Visualización de la formación de volantes de membrana mediante microscopía electrónica de barrido

La macropinocitosis es un proceso endocítico responsable de internalizar una gran cantidad de líquido extracelular y su contenido a través de la formación de protuberancias dinámicas y de membrana plasmática impulsadas por actina llamadas volantes de membrana¹. Muchos de estos volantes de membrana forman copas que se cierran y se fusionan de nuevo en la célula y se separan de la membrana plasmática como endosomas intracelulares grandes y heterogéneos también conocidos como macropinosomas¹. Aunque la macropinocitosis es inducida por factores de crecimiento como el factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF) y el factor de crecimiento epidérmico (EGF) en una amplia gama de tipos de células, también se ha observado un proceso adicional único y dependiente del calcio conocido como macropinocitosis constitutiva en células inmunes innatas 2,3,4,5,6,7,8.

Se ha demostrado que la capacidad de las células para internalizar material extracelular a través de la macropinocitosis desempeña un papel importante en una variedad de procesos fisiológicos que van desde la absorción de nutrientes hasta la captura de patógenos y^la presentación de antígenos ^9,10,11. Sin embargo, debido a que este proceso no es selectivo e inducible, también se ha implicado en una serie de condiciones patológicas. De hecho, estudios previos sugirieron que la macropinocitosis juega un papel importante en la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, el cáncer, la nefrolitiasis y la aterosclerosis 12,13,14,15,16. Además, ciertas bacterias y virus han demostrado utilizar la macropinocitosis para entrar en las células huésped e inducir la infección^17,18. Curiosamente, la estimulación de la macropinocitosis también puede ser explotada para la administración dirigida de agentes terapéuticos en diversas condiciones de enfermedad^19,20.

Estudios previos han explorado la macropinocitosis mediante la cuantificación de marcadores de fase fluida marcados fluorescentemente internalizados en ausencia y presencia de agentes farmacológicos que inhiben la macropinocitosis mediante citometría de flujo e imágenes confocales^21,22. Las herramientas farmacológicas actualmente disponibles que inhiben la macropinocitosis se limitan y comprenden 1) inhibidores de la polimerización de actina (citochalasina D y latrunculinas), 2) bloqueadores PI3K (LY-290042 y wortmannin) y 3) inhibidores de intercambiadores de hidrógeno de sodio (NHE) (amilorida y EIPA)5,14,15,23,24,25 . Sin embargo, debido a que estos inhibidores tienen efectos independientes de la endocitosis, es difícil determinar selectivamente la contribución de la macropinocitosis a la absorción de solutos y la patogénesis de la enfermedad, especialmente in vivo²¹.

La microscopía electrónica de barrido (SEM) es un tipo de microscopio electrónico que produce imágenes de ultra alta resolución de células utilizando un haz enfocado de electrones²⁶. En la investigación de la macropinocitosis, las imágenes SEM se consideran la técnica estándar de oro para visualizar las características topográficas y morfológicas de la membrana plasmática, cuantificar la formación de volantes de membrana e investigar su progresión hacia la internalización de macropinosomas. Además, la microscopía electrónica de barrido combinada con la cuantificación de la absorción de solutos, en presencia y ausencia de bloqueadores de macropinocitosis, proporciona una estrategia confiable para examinar la internalización de solutos macropinocitóticos in vitro. Este documento proporciona un protocolo detallado sobre cómo preparar las células para SEM, visualizar la superficie celular, cuantificar la formación de volantes y examinar su progreso hacia el cierre de la copa y la internalización del macropinosoma.

NOTA: El siguiente es un protocolo general utilizado para cuantificar la formación de volantes de membrana en macrófagos RAW 264.7 utilizando microscopía SEM. La optimización puede ser necesaria para diferentes tipos de células.

