Artículo de método
Los macrófagos asociados a tumores (TAM) similares a M2 se asocian con progresión tumoral y mal pronóstico en el cáncer. Este protocolo sirve como una guía detallada para diferenciar y polarizar de manera reproducible las células similares a los monocitos THP-1 en macrófagos similares a M2 en un plazo de 14 días. Este modelo es la base para investigar los efectos antiinflamatorios de la TAM dentro del microambiente tumoral.
Los macrófagos asociados a tumores (TAM) pueden cambiar su expresión y perfil de citoquinas de acuerdo con los estímulos externos. Esta notable plasticidad permite a TAM adaptarse a los cambios en curso dentro del microambiente tumoral. Los macrófagos pueden tener principalmente atributos proinflamatorios (similares a M1) o antiinflamatorios (similares a M2) y pueden cambiar continuamente entre estos dos estados principales. Los macrófagos similares a M2 dentro del entorno tumoral se asocian con la progresión del cáncer y el mal pronóstico en varios tipos de cáncer. Se utilizan muchos métodos diferentes para inducir la diferenciación y polarización de las células THP-1 para investigar los mecanismos celulares e intercelulares y los efectos de TAM dentro del microambiente de los tumores. Actualmente, no existe un modelo establecido para la polarización de macrófagos similares a M2 utilizando la línea celular THP-1, y los resultados de la expresión y los perfiles de citoquinas de los macrófagos debido a ciertos estímulos in vitro varían entre los estudios. Este protocolo sirve como guía detallada para diferenciar las células similares a los monocitos THP-1 en macrófagos M0 y para polarizar aún más las células en un fenotipo similar a M2 dentro de los 14 días. Demostramos los cambios morfológicos de células similares a monocitos THP-1, macrófagos diferenciados y macrófagos polarizados similares a M2 utilizando microscopía de luz. Este modelo es la base para los modelos de línea celular que investigan los efectos antiinflamatorios de TAM y sus interacciones con otras poblaciones celulares del microambiente tumoral.
Los macrófagos asociados a tumores (TAM) y su papel en la inflamación crónica, la aparición del cáncer y el desarrollo de tumores son objetivos importantes en investigaciones recientes1,2. Los monocitos de sangre periférica que se reclutan en el microambiente tisular del tumor en desarrollo se diferencian en macrófagos y pueden polarizarse en dos subtipos principales de macrófagos3. El macrófago activado clásicamente representa el fenotipo M1 principalmente proinflamatorio y el subtipo similar a M2 activado alternativamente muestra características predominantemente antiinflamatorias
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Nota : una descripción general de los pasos descritos en este protocolo se muestra en la figura 1. Se compró la línea celular de leucemia similar a monocitos humanos THP-1. Se realizó un breve análisis de repetición en tándem para autenticar la línea celular THP-1. Realice todos los pasos en condiciones estériles. La línea celular monocítica THP-1 crece en suspensión y no se adhiere a las superficies de cultivo celular. La adherencia se puede inducir diferenciando los monocitos en células similares a los macrófagos a través de, por ejemplo, estrés mecánico o tratamiento específico conPMA.
1. Cultivo y ma....
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Se caracterizaron macrófagos similares a M2 y se validó la polarización M2 mediante citometría de flujo para marcadores de grupo de diferenciación (CD) CD14, CD11b, CD80 (marcador similar a M1) y CD206 (marcador similar a M2). La tinción por citometría de flujo se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los macrófagos se lavaron con PBS/5% FBS y se incubaron con el bloqueo del receptor Fcγ para evitar la unión inespecífica. Las células se tiñeron con anticuerpos CD14 y CD80 antihumanos conjugados con FIT.......
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Este protocolo sobre la diferenciación y polarización de células similares a monocitos THP-1 en 14 días proporciona un método para obtener macrófagos con un fenotipo distinto similar a M2 debido a la incubación de células de tratamiento prolongado con períodos de descanso adecuados entre pasos.
Ciertos pasos son críticos para este protocolo. El tiempo de duplicación de los monocitos THP-1 es de aproximadamente 26 h. Las células se pueden dividir a una densidad celular de 9 x10 5/ mL.......
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Los autores declaran que no hay posibles conflictos de intereses.
El Instituto Price de Investigación Quirúrgica de la Universidad de Louisville, cuenta con el apoyo financiero de John W. Price y Barbara Thruston Atwood Price Trust. Las fuentes de financiación no tuvieron ningún papel en el diseño y la realización del estudio, así como en la recopilación, gestión, análisis e interpretación de los datos.
