo de macrófagos similar a M2 en un plazo de 14 días.
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Protocolo
Nota : una descripción general de los pasos descritos en este protocolo se muestra en la figura 1. Se compró la línea celular de leucemia similar a monocitos humanos THP-1. Se realizó un breve análisis de repetición en tándem para autenticar la línea celular THP-1. Realice todos los pasos en condiciones estériles. La línea celular monocítica THP-1 crece en suspensión y no se adhiere a las superficies de cultivo celular. La adherencia se puede inducir diferenciando los monocitos en células similares a los macrófagos a través de, por ejemplo, estrés mecánico o tratamiento específico conPMA.
1. Cultivo y mantenimiento de células similares a monocitos THP-1
- Establezca un temporizador para 150 s. Retire el vial congelado que contiene la línea celular THP-1(Tabla de materiales)del nitrógeno líquido y descongele inmediatamente en un baño de agua limpia (37 °C). Inicie el temporizador tan pronto como el vial se coloque en el baño de agua. Afloje la tapa para liberar la presión que se está acumulando debido al proceso de descongelación, pero asegúrese de que la abertura del tubo no entre en contacto con el agua, para evitar la contaminación. El período de tiempo óptimo para descongelar las células se encuentra entre 120-150 s. Continúe descongelando la suspensión celular hasta que quede una viruta de hielo del tamaño de aproximadamente 4 mm dentro del vial; luego, continúe con el siguiente paso inmediatamente.
- Transfiera la fase líquida de la suspensión celular a un tubo de 15 ml que contenga 9 ml de medios de crecimiento calientes (37 °C) (Tabla de materiales). Luego, transfiera 1 ml de la suspensión de células medias calientes al vial de THP-1 y vuelva al tubo de 15 ml para derretir la viruta de hielo restante y enjuague el vial para asegurarse de que no queden células.
- Mezcle la suspensión suavemente mediante el pipeteo hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de 1000 μL. Retire una muestra pequeña (aproximadamente 10 μL) para contar la viabilidad de las células (usando azul tripano para la exclusión) mientras se hilan. Gire hacia abajo la suspensión de celda caliente a 200 x g durante 7 min a 37 °C.
- Retire el sobrenadante por completo y vuelva a sususpend con un cierto volumen de medio de crecimiento caliente para lograr una densidad celular de 5 x 105/ ml. Mezclar la suspensión suavemente y transferir 22 ml de volumen a matraces de cultivo celular T-75 (Tabla de materiales). Guarde los matraces en posición vertical en una incubadora a 37 °C con una concentración de dióxido de carbono (CO2) del 5%. Intercambie los medios de crecimiento cada 3-4 días.
2. Siembra de células THP-1 y diferenciación en macrófagos M0
- Preparar la célula que contiene el medio de crecimiento con la densidad celular respectiva para sembrar células a una densidad de 3 x 105/mL/pozo en placas de cultivo celular de 24 pozos (Tabla de Materiales). Mezclar el medio suavemente y preparar alícuotas de 26 mL, cada una puesta en un tubo de 50 mL. Use cada alícuota de 26 ml para sembrar las células en una placa respectiva.
- Transfiera 1 ml del medio que contiene la célula a cada pozo de una placa de 24 pozos. Mezcle los medios suavemente canalizando hacia arriba y hacia abajo entre transferencias.
- Preparar una solución madre de PMA (disolver 1 mg de PMA en 100 μL de dimetilsulfóxido (DMSO) = ~ 16 mM de solución de PMA en DMSO) y diluirla con solución salina tamponada con fosfato frío (PBS) a una concentración final de trabajo de 10 ng / μL justo antes del tratamiento celular (Tabla de materiales). Mantenga la solución en hielo y úselo inmediatamente. No vuelva a congelar. Agregue 100 ng de PMA por pozo. Deje que cada placa celular se asiente en la incubadora sin ningún tratamiento adicional durante 72 h.
- Después de 72 h, retire el medio de crecimiento y reemplácelo con 1 ml de medio de crecimiento fresco. No toque el fondo de los pozos con puntas de pipeta. Deje reposar las células durante otras 96 h en la incubadora.
- Después de 96 h, repita el paso 2.4 (cambio de medios) y deje que las células descansen durante otras 24 h.
NOTA: Los macrófagos M0 ya están listos para ser utilizados en experimentos (Figura 2). Inmediatamente antes de tratar las células como parte de experimentos adicionales, considere un cambio de medios solo con RPMI(Tabla de materiales)ya que los suplementos de medios de crecimiento pueden causar interferencia con los reactivos que se agregan para el tratamiento celular. En caso de que se necesiten macrófagos similares a M2, continúe con la sección 3.
3. Polarización de macrófagos M0 en macrófagos similares a M2
- Preparar una solución madre de IL-4 e IL-13 (disolver 20 μg de IL-4 o IL-13 en 200 μL de agua libre de nucleasa) y diluirla a una concentración final de trabajo de 2 ng/μL con PBS inmediatamente antes del tratamiento celular. Mantenga la solución en hielo y úselo inmediatamente. No vuelva a congelar.