1. Línea celular y cultivo celular

1. Cultive macrófagos RAW 264.7 en el Medio Águila Modificada (DMEM) de Dulbecco suplementado con 10% (vol/vol) de Suero Fetal Bovino Inactivado térmicamente (FBS), 100 UI/ml de penicilina y 100 μg/ml de estreptomicina en una incubadora humidificada a 37 °C y 5% de CO₂. Reemplace los medios de crecimiento cada dos días.
2. Cuando las células se vuelvan 80% confluentes, lave la placa dos veces con PBS estéril.
3. Separe las células añadiendo 1.000 μL de tripsina-EDTA al 0,5% e incube la placa de cultivo celular durante 3-5 min en una incubadora humidificada a 37 °C.
4. Examine la placa bajo un microscopio de luz para confirmar la disociación celular. Agregue 10 ml de medios de crecimiento que contengan 10% de FBS para inactivar la tripsina.
5. Recoger la suspensión celular en un tubo cónico de 50 ml y centrifugar a 400 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Resuspender suavemente las células en el medio de cultivo celular completo y determinar el recuento celular y la viabilidad utilizando la tinción de Trypan Blue (0,4%).
   NOTA: La viabilidad celular mínima recomendada para este experimento es de >90%.
6. Coloque cubiertas de vidrio estériles en los pocillos de una placa de 24 pocillos utilizando pinzas en autoclave. Sembrar células en hojas de cubierta a una densidad de 1 x 10⁶ células/ml e incubar la placa durante la noche en una incubadora humidificada a 37 °C y 5% de CO₂.
7. Cambie los medios de cada pozo con medios completos frescos de 500 μL antes del tratamiento. Pretratar macrófagos con vehículo (DMSO u otros disolventes utilizados para disolver EIPA) o el inhibidor de la macropinocitosis 5-(N-etil-N-isopropil)-amilorida (EIPA, 25 μM²¹) durante 30 min.
8. Tratar las células con vehículo y estimuladores de macropinocitosis para promover el erizado de la membrana: forbol 12-miristato 13-acetato (PMA, 1 μM, 30 min²¹) y factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF, 100 ng/mL, 30 min³).
   NOTA: Los inhibidores alternativos [por ejemplo, latrunculina A (1 μM, 30 min) o citocalasina D (1 μM, 30 min)] y estimuladores [por ejemplo, factor de crecimiento epidérmico (EGF, 100 ng/mL, 10 min) o factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF, 100 ng/mL, 15 min)] de macropinocitosis también se pueden usar para caracterizar la macropinocitosis en macrófagos y otros tipos de células^{16,27, 28,29}. Las células pueden requerir inanición sérica durante la noche antes del tratamiento con estimuladores fisiológicos de la macropinocitosis. Es importante tener en cuenta que las concentraciones y los tiempos de incubación más efectivos deberán determinarse para estimular la macropinocitosis en otros tipos de células.

2. Fijación SEM

1. Después del tratamiento, aspire los medios de los pozos y lave las fundas con PBS helado dos veces.
2. Fijar células (4% de paraformaldehído y 2% de glutaraldehído en 0,1 M de cacodilato de sodio) durante 30 min a temperatura ambiente, seguido de incubación durante la noche en el fijador a 4 °C.
3. Lave e incube suavemente los cubrehojas con 500 μL de reactivos siguientes sin perturbar la monocapa celular.
   1. Lavar una vez en 0,1 M de cacodilato de sodio e incubar durante 15 min.
   2. Lavar dos veces con dH₂O con 10 min de incubación en cada lavado.
   3. Lavar dos veces con etanol al 25% con 10 min de incubación en cada lavado.
   4. Lavar dos veces con etanol al 50% con 10 min de incubación en cada lavado.
   5. Lavar dos veces con etanol al 75% con 10 min de incubación en cada lavado.
   6. Lavar dos veces con etanol al 80% con 10 min de incubación en cada lavado.
   7. Lavar dos veces con etanol al 95% con 10 min de incubación en cada lavado.
   8. Lavar dos veces con etanol al 100%. Realizar 10 min de incubación en cada lavado.
      NOTA: El cambio / reemplazo de reactivos debe hacerse rápidamente para evitar el secado al aire de las células. Los coverslips se pueden dejar en etanol al 100% durante varios días a 4 °C. Para el almacenamiento a largo plazo, agregue etanol 100% adicional y cubra los pozos con parafilm para evitar el secado al aire de la muestra.