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| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0,4% azul de tripán | VWR, Radnor, EE. UU | 152-5061 | |
| Tubo de microcentrífuga de 1,5 mL | EE. UU. Scientific, Ocala, EE. UU | 1615-5510 | |
| Pipeta serológica de 10 mL | VWR, Radnor, EE. UU. | 89130-898 | |
| 1000 y mu; L TipOne puntas de pipeta | USA Scientific, Ocala, USA | 1111-2821 | |
| 15 mL Tubo de centrífuga | VWR, Radnor, EE. UU. | 89039-664 | |
| 20 μ L TipOne puntas de pipeta | USA Scientific, Ocala, USA | 1120-1810 | |
| 200 μ L TipOne pipetas | USA Scientific, Ocala, USA | 1120-8810 | |
| 25 mL pipeta serológica | VWR, Radnor, USA | 89130-900 | |
| pipeta serológica de 5 mL | VWR, Radnor, EE. UU.& | nbsp; 89130-896 | |
| Tubo de centrífuga de 50 ml | VWR, Radnor, EE. UU. | 89039-662 | |
| Solución Accutase 500 mL | Sigma, St. Louis, EE. UU. | A6964 | |
| Solución antibiótica antimicótica (100x), Sigma estabilizada | , St. Louis, EE. UU. | A5955-100 mL | con 10.000 unidades de penicilina, 10 mg de estreptomicina y 25 μ g de anfotericina B por mL, filtrada estérilmente, Biorreactivo, apto para cultivos celulares |
| Incubadora de CO2 aglutinante | VWR, Radnor, EE. UU. | C170-ULE3 | |
| Matraz CytoOne T-75cm con tapón de filtro | USA Scientific, Ocala, EE. UU | . CC7682-4875 | |
| Dulbecco' s Solución salina tamponada con fosfato (PBS) | Sigma, St. Louis, EE. UU. | D8537-500 mL | PBS sin cloruro de calcio y cloruro de magnesio, ya que ambos pueden alterar la polarización de los macrófagos |
| Centrífuga Eppendorf 5804 R (refrigerada) | Eppendorf, Enfield, EE. UU. | - | |
| Alcohol etílico (70%) | - | - | |
| FACSCitómetro de flujo Alibur | BD Biosciences, San Diego, EE. UU. | - | El citómetro de flujo funciona con el software CellQuest (BD Biosciences) |
| Placa de 24 pocillos Falcon | VWR, Radnor, EE. UU. | 353504 | |
| Suero fetal bovino (FBS) | ATCC, Manassas, EE. UU. | 30-2020 | |
| FITC Ratón Anti-Humano CD14 | BD Biosciences, San Diego, EE. UU. | 555397 | Citometría de flujo, marcador de células mieloides (100 pruebas) |
| FITC Ratón Anti-Humano CD80 | BD Pharmingen, San Diego, EE. UU. | 557226 | Citometría de flujo, marcador M1 (100 pruebas) |
| FITC Mouse IgG1 y kappa; Control de isotipos | BD Pharmingen, San Diego, EE. UU | . | 555748 Citometría de flujo, control de isotipos para CD80 (100 pruebas) |
| FITC Mouse IgG2a, κ Control de isotipos | BD Biosciences, San Diego, EE. UU. | 553456 | Citometría de flujo, control de isotipos para CD14 (100 pruebas) |
| Bloque BD Fc humano | BD Biosciences, San Diego, EE. UU | 564220 | Citometría de flujo, bloque Fc (0,25 mg) |
| Interleucina humana 13 (IL-13) | R& D, Minneapolis, EE. UU. | IL-771-10 μ g | |
| Interleucina humana 4 (IL-4) | R& D, Minneapolis, EE. UU. | SRP3093-20 μ g | |
| Cabina de bioseguridad Labconco (Serie Delta 36212/36213) | Labconco, Kansas City, EE. UU.- | ||
| L-glutamina, 200 mM | ATCC, Manassas, EE. UU | 30-2214 | |
| Lipopolisacárido (LPS) de E. coli 0111:B4 | Sigma, St. Louis, EE. UU. | L2630-100 mg | |
| Mini raspadores celulares | Biotium, Fremont, EE. UU | 22003 | |
| Neubauer hemocitómetro | Fisher Scientific, Waltham, EE. UU. | 02-671-5 | |
| Microscopio invertido Nikon Eclipse TS100 | Nikon, Melville, EE. UU.- | ||
| Agua sin nucleasas | Invitrogen, Carlsbad, EE. UU. | AM9937 | |
| Microscopio óptico Olympus RH-2 | Microscopio Central, Feasterville, EE. UU. | 40888 | |
| Pipeta variable P10 - Gilson | VWR, Radnor, EE. UU. | 76180-014 | |
| Pipeta variable P1000-Gilson | VWR, Radnor, EE. UU. | 76177-990 | |
| Pipeta variable P200- Gilson | VWR, Radnor, EE. UU | 76177-988 | |
| Ratón PE Anti-Humano CD11b BD | Biosciences, San Diego, EE. UU. | 555388 | Citometría de flujo, marcador de células mieloides (100 pruebas) |
| Ratón PE IgG1, κ Control de | isotipos BD Biosciences, San Diego, EE.UU. | 555749 | Citometría de flujo, control de isotipos para CD11b (100 pruebas) |
| PE-Cy 5 Ratón Anti-Humano CD206 | BD Pharmingen, San Diego, EE.UU. | 551136 | Citometría de flujo, marcador M2 (100 pruebas) |
| PE-Cy 5 Ratón IgG1 κ Control de isotipo | BD Pharmingen, San Diego, EE. UU | 555750 | Citometría de flujo, control de isotipo para CD206 (100 pruebas) |
| Forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) | Sigma, St. Louis, EE. UU. | Pipeta P8139 | |
| Powerpette Plus | VWR, Radnor, EE. UU. | 75856-448 | |
| Baño de agua de precisión (modelo 183) | Precision Scientific, Chicago, EE. UU | 66551 | |
| RPMI-1640 Medio | ATCC, Manassas, EE. UU | 30-2001 | |
| Línea celular THP-1, Colección de Cultivos Tipo Americanos (ATCC) | ATCC, Manassas, EE. UU | TIB-202 |
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