Artículo de método

Utilizando la mejora de la fluorescencia inducida por proteínas resueltas en el tiempo para identificar conformaciones locales estables un monómero α-sinucleína a la vez

DOI:

10.3791/62655

⸱

30 de mayo de 2021

 , 
1Department of Biological Chemistry, The Alexander Silberman Institute of Life Sciences, Faculty of Mathematics & Science, The Edmond J. Safra Campus, The Hebrew University of Jerusalem, 2The Center for Nanoscience and Nanotechnology, The Hebrew University of Jerusalem

En este artículo

Resumen

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La mejora de la fluorescencia inducida por proteínas de una sola molécula resuelta en el tiempo es un útil sensor de proximidad espectroscópico de fluorescencia sensible a los cambios estructurales locales en las proteínas. Aquí mostramos que se puede usar para descubrir conformaciones locales estables en α-sinucleína, que también se conoce como globularmente no estructurada e inestable cuando se mide utilizando la regla FRET de mayor alcance.

Resumen

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El uso de reglas espectroscópicas para rastrear múltiples conformaciones de biomoléculas individuales y su dinámica han revolucionado la comprensión de la dinámica estructural y sus contribuciones a la biología. Mientras que la regla basada en FRET informa sobre las distancias entre colorantes en el rango de 3-10 nm, otras técnicas espectroscópicas, como la mejora de la fluorescencia inducida por proteínas (PIFE), informan sobre la proximidad entre un colorante y una superficie de proteína en el rango más corto de 0-3 nm. Independientemente del método de elección, su uso en la medición de biomoléculas de difusión libre de una en una recupera histogramas del parámetro experimental que producen subtensiones separadas de biomoléculas distribuidas centralmente, donde cada subpuesto representa una sola conformación que permaneció sin cambios en milisegundos, o múltiples conformaciones que se interconvierten mucho más rápido que milisegundos, y por lo tanto una subalidad promediada. En fret de molécula única, donde el parámetro reportado en los histogramas es la eficiencia fretante entre colorantes, una proteína intrínsecamente desordenada, como el monómero de α-sinucleína en tampón, se informó previamente como exhibiendo una sola sub-población promediada de múltiples conformaciones que se interconvierten rápidamente. Si bien estos hallazgos anteriores dependen del rango de 3-10 nm de la regla basada en FRET, buscamos poner esta proteína a prueba utilizando PIFE de molécula única, donde rastreamos la vida útil de fluorescencia de las proteínas de α-sinucleínas α-Synuclein etiquetadas con sCy3 específicas del sitio. Curiosamente, utilizando este sensor de proximidad espectroscópico de corto alcance, la α-Sinucleína etiquetada con sCy3 exhibe varias subtensiones de por vida con vidas medias claramente diferentes que se interconvierten en 10-100 ms. Estos resultados muestran que, si bien α-sinucleína puede estar desordenada a nivel mundial, sin embargo, alcanza estructuras locales estables. En resumen, en este trabajo destacamos la ventaja de utilizar diferentes sensores de proximidad espectroscópicos que rastrean los cambios estructurales locales o globales una biomolécula a la vez.

Introducción

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En las últimas dos décadas, los métodos basados en fluorescencia de una sola molécula se han convertido en una poderosa herramienta para medir biomoléculas1,2,sondeando cómo se distribuyen los diferentes parámetros biomoleculares, así como cómo se interconvierten dinámicamente entre diferentes subtensiones de estos parámetros a una resolución de menos de milisegundos3,4,5. Los parámetros en estas técnicas incluyen la eficiencia de transferencia de energía en las mediciones FRET 6,7,anisotropía de fluorescencia8,9,rendimientos cuánticos de fluorescencia y vidasútiles 10,11,en función de diferentes mecanismos de enfriamiento de fluorescencia12 o mejora13. Uno de estos mecanismos, más conocido como mejora de la fluorescencia inducida por proteínas (PIFE)14 introduce la mejora del rendimiento cuántico de fluorescencia y la vida útil en función de la obstrucción estérica a la isomerización libre del fluoróforo cuando está en estado excitado, causada por superficies de proteínas en las cercanías del colorante14,15,16,17,18,19 . Tanto FRET como PIFE se consideran reglas espectroscópicas o sensores de proximidad, ya que su parámetro medido está directamente relacionado con una medida espacial dentro de la biomolécula etiquetada bajo medición. Mientras que la eficiencia FRET está relacionada con la distancia entre un par de colorantes dentro de un rango de 3-10 nm20,PIFE rastrea aumentos en los rendimientos cuánticos de fluorescencia o vidas útiles relacionadas con la distancia entre el tinte y una superficie de una proteína cercana en el rango de 0-3 nm19.

El FRET de molécula única se ha utilizado ampliamente para proporcionar información estructural sobre muchos sistemas de proteínas diferentes, incluidas las proteínas intrínsecamente desordenadas (IDPs)21, como la α-Sinucleína (α-Syn)22. α-Syn puede formar estructuras ordenadas después de la unión a diferentes biomoléculas y bajo diferentes condiciones23,24,25,26,27,28,29,30. Sin embargo, cuando no está unido, el monómero α-Syn se caracteriza por una alta heterogeneidad conformacional con conformaciones que se interconvierten rápidamente31,32.