- Retire el medio de crecimiento y reemplácelo con 1 ml de medio de crecimiento fresco. Añadir 20 ng de interleucina 4 (IL-4) y 20 ng de interleucina 13 (IL-13) por pozo. Deje reposar las células durante 48 h en la incubadora.
- Después de 48 h, repita el paso 3.2. Deje reposar las células durante otras 48 h en la incubadora.
- Retire el medio de crecimiento y reemplácelo con 1 ml de medio de crecimiento fresco. Deje reposar las células durante 48 h en la incubadora.
NOTA: Los macrófagos similares a M2 ahora están listos para ser utilizados en experimentos (Figura 2). Inmediatamente antes de tratar las células como parte de experimentos adicionales, considere un cambio de medios solo con RPMI(Tabla de materiales)ya que los suplementos de medios de crecimiento pueden causar interferencias.
4. Desprendimiento y recolección de macrófagos para citometría de flujo
NOTA: Utilice un método mecánico que combine el choque en frío y el raspado celular para separar y cosechar los macrófagos polarizados de las placas para la citometría de flujo.
- Retire el medio de células calientes y reemplácelo con una mezcla de PBS helado (sin calcio y magnesio) y suero bovino fetal (FBS) al 5%, 1 ml por pozo. Inmediatamente después de esto, coloque la placa celular sobre hielo durante 45 minutos. No coloque la placa celular sobre hielo antes de que se retire el medio celular caliente, ya que esto disminuirá significativamente la viabilidad celular. Mantenga las células en hielo solo después de inducir el choque frío con la mezcla de PBS / FBS al 5% helada.
- Después de 45 minutos en hielo, raspe las celdas usando mini raspadores de celdas(Tabla de Materiales). Transfiera suavemente los macrófagos desprendidos en PBS frío / 5% FBS en un tubo de 15 ml. Mantenga el tubo en hielo en todo momento hasta que las células se tiñen.
NOTA: Auna ocho pozos de células para alcanzar recuentos celulares adecuados para la tinción.
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Resultados
Se caracterizaron macrófagos similares a M2 y se validó la polarización M2 mediante citometría de flujo para marcadores de grupo de diferenciación (CD) CD14, CD11b, CD80 (marcador similar a M1) y CD206 (marcador similar a M2). La tinción por citometría de flujo se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los macrófagos se lavaron con PBS/5% FBS y se incubaron con el bloqueo del receptor Fcγ para evitar la unión inespecífica. Las células se tiñeron con anticuerpos CD14 y CD80 antihumanos conjugados con FIT...
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Discusión
Este protocolo sobre la diferenciación y polarización de células similares a monocitos THP-1 en 14 días proporciona un método para obtener macrófagos con un fenotipo distinto similar a M2 debido a la incubación de células de tratamiento prolongado con períodos de descanso adecuados entre pasos.
Ciertos pasos son críticos para este protocolo. El tiempo de duplicación de los monocitos THP-1 es de aproximadamente 26 h. Las células se pueden dividir a una densidad celular de 9 x10 5/ mL...
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Divulgaciones
Los autores declaran que no hay posibles conflictos de intereses.
Agradecimientos
El Instituto Price de Investigación Quirúrgica de la Universidad de Louisville, cuenta con el apoyo financiero de John W. Price y Barbara Thruston Atwood Price Trust. Las fuentes de financiación no tuvieron ningún papel en el diseño y la realización del estudio, así como en la recopilación, gestión, análisis e interpretación de los datos.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0,4% azul de tripán | VWR, Radnor, EE. UU | 152-5061 | |
| Tubo de microcentrífuga de 1,5 mL | EE. UU. Scientific, Ocala, EE. UU | 1615-5510 | |
| Pipeta serológica de 10 mL | VWR, Radnor, EE. UU. | 89130-898 | |
| 1000 y mu; L TipOne puntas de pipeta | USA Scientific, Ocala, USA | 1111-2821 | |
| 15 mL Tubo de centrífuga | VWR, Radnor, EE. UU. | 89039-664 | |
| 20 μ L TipOne puntas de pipeta | USA Scientific, Ocala, USA | 1120-1810 | |
| 200 μ L TipOne pipetas | USA Scientific, Ocala, USA | 1120-8810 | |
