Estudio de transferencia de energía de fluorescencia de molécula única de síntesis de proteínas ribosómicas

Yuhong Wang

doi:10.3791/62664

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Artículo de método

Estudio de transferencia de energía de fluorescencia de molécula única de síntesis de proteínas ribosómicas

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DOI:

10.3791/62664

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6 de julio de 2021

Yuhong Wang¹

¹Department of Biology and Biochemistry, University of Houston

En este artículo

Resumen

La transferencia de energía de fluorescencia de molécula única es un método que rastrea la dinámica del ARNt durante la síntesis de proteínas ribosómicas. Al rastrear ribosomas individuales, se identifican poblaciones no homogéneas, lo que arroja luz sobre los mecanismos. Este método se puede utilizar para rastrear cambios biológicos conformacionales en general para revelar relaciones de función dinámica en muchos otros biosistemas complejados. Los métodos de molécula única pueden observar pasos no limitantes de velocidad e intermedios clave poco poblados, a los que no son accesibles los métodos de conjunto convencionales debido al efecto promedio.

Resumen

El ribosoma es un gran complejo de ribonucleoproteínas que ensambla proteínas procesivamente a lo largo de plantillas de ARNm. El diámetro del ribosoma es de aproximadamente 20 nm para acomodar grandes sustratos de ARNt en los sitios A, P y E. En consecuencia, la dinámica del ribosoma se desesfálice naturalmente rápidamente. El método de molécula única puede detectar cada ribosoma por separado y distinguir poblaciones no homogéneas, lo cual es esencial para revelar los complicados mecanismos de los sistemas de múltiples componentes. Informamos los detalles de un método smFRET basado en el microscopio invertido Nikon Ti2 para sondear la dinámica de los ribosomas entre la proteína ribosómica L27 y los ARNt. El L27 está etiquetado en su posición única Cys 53 y reconstituido en un ribosoma que está diseñado para carecer de L27. El ARNt está etiquetado en la región del codo. A medida que el ARNt se mueve a diferentes ubicaciones dentro del ribosoma durante el ciclo de elongación, como la pre y post-translocación, las eficiencias y dinámicas de FRET exhiben diferencias, lo que ha sugerido múltiples subpoblaciones. Estas subpoblaciones no son detectables por métodos de conjunto. El microscopio smFRET basado en TIRF está construido sobre un microscopio invertido manual o motorizado, con iluminación láser casera. Las muestras de ribosomas se purifican mediante ultracentrifugación, se cargan en una célula de muestra multicanal construida en casa y luego se iluminan a través de un campo láser evanescente. El punto láser de reflexión se puede utilizar para lograr el control de retroalimentación del enfoque perfecto. Las señales de fluorescencia están separadas por una torreta de filtro motorizada y recogidas por dos cámaras CMOS digitales. Las intensidades se recuperan a través del software NIS-Elements.

Introducción

El ribosoma es un complejo de ribonucleoproteína grande de ø 20 nm de una subunidad grande (50S) y una pequeña (30S). Ensambla péptidos largos a lo largo de la plantilla de ARNm de manera procesiva y cooperativa. El ribosoma 30S se une al fMet-tRNA^fMet y al ARNm para iniciar la síntesis de proteínas, y el 50S luego se une para formar el complejo de iniciación 70S. Los ARNt llevan aminoácidos al ribosoma en el sitio A (sitio de unión aminoacil-ARNt), mientras que la cadena peptidilada alargada se mantiene en el sitio P (sitio de unión peptidil-ARNt). En el complejo de pre-translocación, la cadena de peptidil se transfiere al ARNt en el sitio A con un aminoác....