Las conformaciones de α-Syn han sido estudiadas previamente utilizando diversas técnicas diferentes que ayudan a identificar dinámicas conformacionales de tales sistemas proteicos altamente heterogéneos y dinámicos33,34 , 35,36,37,38,39. Curiosamente, las mediciones fret de una sola molécula (smFRET) de α-Syn en tampón informaron una sola población fret39,40 que es el resultado del promedio de tiempo de conformaciones que se interconvierten dinámicamente a veces mucho más rápido que el tiempo de difusión típico de α-Syn a través del punto confocal (tiempos tan rápidos como pocos microsegundos e incluso más rápido que eso, en relación con los tiempos de difusión típicos de milisegundos)40, 41. Sin embargo, el uso de una regla espectroscópica FRET con la sensibilidad de distancia de 3-10 nm a veces informa solo sobre los cambios estructurales generales en una proteína pequeña como α-Syn. Las mediciones de una sola molécula que utilizan sensores de proximidad espectroscópicos con sensibilidades de distancia más cortas tienen el potencial de informar sobre la dinámica de las estructuras locales. Aquí realizamos mediciones PIFE de una sola molécula de α-Syn e identificamos diferentes sub-poblaciones de vidas de fluorescencia mapeando diferentes estructuras locales con transiciones entre ellas tan lentas como 100 ms. Este trabajo resume las mediciones smPIFE resueltas en el tiempo de moléculas de α-Syn de difusión libre de una en una, en tampón y cuando se unen a membranas basadas en SDS como un sensor de proximidad espectroscópico de molécula única de corto alcance.

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Protocolo

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1. Transformación de plásmidos

  1. Preparación de 0,5 L de SOC medio
    1. Pesar 10 g de triptona, 2,5 g de extracto de levadura, 0,25 g de cloruro de sodio (NaCl), 0,1 g de cloruro de potasio (KCl).
    2. Agregue agua de doble destilación (DDW) hasta un volumen total de 0.5 L.
    3. Ajuste al pH 7 agregando hidróxido de sodio (NaOH).
    4. Preparar alícuotas de stock de 100 mL y autoclave.
    5. Antes de usar, agregue 0.5 ml de cloruro de magnesio estéril (MgCl2) y 1.8 ml de glucosa estéril a 100 ml de SOC.
  2. Descongelar las células competentes de Escherichia coli BL21 (DE3) en hielo.
  3. Mezcle las células competentes suavemente.
  4. Preparar dos tubos de 15 ml. Etiquete uno como tubo de reacción de transformación y el otro como tubo de control.
  5. Alícuota 100 μL de células competentes en los tubos.
  6. Añadir 1 μL de plásmido a una concentración de 0,1 ng/μL en el tubo de reacción de transformación.
  7. Calentar el medio SOC en un baño de agua a 42 °C para su uso en el paso 1.8.
  8. Pulso térmico de los dos tubos en un baño de agua a 42 °C durante una duración de 45 segundos. (¡Paso crítico!)
  9. Añadir 900 μL de medio SOC calentado a cada tubo.
  10. Incubar los tubos a 37 °C durante 45 minutos con agitación a una velocidad de 225 rpm.
  11. Diseminar 200 μL de las células con el plásmido transformado en una placa de agar LB (Luria-Bertani) que contiene 100 μg/ml de ampicilina, utilizando un esparcidor celular estéril.
  12. Extender 200 μL de las células con el plásmido transformado en una placa de LB-agar sin ampicilina, utilizando un esparcidor estéril (control positivo).
  13. Diseminar 200 μL de las células de control (que no contienen un plásmido) sobre una placa de LB-agar que contiene 100 μg/ml de ampicilina, utilizando un esparcidor estéril(control negativo).
  14. Incubar las placas durante la noche a 37 °C.