| 25 mL pipeta serológica | VWR, Radnor, USA | 89130-900 | |
| pipeta serológica de 5 mL | VWR, Radnor, EE. UU.& | nbsp; 89130-896 | |
| Tubo de centrífuga de 50 ml | VWR, Radnor, EE. UU. | 89039-662 | |
| Solución Accutase 500 mL | Sigma, St. Louis, EE. UU. | A6964 | |
| Solución antibiótica antimicótica (100x), Sigma estabilizada | , St. Louis, EE. UU. | A5955-100 mL | con 10.000 unidades de penicilina, 10 mg de estreptomicina y 25 μ g de anfotericina B por mL, filtrada estérilmente, Biorreactivo, apto para cultivos celulares |
| Incubadora de CO2 aglutinante | VWR, Radnor, EE. UU. | C170-ULE3 | |
| Matraz CytoOne T-75cm con tapón de filtro | USA Scientific, Ocala, EE. UU | . CC7682-4875 | |
| Dulbecco' s Solución salina tamponada con fosfato (PBS) | Sigma, St. Louis, EE. UU. | D8537-500 mL | PBS sin cloruro de calcio y cloruro de magnesio, ya que ambos pueden alterar la polarización de los macrófagos |
| Centrífuga Eppendorf 5804 R (refrigerada) | Eppendorf, Enfield, EE. UU. | - | |
| Alcohol etílico (70%) | - | - | |
| FACSCitómetro de flujo Alibur | BD Biosciences, San Diego, EE. UU. | - | El citómetro de flujo funciona con el software CellQuest (BD Biosciences) |
| Placa de 24 pocillos Falcon | VWR, Radnor, EE. UU. | 353504 | |
| Suero fetal bovino (FBS) | ATCC, Manassas, EE. UU. | 30-2020 | |
| FITC Ratón Anti-Humano CD14 | BD Biosciences, San Diego, EE. UU. | 555397 | Citometría de flujo, marcador de células mieloides (100 pruebas) |
| FITC Ratón Anti-Humano CD80 | BD Pharmingen, San Diego, EE. UU. | 557226 | Citometría de flujo, marcador M1 (100 pruebas) |
| FITC Mouse IgG1 y kappa; Control de isotipos | BD Pharmingen, San Diego, EE. UU | . | 555748 Citometría de flujo, control de isotipos para CD80 (100 pruebas) |
| FITC Mouse IgG2a, κ Control de isotipos | BD Biosciences, San Diego, EE. UU. | 553456 | Citometría de flujo, control de isotipos para CD14 (100 pruebas) |
| Bloque BD Fc humano | BD Biosciences, San Diego, EE. UU | 564220 | Citometría de flujo, bloque Fc (0,25 mg) |
| Interleucina humana 13 (IL-13) | R& D, Minneapolis, EE. UU. | IL-771-10 μ g | |
| Interleucina humana 4 (IL-4) | R& D, Minneapolis, EE. UU. | SRP3093-20 μ g | |
| Cabina de bioseguridad Labconco (Serie Delta 36212/36213) | Labconco, Kansas City, EE. UU.- | ||
| L-glutamina, 200 mM | ATCC, Manassas, EE. UU | 30-2214 | |
| Lipopolisacárido (LPS) de E. coli 0111:B4 | Sigma, St. Louis, EE. UU. | L2630-100 mg | |
| Mini raspadores celulares | Biotium, Fremont, EE. UU | 22003 | |
| Neubauer hemocitómetro | Fisher Scientific, Waltham, EE. UU. | 02-671-5 | |
| Microscopio invertido Nikon Eclipse TS100 | Nikon, Melville, EE. UU.- | ||
| Agua sin nucleasas | Invitrogen, Carlsbad, EE. UU. | AM9937 | |
| Microscopio óptico Olympus RH-2 | Microscopio Central, Feasterville, EE. UU. | 40888 | |
| Pipeta variable P10 - Gilson | VWR, Radnor, EE. UU. | 76180-014 | |
| Pipeta variable P1000-Gilson | VWR, Radnor, EE. UU. | 76177-990 | |
| Pipeta variable P200- Gilson | VWR, Radnor, EE. UU | 76177-988 | |
| Ratón PE Anti-Humano CD11b BD | Biosciences, San Diego, EE. UU. | 555388 | Citometría de flujo, marcador de células mieloides (100 pruebas) |
| Ratón PE IgG1, κ Control de | isotipos BD Biosciences, San Diego, EE.UU. | 555749 | Citometría de flujo, control de isotipos para CD11b (100 pruebas) |
| PE-Cy 5 Ratón Anti-Humano CD206 | BD Pharmingen, San Diego, EE.UU. | 551136 | Citometría de flujo, marcador M2 (100 pruebas) |
| PE-Cy 5 Ratón IgG1 κ Control de isotipo | BD Pharmingen, San Diego, EE. UU | 555750 | Citometría de flujo, control de isotipo para CD206 (100 pruebas) |
| Forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) | Sigma, St. Louis, EE. UU. | Pipeta P8139 | |
| Powerpette Plus | VWR, Radnor, EE. UU. | 75856-448 | |
| Baño de agua de precisión (modelo 183) | Precision Scientific, Chicago, EE. UU | 66551 | |
| RPMI-1640 Medio | ATCC, Manassas, EE. UU | 30-2001 | |
| Línea celular THP-1, Colección de Cultivos Tipo Americanos (ATCC) | ATCC, Manassas, EE. UU | TIB-202 |
Referencias
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