3. Secado en puntos críticos

1. Coloque las fundas en un secador de puntos críticos y cúbralas con etanol al 100%. Presione el botón de Encendido y abra el tanque de CO₂ .
2. Pulse el botón Cool durante aproximadamente 30 s hasta que la temperatura disminuya a 0 °C. Pulse el botón Rellenar hasta que aparezca una burbuja en la ventana de la cámara.
3. Presione el botón Purga hasta que desaparezca el olor a etanol del escape de purga. Pulse de nuevo el botón Cool hasta que la temperatura disminuya a 0 °C.
4. Vuelva a presionar los botones De llenado y Purga para apagarlos y cerrar el tanque de CO₂ . Vuelva a presionar el botón Cool para apagarlo y presione el botón Heat .
5. Ajuste la temperatura a 42 °C y la presión a 1.200 psi. Una vez que la presión y la temperatura se estabilicen, presione el botón Sangrado para permitir que la presión disminuya lentamente.
6. Una vez que la presión de la cámara alcance los 150 psi, presione el botón vent y espere hasta que la presión disminuya a 0 psi. Apague el secador de puntos críticos y retire las fundas.
7. Monte los trozos de cubierta en los soportes de muestras de aluminio SEM utilizando pestañas adhesivas de carbono y sujetos a recubrimiento de pulverización con oro / paladio en un recubridor de pulverización.
8. Encienda el botón de encendido y espere hasta que el vacío alcance los 30 mTorr. Enjuague la cámara para eliminar la humedad y el aire apagando el interruptor de gas y girando la válvula de gas fino en sentido contrario a las agujas del reloj.
9. Una vez que el vacío aumente a 200 mTorr, apague el interruptor de gas y espere hasta que el vacío alcance los 30 mTorr. Repita este paso 3 veces.
10. Presione el botón temporizador y ajuste la perilla de voltaje hasta que el medidor lea 10 mA. Retire las fundas recubiertas de la cámara.
    NOTA: Siga las instrucciones del fabricante para realizar el secado de puntos críticos y el recubrimiento de pulverización de la muestra.

4. Imagen y cuantificación

1. Inserte las hojas de cubierta de la muestra en la cámara de un microscopio electrónico de barrido. Cierre la puerta y pulse el botón Evac .
2. Abra el software de operación SEM. Ajuste el voltaje de aceleración a 15 kv y la distancia de trabajo a 10 mm.
3. Pulse el botón Coordenadas y desplácese por el mando hasta que aparezcan las celdas en el centro de la pantalla de observación. Establezca la ampliación en 3.500x e imagine la muestra haciendo clic en el botón Foto.
   NOTA: Use un nivel más alto de aumento (8,500x a 16,000x) para mostrar la membrana plasmática con mayor detalle.
4. Tome imágenes de al menos 10 ubicaciones aleatorias en los cobertores, asegurándose de que cada campo microscópico contenga múltiples células. Guarde las imágenes como archivos .tif.
5. A partir de las imágenes, localice los volantes de membrana, definidos como pliegues sobresalientes en forma de manta de la membrana plasmática, con un tamaño superior a 500 nm (Figura 1). Cuente el número de volantes por celda.
   NOTA: Los volantes en forma de C se identificaron como protuberancias curvas de membrana que no se fusionaron en sus extremos laterales [(Figura 1 (tratamiento M-CSF) y Figura 2B]. Los volantes de membrana circular fusionada, antes de su cierre, se identificaron como copas macropinocitóticas (Figura 2C).
6. Normalizar el número de volantes de membrana al número total de células en el campo microscópico evaluado. Repita este análisis para las muestras de cada grupo.