2. Preparación de proteínas

  1. Expresión y purificación de α-sinucleína recombinante
    1. Elija una sola colonia y cultive en 100 ml de medio líquido LB (Luria-Bertani) en autoclave que contenga 100 μg/ml de ampicilina a 37 °C (iniciador).
    2. Preparar cuatro matraces Erlenmeyer de 2 L, cada uno con 1 L de medio LB en autoclave y 100 μg/ml de ampicilina (inoculación grande).
    3. Medir la densidad óptica (OD a λ = 600 nm) de la solución celular. Cuando la densidad celular del iniciador alcance un ODλ=600nm de 0.6-0.7, agregue 10 mL de solución de arranque por cada 1 L de medio LB preparado en el paso anterior.
    4. Cultive los medios bacterianos en un agitador de incubadora a 37 °C y una velocidad de 200 rpm.
    5. Cuando la densidad celular alcanza un ODλ=600nm de 0.6-0.8, inducir la expresión de proteínas agregando isopropilo β-d-1-tiogalactopyranoside (IPTG) por cada 1 L de medio de crecimiento a una concentración final de 1 mM.
      NOTA: Disolver 0,96 g de IPTG en 4 ml de DDW y añadir 1 ml de la solución de IPTG resultante por cada 1 L de crecimiento bacteriano.
    6. Cultivar las células durante 4 horas y recogerlas por centrifugación en tubos de 50 mL a una velocidad de 5.170 x g durante una duración de 8 minutos.
      NOTA: En cada ronda, deseche el sobrenadante, mantenga el pellet y llene nuevamente los mismos tubos con crecimiento bacteriano.
    7. Guarde el pellet bacteriano en el almacenamiento por congelación (por ejemplo, -80 °C) durante el día siguiente.
    8. Al día siguiente, prepare 200 ml de tampón de lisis: 40% (p/v) sacarosa y tampón A, que incluye 30 mM Tris-HCl, 2 mM de ácido etilendiaminetraacético (EDTA), 2 mM de ditiotreitol (TDT) a pH 8.0.
    9. Agregue 25 ml de tampón de lisis a cada tubo con gránulo bacteriano.
    10. Vuelva a suspender el pellet (utilice pipetas Pasteur de plástico estéril) en tampón de lisis (véase 2.1.8).
    11. Prepare un matraz Erlenmeyer estéril de 250 ml con un imán agitador sobre hielo.
    12. Agregue 5 ml de tampón de lisis y luego transfiera las células resislizadas homogéneas a él.
    13. Revuelva las células durante 20 minutos a 200 rpm a temperatura ambiente.
    14. Divida la solución en tubos de 50 ml y centrífuga a 4 °C durante 30 minutos a una velocidad de 17.400 x g.
    15. Deseche el sobrenadante.
    16. Preparar matraz estéril Erlenmeyer de 250 ml con imán agitador sobre hielo.
    17. Añadir 15 ml de tampón de disolución (90 ml de tampón A refrigerado y 37 μL de MgCl2 disuelto más allá del límite de solubilidad y filtrado) en cada tubo. Use pipetas Pasteur de plástico estéril y disuelva el pellet.
    18. Cuando parte de la solución se vuelva homogénea, muévala a un matraz Erlenmeyer agitado sobre hielo.
    19. Determine el volumen de solución en el Erlenmeyer.
    20. Agregue 10 mg de sulfato de estreptomicina por cada 1 ml de solución (antes de agregar, disuelva el sulfato de estreptomicina en 2 ml de tampón A).
      NOTA: Este paso se realiza con el fin de eliminar el ADN y los ribosomas.
    21. Revuelva la solución durante 10-20 minutos a temperatura ambiente.
    22. Divida la solución en tubos de 50 ml y centrífuga a 4 °C y a una velocidad de 20.700 x g durante 30 minutos.
    23. Recoge el sobrenadante y desecha el pellet.
    24. Prepare un matraz Erlenmeyer estéril de 250 ml sobre hielo con un agitador.
    25. Filtre el sobrenadante con un filtro de jeringa de 0,22 μm en el matraz Erlenmeyer limpio.
    26. Determine el volumen de la solución y pese 0,3 g de sulfato de amonio por cada 1 ml de solución.
    27. Gradualmente, agregue el sulfato de amonio a la solución agitada.
      NOTA: Este paso se realiza para precipitar proteínas. Cuando el sulfato de amonio se une a las proteínas, la solución se vuelve oscura y borrosa, lo que aparece como color blanco.
    28. Revuelva durante 30 minutos a temperatura ambiente.
    29. Divida la solución en tubos de 50 ml y centrífuga a 4 °C y a una velocidad de 20.700 g durante 30 minutos.
    30. Deseche cuidadosamente el sobrenadante y conserve el pellet.
    31. Disolver el pellet con 20 mL de Buffer A.
    32. Unifique todas las soluciones en un tubo y luego mida el espectro de absorción UV de la solución.
      NOTA: Si el espectro muestra una firma de agregación (absorción por encima de una longitud de onda de 300 nm), continúe con el siguiente paso. De lo contrario, omita el siguiente paso y vaya al paso 2.1.34.
      NOTA: El índice de agregación (A.I.) calculado a partir de los espectros UV como ODλ=350nm/ (ODλ=280nm - ODλ=350nm) ×100. 41
    33. Utilice tubos de centriprep de corte de 100 kDa y centrífuga a una velocidad de 3.590 x g a 4 °C durante 15 minutos. Recoge el líquido que pasó por el filtro.
    34. Dializar la solución a 4 °C durante la noche, contra Buffer A, utilizando bolsas de diálisis con un corte de 3,5 kDa.
    35. Realice otra ronda de diálisis durante una duración de al menos 4 horas.
    36. Cargue la muestra dializada en una columna de intercambio de aniones MonoQ de 1 ml. Utilice un tampón de clorhidrato Tris (Tris-HCl) de 30 mM a pH 7.5 como tampón de lavado y un tampón Tris-HCl de 30 mM pH 7.5 con NaCl de 500 mM como tampón de elución.
    37. Inyecte la muestra en la columna. Luego lavar con 20 volúmenes de columna (CV) de tampón de elución al 0% y tampón de lavado al 100% para eliminar las proteínas no unidas.
    38. Lavar con 7 CV de tampón de elución al 30%.
    39. Elute la muestra de proteína α-Syn utilizando un gradiente que cambia de 30% a 100% de tampón de elución para 30 CV, a una velocidad de flujo de 1,5 ml / min.
      NOTA: α-Syn elutes a 46-66 CV a una conductividad de 20-24 mS/cm, lo que se refiere al tampón de elución del 38-50%.
    40. Recoge las fracciones del pico de elución principal. Verifique la presencia de α-Syn ejecutando muestras en electroforesis en gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sodio al 15% (SDS-PAGE), después de la tinción con Coomassie Blue o Solución de tinción Fast SeeBand. Se espera una banda de 15 kDa.
    41. Unifique las fracciones pertinentes y diálisis durante la noche, contra el tampón A, utilizando bolsas de diálisis con un corte de 3,5 kDa a 4 °C.
    42. Preparar alícuotas de la muestra de proteína y almacenarlas a -20 °C.
  2. Α-Synuclein etiquetado con Cy3
    1. Reducir el tiol del residuo de cisteína en el mutante α-Syn A56C añadiendo TDT a una concentración final de 2 mM durante 1 hora a temperatura ambiente.
    2. Elimine la TDT realizando dos rondas de diálisis con bolsas de diálisis de corte de 3,5 kDa. Para la primera ronda, dializar contra 30 mM Tris-HCl pH 8.0 y 2 mM EDTA. Para la segunda ronda, dializar contra 50 mM HEPES pH 7.2 y 2 mM EDTA.
    3. Reduzca los residuos de cisteína agregando clorhidrato de tris(2-carboxietilo)fosfina (TCEP) a la muestra de proteína, a una concentración final de 50 μM durante una duración de 30 minutos a temperatura ambiente.
      NOTA: TCEP es un agente reductor no sulfhidrilo, por lo tanto, mantiene los grupos tiol reducidos sin reaccionar con el tinte. Añadimos 0,5 μL a partir de una solución stock de 1 M de TCEP.
    4. Calcule las cantidades de proteína requeridas para el volumen de reacción final de 1 ml.
      NOTA: Aquí hay un ejemplo para el cálculo que utilizamos:
      Concentración final de proteína de 20 μM × 1 ml de volumen final = concentración inicial de proteína de 56 μM × proteína V que se agregará
    5. Calcule la cantidad de tinte requerida para el volumen de reacción final de 1 ml. El etiquetado de colorante de una sola cisteína debe realizarse con exceso de colorante, en una proporción molar colorante:proteína de al menos 3:1.
      NOTA: Un ejemplo para el cálculo que utilizamos:
      Concentración final de colorante de 60 μM × 1 ml de volumen final = concentración inicial de colorante de 370 μM × de V de colorante que se agregará
    6. Calcule la cantidad de tampón del dializador necesario para ajustar el volumen total de reacción a 1 ml.
      NOTA: Ejemplo de cálculo: 1 mL - (V calculado a partir del paso 2.2.4 + V calculado a partir del paso 2.2.5)
    7. Prepare el vial de reacción con un imán en la parte superior de un agitador.
    8. En primer lugar, agregue la cantidad calculada de la proteína y el tampón. Después, agregue la cantidad calculada del tinte (maleimida sulfo-Cy3).
    9. Mantenga la reacción a temperatura ambiente en la oscuridad durante una duración de 3-5 horas.
    10. Finalice la reacción añadiendo 2 mM de TDT y continúe durante 1 hora.
    11. Realice tres rondas de diálisis contra Buffer A, utilizando bolsas de diálisis con un corte de 3,5 kDa para eliminar el exceso de colorante libre de la solución.
    12. Cargue la muestra en una columna de exclusión de tamaño para separar aún más el α-Syn etiquetado del tinte libre.
    13. Determinar la concentración de α-Syn puros etiquetados midiendo la absorción del colorante (el coeficiente de absorción para sulfo-Cy3 es de 162.000 M-1cm-1a λ=548 nm).
    14. Si es necesario, concentre la solución pura etiquetada α-Syn utilizando un concentrador de vacío (por ejemplo, SpeedVac). Luego, realice una ronda de diálisis contra el tampón A, utilizando bolsas de diálisis con un corte de 3.5 kDa y determine nuevamente la concentración de la proteína etiquetada.
    15. Preparar alícuotas de la muestra de proteína etiquetada y almacenarlas a -20 °C.

