Utilizando la mejora de la fluorescencia inducida por proteínas resueltas en el tiempo para identificar conformaciones locales estables un monómero α-sinucleína a la vez

Resumen

La mejora de la fluorescencia inducida por proteínas de una sola molécula resuelta en el tiempo es un útil sensor de proximidad espectroscópico de fluorescencia sensible a los cambios estructurales locales en las proteínas. Aquí mostramos que se puede usar para descubrir conformaciones locales estables en α-sinucleína, que también se conoce como globularmente no estructurada e inestable cuando se mide utilizando la regla FRET de mayor alcance.

Resumen

El uso de reglas espectroscópicas para rastrear múltiples conformaciones de biomoléculas individuales y su dinámica han revolucionado la comprensión de la dinámica estructural y sus contribuciones a la biología. Mientras que la regla basada en FRET informa sobre las distancias entre colorantes en el rango de 3-10 nm, otras técnicas espectroscópicas, como la mejora de la fluorescencia inducida por proteínas (PIFE), informan sobre la proximidad entre un colorante y una superficie de proteína en el rango más corto de 0-3 nm. Independientemente del método de elección, su uso en la medición de biomoléculas de difusión libre de una en una recupera histogramas del parámetro experimental que producen subtensiones separadas de biomoléculas distribuidas centralmente, donde cada subpuesto representa una sola conformación que permaneció sin cambios en milisegundos, o múltiples conformaciones que se interconvierten mucho más rápido que milisegundos, y por lo tanto una subalidad promediada. En fret de molécula única, donde el parámetro reportado en los histogramas es la eficiencia fretante entre colorantes, una proteína intrínsecamente desordenada, como el monómero de α-sinucleína en tampón, se informó previamente como exhibiendo una sola sub-población promediada de múltiples conformaciones que se interconvierten rápidamente. Si bien estos hallazgos anteriores dependen del rango de 3-10 nm de la regla basada en FRET, buscamos poner esta proteína a prueba utilizando PIFE de molécula única, donde rastreamos la vida útil de fluorescencia de las proteínas de α-sinucleínas α-Synuclein etiquetadas con sCy3 específicas del sitio. Curiosamente, utilizando este sensor de proximidad espectroscópico de corto alcance, la α-Sinucleína etiquetada con sCy3 exhibe varias subtensiones de por vida con vidas medias claramente diferentes que se interconvierten en 10-100 ms. Estos resultados muestran que, si bien α-sinucleína puede estar desordenada a nivel mundial, sin embargo, alcanza estructuras locales estables. En resumen, en este trabajo destacamos la ventaja de utilizar diferentes sensores de proximidad espectroscópicos que rastrean los cambios estructurales locales o globales una biomolécula a la vez.

Introducción

En las últimas dos décadas, los métodos basados en fluorescencia de una sola molécula se han convertido en una poderosa herramienta para medir biomoléculas^1,2,sondeando cómo se distribuyen los diferentes parámetros biomoleculares, así como cómo se interconvierten dinámicamente entre diferentes subtensiones de estos parámetros a una resolución de menos de milisegundos^3,4,5. Los parámetros en estas técnicas incluyen la eficiencia de transferencia de energía en las mediciones FRET ^6,

Protocolo

1. Transformación de plásmidos

1. Preparación de 0,5 L de SOC medio
   1. Pesar 10 g de triptona, 2,5 g de extracto de levadura, 0,25 g de cloruro de sodio (NaCl), 0,1 g de cloruro de potasio (KCl).
   2. Agregue agua de doble destilación (DDW) hasta un volumen total de 0.5 L.
   3. Ajuste al pH 7 agregando hidróxido de sodio (NaOH).
   4. Preparar alícuotas de stock de 100 mL y autoclave.
   5. Antes de usar, agregue 0.5 ml de cloruro de magnesio estéril (MgCl₂) y 1.8 ml de glucosa estéril a 100 ml de SOC.
2. Descongelar las células competentes de Escherichia coli BL21 (DE3) en hielo.
3. Mezc....

Resultados

Como IDP, cuando no está unido a otra biomolécula, α-Syn exhibe dinámica estructural entre múltiples conformaciones, con transiciones a pocos microsegundos⁴⁰ e incluso a cientos de nanosegundos^41. Cuando α-Syn cruza la mancha confocal, puede sufrir miles de transiciones entre conformaciones. De hecho, este fue el caso cuando se utilizó smFRET^39,40. Aquí realizamos mediciones smPIFE para sondear la dinámica conformac.......

Discusión

Se realizaron extensos estudios bioquímicos y biofísicos para estudiar las características estructurales de α-Syn y su naturaleza desordenada^{33,34,35,36,37,38}. Varios trabajos ya han utilizado smFRET de libre difusión para investigar la dinámica intramolecul molecular del monómero α-Syn libre de unión. Estos trabajos reportar.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Unidades de filtro centrífugo Amicon Ultra-15 Merc		C7715	corte: 100 kDa
sulfato de amonio	Sigma-Aldrich	A4418
BSA	Sigma-Aldrich	A9647
cisteamina	Sigma-Aldrich	30070
bolsas de diálisis - MEGA GeBaFlex-tube	Bio-Application MEGA320
ditiotreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	43815
ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)	Sigma-Aldrich	E5134
Solución rápida de tinción SeeBand	Bioaplicación génica	SB050
Glycine	Sigma-Aldrich	50046
D-Glucosa	Sigma-Aldrich	G7021
HEPES	Sigma-Aldrich	54457
HiTrap Desalinizador 5 mL	Sigma-Aldrich	GE17-1408
Ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromán-2-carboxílico (TROLOX)	Sigma-Aldrich	238813
isopropilo β-d-1-tiogalactopiranósido (IPTG)	Sigma-Aldrich	I5502
LB caldo	Sigma-Aldrich	L3152
Magnesio cloruro	Sigma-Aldrich	63068
Columna MonoQ	Sigma-Aldrich	54807
proteína LoBind tubo	Sigma-Aldrich	EP0030108094	0,5 mL
Enjuague un µ-slide 18	Ibidi	81816
SDS	Sigma-Aldrich	75746
Acetato de sodio	Sigma-Aldrich	S2889
Hidróxido de sodio	Sigma-Aldrich	S8045
Fosfato de sodio monobásico monohidratado	Sigma-Aldrich	71507
Esparcidores de células estériles, espátulas Drigalski	mini-plast	815-004-05-001
sulfato de estreptomicina	Sigma-Aldrich	S9137
sulfo-Cy3  maleimida	ABCAM	AB146493
Clorhidrato de Tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP)	Sigma-Aldrich	75259
Tris-HCl	Sigma-Aldrich	93363
Triptona	Sigma-Aldrich	T7293
Extracto de levadura	Sigma-Aldrich	Y1625