Visualización de la formación de volantes de membrana mediante microscopía electrónica de barrido

Summary

La macropinocitosis es un proceso endocítico altamente conservado iniciado por la formación de proyecciones de membrana en forma de lámina rica en F-actina, también conocidas como volantes de membrana. El aumento de la tasa de internalización de solutos macropinocitóticos se ha implicado en diversas condiciones patológicas. Este protocolo presenta un método para cuantificar la formación de volantes de membrana in vitro utilizando microscopía electrónica de barrido.

Abstract

El rufilo de membrana es la formación de protuberancias de membrana plasmática móvil que contienen una malla de filamentos de actina recién polimerizados. Los volantes de membrana pueden formarse espontáneamente o en respuesta a factores de crecimiento, citoquinas inflamatorias y ésteres de forbol. Algunas de las protuberancias de la membrana pueden reorganizarse en volantes circulares de membrana que se fusionan en sus márgenes distales y forman copas que se cierran y separan en el citoplasma como vacuolas grandes y heterogéneas llamadas macropinosomas. Durante el proceso, los volantes atrapan el líquido extracelular y los solutos que se internalizan dentro de los macropinosomas. La microscopía electrónica de barrido (SEM) de alta resolución es una técnica de imagen comúnmente utilizada para visualizar y cuantificar la formación de volantes de membrana, protuberancias circulares y copas macropinocíticas cerradas en la superficie celular. El siguiente protocolo describe las condiciones de cultivo celular, la estimulación de la formación de volantes de membrana in vitro y cómo fijar, deshidratar y preparar células para imágenes utilizando SEM. También se describe la cuantificación del ruflejo de la membrana, la normalización de datos y los estimuladores e inhibidores de la formación de volantes de membrana. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre el papel de la macropinocitosis en los procesos fisiológicos y patológicos, investigar nuevos objetivos que regulan la formación de volantes de membrana e identificar estimuladores fisiológicos aún no caracterizados, así como nuevos inhibidores farmacológicos de la macropinocitosis.

Introduction

La macropinocitosis es un proceso endocítico responsable de internalizar una gran cantidad de líquido extracelular y su contenido a través de la formación de protuberancias dinámicas y de membrana plasmática impulsadas por actina llamadas volantes de membrana¹. Muchos de estos volantes de membrana forman copas que se cierran y se fusionan de nuevo en la célula y se separan de la membrana plasmática como endosomas intracelulares grandes y heterogéneos también conocidos como macropinosomas¹. Aunque la macropinocitosis es inducida por factores de crecimiento como el factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF) y el ....

Protocol

NOTA: El siguiente es un protocolo general utilizado para cuantificar la formación de volantes de membrana en macrófagos RAW 264.7 utilizando microscopía SEM. La optimización puede ser necesaria para diferentes tipos de células.

1. Línea celular y cultivo celular

1. Cultive macrófagos RAW 264.7 en el Medio Águila Modificada (DMEM) de Dulbecco suplementado con 10% (vol/vol) de Suero Fetal Bovino Inactivado térmicamente (FBS), 100 UI/ml de penicilina y 100 μg/ml de estreptomicina en una incubadora humidificada a 37 °C y 5% de CO₂. Reemplace los medios de crecimiento cada dos días.
2. Cuando las células se vuelvan 80% ....

Results

Aquí, describimos los resultados de la técnica presentada. Las imágenes REPRESENTATIVAS de SEM que se muestran en la Figura 1 demuestran la formación de volantes de membrana en macrófagos RAW 264.7 después del tratamiento con PMA y M-CSF. Las imágenes se capturaron primero a un aumento de 3.500x para fines de cuantificación y luego a niveles más altos de aumento (8.500x a 16.000x) para mostrar la membrana plasmática con mayores detalles. Pretratamiento de macrófagos con el inhibidor de la ma.......

Discussion

El presente protocolo de imágenes SEM proporciona una herramienta para visualizar y cuantificar la formación de volantes de membrana, protuberancias circulares y copas macropinocíticas en la superficie celular in vitro. Aunque el protocolo actual se centra en los macrófagos, los estudios han demostrado que la formación de volantes de membrana también ocurre en varios otros tipos de células, incluidas las células dendríticas, los fibroblastos, las neuronas y las células cancerosas

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5% Tripsina-EDTA	Gibco	15400-054
2% Glutaraldehído	Microscopía Electrónica Ciencias	16320
4% Paraformaldehído Santa	Cruz Biotechnology	281692
5-(N-etil-N-isopropil)-Amilorida	Sigma Life Science	A3085
Accuri C6 Citómetro
de flujoLengüetas adhesivas de carbono	Ciencias de la microscopía electrónica	77825-09
Dimetilsulfóxido Corning		25-950-CQC
Medio Eagle modificado de Dulbecco	Cytiva Life Sciences	SH30022.01
Falcon 24 pocillos Fondo plano claro tratado con TC Placa de cultivo celular multipocillo	Falcon	353047
Suero fetal bovino	Gemini Bio	900-108
FitC-dextran	Thermo Fisher Scientific	D1823
FM 4-64	Thermo Fisher Scientific	T13320
HERAcell 150i Incubadora de CO2	Thermo Fisher Scientific	51026282
Hummer Modelo 6.2 Recubridor por pulverización catódica	Anatech USA	58565
JSM-IT500HR Microscopio			electrónico de barrido
Cubierta de vidrio para microscopio	Thermo Fisher Scientific	12-545-82
Pluma Strep	Gibco	15140-122
forbol 12-miristato 13-acetato	Millipore Sigma	524400
RAW 264.7 macrófago	ATCC	ATCC TIB-71
Humano recombinante M-CSF	Peprotech	300-25
Samdri-790 Secador de punto crítico	Tousimis Research Corporation	8778B
SEM Montajes de muestras de aluminio	Ciencias de la microscopía electrónica	75220
Cacodilato de sodio	Ciencias de la microscopía electrónica	12300
Texas Red-Dextra	Thermo Fisher Scientific	D1864
Solución de azul de tripano	Thermo Fisher Scientific	15250061
			confocal Zeiss LSM 780