3. Medidas

  1. Configuración experimental de smPIFE
    NOTA: Utilice la siguiente configuración basada en confocales o similar.
    1. Utilice una fuente láser pulsada (en nuestro caso, λ = láser pulsado de picosegundos de 532 nm con un ancho de pulso de ~ 100 ps FWHM), que funcione a una velocidad de repetición adecuada (20 MHz en nuestro caso) y se dirija al SYNC de una tarjeta de conteo de fotón único correlacionada en el tiempo (TCSPC), como fuente de excitación sulfo-Cy3 (sCy3).
    2. Utilice un espejo dicroico con alta reflectividad a 532 nm, para separar la excitación y la dispersión de la fluorescencia.
    3. Utilice un agujero de alfiler de 100 μm de diámetro en el foco de la luz emitida, después de que el haz de emisión colimado haya sido enfocado por una lente y antes de que el haz de emisión haya sido recolimado por otra lente.
    4. Utilice un filtro de paso de banda (585/40 nm en nuestro caso) para filtrar aún más la fluorescencia sCy3 de otras fuentes de luz.
    5. Detectar la fluorescencia mediante un detector (diodo de avalancha de fotón único o fotomultiplicador híbrido, en nuestro caso) encaminado (a través de un router 4 a 1, en nuestro caso) a un módulo TCSPC (Becker & Hickl SPC-150, en nuestro caso).
      NOTA: En nuestro caso, la adquisición de datos se realiza a través del software VistaVision (ISSTM)en el formato de archivo time-tagged-time-resolved (TTTR).
  2. Preparación de muestras smPIFE
    1. Preparar 25 pM de α-Syn con etiqueta sCy3 en mediciones tampón: 10 mM de acetato de sodio, 10 mM de fosfato de dihidrógeno de sodio, 10 mM de glicina pH 8.0, 20 mM de NaCl, 10 mM de cisteamina y 1 mM de ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromo-2-carboxílico (TROLOX), en un tubo de unión a proteínas bajo.
      NOTA: Si α-Syn se mide en presencia de vesículas SDS, agregue también la cantidad SDS adecuada.
    2. Enjuague un portaobjetos de microscopía de 18 cámaras con 100 μL de albúmina sérica bovina (BSA) de 1 mg/ml durante 1 minuto y luego retire el BSA.
    3. Agregue 100 μL de la muestra de α-Syn de 25 pM con etiqueta sCy3 a una cámara en la diapositiva de la cubierta.
    4. Realice la medición smPIFE de la muestra utilizando la configuración descrita, como se indica a continuación en los pasos siguientes.
  3. Adquisición de datos smPIFE
    1. Utilice una lente de objetivo de inmersión en agua de alta apertura numérica (en nuestro caso, Olympus UPLSAPO 60x N.A. 1.2) y agregue una gota de agua ultra pura en la parte superior de la lente del objetivo.
    2. Fije el portaobjetos de la cubierta en una cámara de escenario e instálelo en la parte superior del escenario del microscopio.
    3. Lleve la lente del objetivo hacia arriba, hasta que la gota de agua en la parte superior de la lente del objetivo se manche en la parte inferior de la diapositiva del labio de la cubierta.
    4. Abra el obturador láser y lleve la lente del objetivo hacia arriba, mientras inspecciona el patrón en una cámara CMOS, recogiendo la luz dispersada de la muestra. Observe el patrón de anillos Airy: el primero representa el enfoque en la interfaz agua-vidrio, y luego el segundo representa el enfoque en la interfaz entre el vidrio y la solución de muestra.
    5. Aumente la altura de la lente del objetivo en 75 μm adicionales, llevando el enfoque láser profundamente en la solución, para minimizar la autofluorescencia de la superficie de vidrio de la cubierta.
    6. Ajuste la potencia del láser en la lente del objetivo para que sea de ~ 100 μW.
    7. Iniciar la adquisición de fotones detectados por un tiempo predefinido (2 horas, en nuestras mediciones).
      NOTA: La mayoría de la señal de adquisición debe tener una velocidad (medida en recuentos por segundo, cps) que sea similar a la adquirida cuando se mide solo el búfer; los datos de milisegundos encuadernados deberían mostrar eventos de ráfaga de fotones escasos, y la mayoría de los contenedores tienen una tasa promedio que es comparable a la tasa de fondo típica del detector (< 1,000 cps, en nuestro caso).