Aquí, describimos los resultados de la técnica presentada. Las imágenes REPRESENTATIVAS de SEM que se muestran en la Figura 1 demuestran la formación de volantes de membrana en macrófagos RAW 264.7 después del tratamiento con PMA y M-CSF. Las imágenes se capturaron primero a un aumento de 3.500x para fines de cuantificación y luego a niveles más altos de aumento (8.500x a 16.000x) para mostrar la membrana plasmática con mayores detalles. Pretratamiento de macrófagos con el inhibidor de la macropinocitosis EIPA atenuado de la formación de volantes de membrana (Figura 1). Las actividades de la membrana plasmática asociadas a la macropinocitosis se pueden dividir en cinco pasos consecutivos: 1) inicio del erizado de la membrana, 2) circularización, 3) formación de copas, 4) cierre de copas y 5) internalización del líquido extracelular y sus solutos asociados a través de la formación de macropinosomas. La Figura 2 muestra imágenes representativas de estas actividades morfológicamente distintas de la membrana plasmática después de la estimulación del M-CSF. Se capturaron volantes grandes en forma de lámina (Figura 2A), volantes circularizados en forma de C (Figura 2B) y copas macropinocíticas (Figura 2C) con un aumento de 6,000x a 7,000x. La microscopía electrónica de barrido se puede utilizar para proporcionar imágenes de alta resolución de la superficie celular, pero no se puede utilizar para visualizar macropinosomas internalizados. La cuantificación de los volantes de membrana después del tratamiento con PMA y M-CSF se muestra en la Figura 3. La formación de macropinosomas se puede confirmar mediante técnicas de imagen alternativas, incluida la microscopía confocal, como se muestra en la Figura 4. Finalmente, la cuantificación SEM del rufilo de la membrana debe complementarse con la cuantificación por citometría de flujo de un marcador fluorescente de fase fluida (por ejemplo, FITC o rojo dextrano de Texas) para confirmar la estimulación de la macropinocitosis (Figura 5).

Figura 1: Imágenes de microscopía electrónica de barrido de macrófagos RAW 264.7. Los macrófagos RAW 264.7 fueron pretratados con vehículo (control DMSO) o EIPA (25 μM) durante 30 min e incubados con PMA (1 μM, 30 min) o M-CSF (100 ng/mL, 30 min) para estimular el aleteo de la membrana. Las imágenes de la derecha muestran un aumento más alto de la superficie celular. Flechas rojas: volantes de membrana. Flecha verde: volante en forma de c. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Estadios morfológicos de la macropinocitosis capturados por microscopía electrónica de barrido. Los macrófagos RAW 264.7 se trataron con M-CSF (100 ng/mL) durante 30 min y las células se procesaron para imágenes SEM. (A) protuberancia de membrana en forma de lámina, (B) volante de membrana en forma de C y (C) copa macropinocítica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Cuantificación de la formación de volantes de membrana. Los macrófagos RAW 264.7 fueron pretratados con vehículo (control DMSO) o EIPA (25 μM) durante 30 min e incubados con PMA (1 μM, 30 min) o M-CSF (100 ng/mL, 30 min) para estimular el aleteo de la membrana. El gráfico de barras muestra el número de volantes de membrana normalizados al número total de células (n = 3). Los datos representan la media ± SEM. ANOVA unidireccional; *p < 0.05 vs. vehículo, #p < 0.05 vs. PMA o tratamiento M-CSF. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Formación de macropinosomas. Las células fueron pretratadas con PMA durante 30 min e incubadas con Texas red-dextran (25 μg/mL, rojo) y FM4-64 (5 μg/mL, verde) durante 10 min. Las imágenes se realizaron utilizando un microscopio confocal. Flechas azules: volantes de membrana, flechas amarillas: macropinosoma que contiene rojo-dextrano de Texas, flechas verdes: macropinosomas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Cuantificación de la macropinocitosis. Los macrófagos RAW 264,7 fueron pretratados con vehículo (control DMSO) o EIPA (25 μM) durante 30 min e incubados con PMA (1 μM) y FITC-dextrano (100 μg/mL; 70.000 MW) durante 2 h. El gráfico de barras muestra el cambio de pliegue de la intensidad media de fluorescencia (IMF) normalizado al tratamiento del vehículo (n = 3, realizado por triplicado). Los datos representan la media ± SEM. ANOVA unidireccional; *p < 0.05 vs. vehículo, #p < 0.05 vs. PMA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores declaran que no hay conflictos de intereses.