4. Análisis de ráfagas smPIFE

  1. Conversión de datos sin procesar
    NOTA: Los datos suelen almacenarse en un archivo binario con un formato que fue predefinido por la empresa que fabrica la tarjeta TCSPC (archivos .spc en nuestro caso).
    1. Convierta el archivo de datos sin procesar al formato de archivo universal photon-HDF542, utilizando la suite de software phconvert (https://github.com/Photon-HDF5/phconvert). Llame al archivo de datos sin procesar como entrada y conviértalo en un archivo .hdf5 de datos sin procesar utilizando el código apropiado en la suite phconvert (el cuaderno Convert ns-ALEX Becker-Hickl a Photon-HDF5.ipynb Jupyter, en nuestro caso).
      NOTA: La conversión en un archivo .hdf5 incluye: (1) determinar los flujos de fotones relevantes en los datos sin procesar (es decir, flujos de fotones de fotones registrados del ID del detector correspondiente); (2) los nanotiempos de fotones relevantes (los tiempos de detección de fotones en relación con el tiempo SYNC de excitación); y (3) metadatos añadidos.
  2. Búsqueda y selección de ráfagas mediante FRETbursts43
    NOTA: Todos los archivos de datos sin procesar photon-HDF5 de las mediciones smPIFE, así como el código que resume el análisis de los datos sin procesar, se almacenan en Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.4587698). Todos los pasos a continuación se detallan y se muestran en los cuadernos de Jupyter, también suministrados en el enlace del repositorio de Zenodo.
    1. Abra los Jupyter Notebooks (dentro del marco de Anaconda, en nuestro caso).
    2. Abra el portátil smPIFE-aSyn 56C(Cy3) 25 pM newBuffer (Final notebook).ipynb (se puede encontrar en el enlace de Zenodo).
    3. Cargar FRETbursts.
    4. Cargue el archivo de datos HDF5 del fotón.
    5. Evaluación de la tasa BG: utilizando el histograma de los tiempos entre fotones, calcule las tasas de fondo (BG) por cada 30 segundos de adquisición de datos en el archivo de datos HDF5 del fotón.
      NOTA: Los siguientes pasos describen la búsqueda de ráfaga utilizando el algoritmo de ventana deslizante44,45,46.
    6. Mueva una ventana de tiempo de m = 20 fotones consecutivos, un fotón a la vez.
    7. Recopile los datos de los fotones solo si la velocidad instantánea de los fotones, ( figure-protocol-1 ), es al menos F = 11 veces mayor que la velocidad BG para ese período de adquisición de datos.
      NOTA: Una ráfaga se construye a partir de todos los fotones consecutivos que se recolectaron deslizando la ventana un fotón a la vez (paso 4.2.6.) y de acuerdo con el criterio de velocidad de fotones (paso 4.2.7).
    8. Calcule las siguientes características de ráfaga:
      Tamaño de ráfaga: la cantidad de fotones en una ráfaga.
      Duración de la ráfaga: la diferencia de tiempo entre los tiempos de detección del último y el primer fotón en una ráfaga.
      Brillo de ráfaga: el mayor valor de la tasa instantánea de fotones en una ráfaga.
      Separación de ráfagas: el intervalo de tiempo entre ráfagas consecutivas.
      NOTA: Los siguientes puntos describen el procedimiento de selección de ráfagas adicional.
    9. Traza el histograma de los valores de brillo de ráfaga (la tasa de fotones instantáneos más alta en una ráfaga), con el eje de los eventos en escala logarítmica.
    10. Defina el umbral de brillo de ráfaga como el valor de brillo de ráfaga mínimo a partir del cual el histograma exhibe un patrón de descomposición.
    11. Seleccione ráfagas con valores de brillo mayores que el umbral de brillo de ráfaga.
      NOTA: Los siguientes pasos describen la vida útil de fluorescencia media de ráfaga.
    12. Trazar el histograma de nanotiempos de fotones para todos los fotones en todas las ráfagas seleccionadas con el eje de conteo de fotones en escala logarítmica.
    13. Defina el umbral de nanotiempo como el valor mínimo de nanotiempo a partir del cual el histograma de nanotiempos de fotones exhibe un patrón de descomposición.
    14. Seleccione solo fotones con nanotiempos mayores que el umbral de nanotiempo.
    15. Calcular el promedio algebraico de todos los nanotiempos de fotones seleccionados.
    16. Reste el umbral de nanotiempo del promedio algebraico de nanotiempo de fotones. El resultado es el nanotiempo medio de fotones de la explosión, que es directamente proporcional a la vida media de fluorescencia.
    17. Traza el histograma de todas las vidas de fluorescencia medias de ráfaga. Pueden aparecer sub poblaciones distribuidas centralmente de fluorescencia de por vida. Las subcun poblaciones con promedios de valores bajos representan especies de moléculas con sCy3 que no estaba obstruida estéricamente, mientras que las sub poblaciones con promedios de valores más altos representan especies de moléculas con sCy3 que estaba más obstruida estéricamente.
      NOTA: Los siguientes pasos describen la dinámica lenta entre ráfagas basada en el análisis de recurrencia deráfagas 47
    18. Trazar el histograma de los tiempos de separación de ráfaga, con el eje de tiempo de separación en escala logarítmica.
      NOTA: Aparecerán dos subpú poblaciones de tiempos de separación de ráfagas:
      Una subcoblación importante con tiempos de separación de segundos, que representa ráfagas consecutivas que se originan a partir de diferentes moléculas medidas consecutivamente.
      Una subcoblación menor con tiempos de separación ~ <100 ms, que representan ráfagas consecutivas que se originan en la misma molécula, recurriendo a través del volumen confocal.
    19. Seleccione para guardar todos los pares de ráfagas consecutivas que están separadas por menos de un tiempo de separación máximo que define la sub población de la misma molécula (<100 ms, en nuestro caso).
    20. Trazar un histograma o un gráfico de dispersión de las vidas medias de fluorescencia de la primera y segunda ráfaga para todos los pares de ráfagas que se repitieron por debajo de un cierto umbral de tiempo de separación

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Resultados

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Como IDP, cuando no está unido a otra biomolécula, α-Syn exhibe dinámica estructural entre múltiples conformaciones, con transiciones a pocos microsegundos40 e incluso a cientos de nanosegundos41. Cuando α-Syn cruza la mancha confocal, puede sufrir miles de transiciones entre conformaciones. De hecho, este fue el caso cuando se utilizó smFRET39,40. Aquí realizamos mediciones smPIFE para sondear la dinámica conformac...

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Discusión

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Se realizaron extensos estudios bioquímicos y biofísicos para estudiar las características estructurales de α-Syn y su naturaleza desordenada33,34,35,36,37,38. Varios trabajos ya han utilizado smFRET de libre difusión para investigar la dinámica intramolecul molecular del monómero α-Syn libre de unión. Estos trabajos reportar...

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Divulgaciones

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Todos los autores no comparten ningún conflicto de intereses.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El plásmido pT-t7 que codifica el mutante A56C α-Syn nos fue dado como regalo por el Dr. Asaf Grupi, el Dr. Dan Amir y el Dr. Elisha Haas. Este documento fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (NIH, subvención R01 GM130942 a E.L. como subaward), la Fundación de Ciencias de Israel (subvención 3565/20 dentro del Programa de Investigación KillCorona - Frenar el Coronavirus), el Fondo Milner y la Universidad Hebrea de Jerusalén (fondos de inicio).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Unidades de filtro centrífugo Amicon Ultra-15 MercC7715corte: 100 kDa
sulfato de amonioSigma-AldrichA4418
BSASigma-AldrichA9647
cisteaminaSigma-Aldrich30070
bolsas de diálisis - MEGA GeBaFlex-tubeBio-Application MEGA320
ditiotreitol (DTT)Sigma-Aldrich43815
ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)Sigma-AldrichE5134
Solución rápida de tinción SeeBandBioaplicación génicaSB050
GlycineSigma-Aldrich50046
D-GlucosaSigma-AldrichG7021
HEPESSigma-Aldrich54457
HiTrap Desalinizador 5 mLSigma-AldrichGE17-1408
Ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromán-2-carboxílico (TROLOX)Sigma-Aldrich238813
isopropilo β-d-1-tiogalactopiranósido (IPTG)Sigma-AldrichI5502
LB caldoSigma-AldrichL3152
Magnesio cloruroSigma-Aldrich63068
Columna MonoQSigma-Aldrich54807
proteína LoBind tuboSigma-AldrichEP00301080940,5 mL
Enjuague un µ-slide 18Ibidi81816
SDSSigma-Aldrich75746
Acetato de sodioSigma-AldrichS2889
Hidróxido de sodioSigma-AldrichS8045
Fosfato de sodio monobásico monohidratadoSigma-Aldrich71507
Esparcidores de células estériles, espátulas Drigalskimini-plast815-004-05-001
sulfato de estreptomicinaSigma-AldrichS9137
sulfo-Cy3  maleimidaABCAMAB146493
Clorhidrato de Tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP)Sigma-Aldrich75259
Tris-HClSigma-Aldrich93363
TriptonaSigma-AldrichT7293
Extracto de levaduraSigma-AldrichY1625

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gust, A., et al. A starting point for fluorescence-based single-molecule measurements in biomolecular research. Molecules. 19 (10), 15824-15865 (2014).
  2. Weiss, S. Fluorescence spectroscopy of single biomolecules. Science. 283 (5408), 1676-1683 (1999).
  3. Haran, G. Single-molecule fluorescence spectroscopy of biomolecular folding. Journal of Physics Condensed Matter. 15 (32), R1291(2003).
  4. Schuler, B., Lipman, E. A., Eaton, W. A. Probing the free-energy surface for protein folding with single-molecule fluorescence spectroscopy. Nature. 419 (6908), 743-747 (2002).
  5. Michalet, X., Weiss, S., Jäger, M. Single-molecule fluorescence studies of protein folding and conformational dynamics. Chemical Reviews. 106 (5), 1785-1813 (2006).
  6. Ha, T., Enderle, T., Ogletree, D. F., Chemla, D. S., Selvin, P. R., Weiss, S. Probing the interaction between two single molecules: Fluorescence resonance energy transfer between a single donor and a single acceptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (13), 6264-6268 (1996).
  7. Deniz, A. A., et al. Single-molecule protein folding: Diffusion fluorescence resonance energy transfer studies of the denaturation of chymotrypsin inhibitor 2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (10), 5179-5184 (2000).
  8. Bialik, C. N., Wolf, B., Rachofsky, E. L., Ross, J. B. A., Laws, W. R. Dynamics of biomolecules: Assignment of local motions by fluorescence anisotropy decay. Biophysical Journal. 75 (5), 2564-2573 (1998).
  9. Jameson, D. M., Sawyer, W. H. Fluorescence anisotropy applied to biomolecular interactions. Methods in Enzymology. 246, 283-300 (1995).
  10. Kempe, D., Schöne, A., Fitter, J., Gabba, M. Accurate Fluorescence Quantum Yield Determination by Fluorescence Correlation Spectroscopy. Journal of Physical Chemistry B. 119 (13), 4668-4672 (2015).
  11. Callis, P. R., Liu, T. Quantitative Prediction of Fluorescence Quantum Yields for Tryptophan in Proteins. Journal of Physical Chemistry B. 108, 4248-4259 (2004).
  12. Lehrer, S. S. Solute Perturbation of Protein Fluorescence. The Quenching of the Tryptophyl Fluorescence of Model Compounds and of Lysozyme by Iodide Ion. Biochemistry. 10 (17), 3254-3263 (1971).
  13. Xie, K. X., Liu, Q., Jia, S. S., Xiao, X. X. Fluorescence enhancement by hollow plasmonic assembly and its biosensing application. Analytica Chimica Acta. 1144, 96-101 (2021).
  14. Stennett, E. M. S., Ciuba, M. A., Lin, S., Levitus, M. Demystifying PIFE: The Photophysics behind the Protein-Induced Fluorescence Enhancement Phenomenon in Cy3. Journal of Physical Chemistry Letters. 6 (10), 1819-1823 (2015).
  15. Nguyen, B., Ciuba, M. A., Kozlov, A. G., Levitus, M., Lohman, T. M. Protein Environment and DNA Orientation Affect Protein-Induced Cy3 Fluorescence Enhancement. Biophysical Journal. 117 (1), 66-73 (2019).
  16. Song, D., Graham, T. G. W., Loparo, J. J. A general approach to visualize protein binding and DNA conformation without protein labelling. Nature Communications. 7, 10976(2016).
  17. Ploetz, E., et al. Förster resonance energy transfer and protein-induced fluorescence enhancement as synergetic multi-scale molecular rulers. Scientific Reports. 6, 33257(2016).
  18. Hwang, H., Myong, S. Protein induced fluorescence enhancement (PIFE) for probing protein-nucleic acid interactions. Chemical Society Reviews. 43 (4), 1221-1229 (2014).
  19. Hwang, H., Kim, H., Myong, S. Protein induced fluorescence enhancement as a single molecule assay with short distance sensitivity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (18), 7414-7418 (2011).
  20. Ray, P. C., Fan, Z., Crouch, R. A., Sinha, S. S., Pramanik, A. Nanoscopic optical rulers beyond the FRET distance limit: Fundamentals and applications. Chemical Society Reviews. 43, 6370-6404 (2014).
  21. Chen, H., Rhoades, E. Fluorescence characterization of denatured proteins. Current Opinion in Structural Biology. 18 (4), 516-524 (2008).
  22. Alderson, T. R., Markley, J. L. Biophysical characterization of α-synuclein and its controversial structure. Intrinsically Disordered Proteins. 1 (1), 18-39 (2013).
  23. Mane, J. Y., Stepanova, M. Understanding the dynamics of monomeric, dimeric, and tetrameric α-synuclein structures in water. FEBS Open Bio. 6 (7), 666-686 (2016).
  24. Wang, W., et al. A soluble α-synuclein construct forms a dynamic tetramer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (43), 17797-17802 (2011).
  25. Bartels, T., Choi, J. G., Selkoe, D. J. α-Synuclein occurs physiologically as a helically folded tetramer that resists aggregation. Nature. 477 (7362), 107-110 (2011).
  26. Ulmer, T. S., Bax, A., Cole, N. B., Nussbaum, R. L. Structure and dynamics of micelle-bound human α-synuclein. Journal of Biological Chemistry. 280 (10), 9595-9603 (2005).
  27. Georgieva, E. R., Ramlall, T. F., Borbat, P. P., Freed, J. H., Eliezer, D. Membrane-bound α-synuclein forms an extended helix: Long-distance pulsed ESR measurements using vesicles, bicelles, and rodlike micelles. Journal of the American Chemical Society. 130 (39), 12856-12857 (2008).
  28. Trexler, A. J., Rhoades, E. α-Synuclein binds large unilamellar vesicles as an extended helix. Biochemistry. 48 (11), 2304-2306 (2009).
  29. Stephens, A. D., Zacharopoulou, M., Kaminski Schierle, G. S. The Cellular Environment Affects Monomeric α-Synuclein Structure. Trends in Biochemical Sciences. 44 (5), 453-466 (2019).
  30. Illes-Toth, E., Dalton, C. F., Smith, D. P. Binding of dopamine to alpha-synuclein is mediated by specific conformational states. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (9), 1346-1354 (2013).
  31. Frimpong, A. K., Abzalimov, R. R., Uversky, V. N., Kaltashov, I. A. Characterization of intrinsically disordered proteins with electrospray inization mass spectrometry: Conformationl heterogeneity of α-synuciein. Proteins: Structure, Function and Bioinformatics. 78 (3), 714-722 (2010).
  32. Sandal, M., et al. Conformational equilibria in monomeric α-synuclein at the single-molecule level. PLoS Biology. 6 (1), e6(2008).
  33. Brodie, N. I., Popov, K. I., Petrotchenko, E. V., Dokholyan, N. V., Borchers, C. H. Conformational ensemble of native α-synuclein in solution as determined by short-distance crosslinking constraint-guided discrete molecular dynamics simulations. PLoS Computational Biology. 15 (3), e1006859(2019).
  34. Ullman, O., Fisher, C. K., Stultz, C. M. Explaining the structural plasticity of α-synuclein. Journal of the American Chemical Society. 133 (48), 19536-19546 (2011).
  35. Binolfi, A., Theillet, F. X., Selenko, P. Bacterial in-cell NMR of human α-synuclein: A disordered monomer by nature? Biochemical Society Transactions. 40 (5), 950-954 (2012).
  36. Waudby, C. A., et al. In-Cell NMR Characterization of the Secondary Structure Populations of a Disordered Conformation of α-Synuclein within E. coli Cells. PLoS ONE. 8 (8), e72286(2013).
  37. Yu, J., Malkova, S., Lyubchenko, Y. L. α-Synuclein Misfolding: Single Molecule AFM Force Spectroscopy Study. Journal of Molecular Biology. 384 (4), 992-1001 (2008).
  38. Guerrero-Ferreira, R., Kovacik, L., Ni, D., Stahlberg, H. New insights on the structure of alpha-synuclein fibrils using cryo-electron microscopy. Current Opinion in Neurobiology. 61, 89-95 (2020).
  39. Trexler, A. J., Rhoades, E. Single molecule characterization of α-synuclein in aggregation-prone states. Biophysical Journal. 99 (9), 3048-3055 (2010).
  40. Ferreon, A. C. M., Gambin, Y., Lemke, E. A., Deniz, A. A. Interplay of α-synuclein binding and conformational switching probed by single-molecule fluorescence. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (14), 5645-5650 (2009).
  41. Rezaei-Ghaleh, N., et al. Local and Global Dynamics in Intrinsically Disordered Synuclein. Angewandte Chemie - International Edition. 57 (46), 15262-15266 (2018).
  42. Ingargiola, A., Laurence, T., Boutelle, R., Weiss, S., Michalet, X. Photon-HDF5: An Open File Format for Timestamp-Based Single-Molecule Fluorescence Experiments. Biophysical Journal. 110 (1), 26-33 (2016).
  43. Ingargiola, A., Lerner, E., Chung, S. Y., Weiss, S., Michalet, X. FRETBursts: An open source toolkit for analysis of freely-diffusing Single-molecule FRET. PLoS ONE. 11 (8), e0160716(2016).
  44. Ingargiola, A., et al. Multispot single-molecule FRET: Highthroughput analysis of freely diffusing molecules. PLoS ONE. 12 (4), e0175766(2017).
  45. Eggeling, C., Fries, J. R., Brand, L., Günther, R., Seidel, C. A. M. Monitoring conformational dynamics of a single molecule by selective fluorescence spectroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (4), 1556-1561 (1998).
  46. Fries, J. R., Brand, L., Eggeling, C., Köllner, M., Seidel, C. A. M. Quantitative identification of different single molecules by selective time-resolved confocal fluorescence spectroscopy. Journal of Physical Chemistry A. 102, 6601-6613 (1998).
  47. Hoffmann, A., et al. Quantifying heterogeneity and conformational dynamics from single molecule FRET of diffusing molecules: Recurrence analysis of single particles (RASP). Physical Chemistry Chemical Physics. 13 (5), 1857-1871 (2011).
  48. Eakin, C. M., Berman, A. J., Miranker, A. D. A native to amyloidogenic transition regulated by a backbone trigger. Nature Structural and Molecular Biology. 13 (3), 202-208 (2006).
  49. Jahn, T. R., Parker, M. J., Homans, S. W., Radford, S. E. Amyloid formation under physiological conditions proceeds via a native-like folding intermediate. Nature Structural and Molecular Biology. 13 (3), 195-201 (2006).
  50. Chen, D., et al. Tau local structure shields an amyloid-forming motif and controls aggregation propensity. Nature Communications. 10 (1), 2493(2019).
  51. Lerner, E., Ploetz, E., Hohlbein, J., Cordes, T., Weiss, S. A Quantitative Theoretical Framework for Protein-Induced Fluorescence Enhancement-Förster-Type Resonance Energy Transfer (PIFE-FRET). Journal of Physical Chemistry. B. 120 (26), 6401-6410 (2016).
  52. Valuchova, S., Fulnecek, J., Petrov, A. P., Tripsianes, K., Riha, K. A rapid method for detecting protein-nucleic acid interactions by protein induced fluorescence enhancement. Scientific Reports. 6, 39653(2016).
  53. Qiu, Y., Myong, S. Single-Molecule Imaging With One Color Fluorescence. Methods in Enzymology. 581, 33-51 (2016).
  54. Lerner, E., et al. Toward dynamic structural biology: Two decades of single-molecule Förster resonance energy transfer. Science. 359 (6373), eaan1133(2018).
  55. Lerner, E., et al. FRET-based dynamic structural biology: Challenges, perspectives and an appeal for open-science practices. Elife. 10, e60416(2021).
  56. Wang, W., et al. A soluble α-synuclein construct forms a dynamic tetramer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (43), 17797-17802 (2011).
  57. Bartels, T., Choi, J. G., Selkoe, D. J. α-Synuclein occurs physiologically as a helically folded tetramer that resists aggregation. Nature. 477 (7362), 107-110 (2011).
  58. Ulmer, T. S., Bax, A., Cole, N. B., Nussbaum, R. L. Structure and dynamics of micelle-bound human α-synuclein. Journal of Biological Chemistry. 280 (10), 9595-9603 (2005).
  59. Georgieva, E. R., Ramlall, T. F., Borbat, P. P., Freed, J. H., Eliezer, D. Membrane-bound α-synuclein forms an extended helix: Long-distance pulsed ESR measurements using vesicles, bicelles, and rodlike micelles. Journal of the American Chemical Society. 130 (39), 12856-12857 (2008).
  60. Chen, J., et al. The structural heterogeneity of α-synuclein is governed by several distinct subpopulations with interconversion times slower than milliseconds. Structure. 29 (9), (2021).

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