Imágenes de espinas dendríticas en Caenorhabditis elegans

Las espinas dendríticas son estructuras celulares especializadas que reciben información de las neuronas vecinas para la transmisión sináptica. La activación de los receptores de neurotransmisores eleva el calcio intracelular y las vías de señalización aguas abajo en estas protuberancias neuronales características¹. Debido a la importancia fundamental de las espinas dendríticas para la neurotransmisión y su mala regulación en las enfermedades del neurodesarrollo¹, el descubrimiento de factores que modulan la morfogénesis y función de la columna dendrítica es de gran interés para el campo de la neurociencia.

Recientemente, se han identificado espinas dendríticas en el sistema nervioso de C. elegans basadas en características clave compartidas con espinas de mamíferos². Esta determinación es crucial porque abre la posibilidad de explotar las ventajas de C. elegans para investigar la biología de la columna vertebral. Las espinas dendríticas en las neuronas motoras Dorsal D (DD) reciben información de las neuronas colinérgicas (VA y VB) en el cordón nervioso ventral (Figura 1A)^2,3,4. Aquí, se presentan métodos de imagen para explorar la estructura de las espinas dendríticas DD y su función in vivo en un sistema nervioso intacto que es fácilmente accesible para imágenes en vivo y análisis genético. Para monitorear la forma de las espinas dendríticas, (1) proteínas fluorescentes citosólicas, que llenan el proceso dendrítico y las espinas; (2) proteínas fluorescentes unidas a la membrana, que decoran el borde de las espinas dendríticas y dendritas; o (3) se utilizan los marcadores de actina, LifeAct⁵ o Utrophin⁶, que están enriquecidos en espinas dendríticas, revelando así su forma. Para monitorear la funcionalidad de las espinas DD, la fluorescencia GCaMP se utiliza para detectar transitorios de Ca++ evocados por la activación de la opsina desplazada al rojo, Chrimson, en neuronas colinérgicas presinápticas⁷. Se espera que ambas estrategias faciliten el estudio de las espinas dendríticas DD en animales silvestres y mutantes.

1. Determinación de la estructura de las espinas dendríticas DD

1. Crear gusanos transgénicos para etiquetar las espinas DD
   1. Utilice el promotor flp-13 para construir un vector de expresión para la etiqueta de interés (por ejemplo, mCherry citoplasmático, MYR::mRuby, LifeAct::GFP, GFP::utrophin) (Figura 1). Véase la lista completa de plásmidos en el Archivo Suplementario 1.
   2. Utilizar métodos establecidos para generar una línea transgénica que marque las espinas DD ^8,9.
2. Preparar el sellador
   1. Haga una mezcla 1:1 de medio de incrustación a base de parafina¹⁰ (consulte la Tabla de materiales).
   2. Calentar el medio a 60 °C hasta que se derrita, luego alícuota en tubos de microcentrífuga tapados de 1,5 ml y mantener un bloque de calentamiento a 60-70 °C.
      NOTA: El sellador puede durar 4 semanas en el bloque de calentamiento.
3. Prepare un anestésico.
   1. Hacer soluciones madre en_H2Odestilado de tricaína al 1% y levamisol al 1 M (ver Tabla de materiales). Conservar a -20 °C.
   2. Preparar una solución de trabajo de tricaína al 0,05% y anestésico levamisol al 15 mM, como se describe en los pasos 1.3.3-1.3.5¹¹.
   3. Mezclar 75 μL de caldo de tricaína al 1% y 22,5 μL de levamisol 1 M.
   4. Agregue el búfer M9 a un volumen final de 1.5 mL.
   5. Alícuota 10 μL de tricocaína al 0,05%, 15 mM de levamisol en tubos de microcentrífuga de 0,5 ml y almacenar a -20 °C.
      NOTA: La mezcla anestésica es sensible a la temperatura, y las alícuotas individuales de la solución de trabajo no deben volver a congelarse después de la descongelación para cada experimento. Consulte el archivo complementario 2 para obtener una receta para el búfer M9.
4. Adquirir imágenes de alta resolución
   1. Preparar agarosa al 10% y mantenerla al baño maría a 60 °C.
      NOTA: Vea el informe de Monica Driscoll en WormBook¹².
   2. Monte 15-20 adultos jóvenes con almohadillas de agarosa al 10% y agregue 3 μL de anestésico (ver paso 3).
   3. Aplique el cubreobjetos (los gusanos se inmovilizan en 5 minutos).
   4. Selle los bordes del cubreobjetos con una mezcla selladora adhesiva fundida (consulte la Tabla de materiales).
   5. Adquirir imágenes
      1. Adquisición de superresolución
         1. Use un microscopio confocal de escaneo láser equipado para microscopía de súper resolución con una lente objetivo de aceite Plan-Apochromat de 63x / 1.40 para lograr un tamaño de píxel pequeño (por ejemplo, < 50 nm). Adquiera pilas Z utilizando el tamaño de paso recomendado por el software del fabricante (consulte la Tabla de materiales).
         2. Recopile una serie de secciones ópticas que abarquen el volumen total del proceso ventral DD (por ejemplo, 15-20 cortes a un tamaño de paso de 0,19 μm o un grosor de 2 a 3 μm). Envíe pilas Z para el procesamiento de imágenes utilizando el software del fabricante y analice imágenes con una puntuación superior a 7 (Figura 1B, Figura 2 y Figura 3).
      2. Adquisición de Nyquist
         1. Utilice un microscopio confocal de barrido láser para seleccionar el tamaño de píxel óptimo para la longitud de onda de la luz y la apertura numérica de la lente del objetivo en uso (por ejemplo, objetivo de aceite Plan Fluor 40x/1.4).
            NOTA: El tamaño de píxel más pequeño revelará la estructura fina de las espinas DD.
         2. Envíe la pila para la deconvolución 3D utilizando el algoritmo automático (consulte la Tabla de materiales) (Figura 3).
      3. Utilice el paso Z más pequeño posible (por ejemplo, determinado por la etapa piezoeléctrica) porque el sobremuestreo en Z puede producir imágenes más nítidas después de la deconvolución 3D¹³.
5. Análisis de imágenes
   1. Utilice el software de procesamiento de imágenes adecuado (consulte la Tabla de materiales) para crear proyecciones de intensidad máxima de las pilas Z¹⁴.
   2. Cuente manualmente las protuberancias en la dendrita DD.
      NOTA: Las protuberancias son extensiones perpendiculares desde el eje principal (Figura 1B, puntas de flecha).
   3. Determinar la longitud de la dendrita DD marcada para calcular la densidad de espinas por 10 μm de dendrita DD (Figura 1C).
   4. Clasifique las espinas como delgadas/hongo, filopodiosas, rechonchos o ramificadas (Figura 2A).
      NOTA: Las espinas delgadas / hongo exhiben una base estrecha (cuello) y una punta más ancha (cabeza). Las espinas filopodiales no muestran una base constreñida (sin cuello) pero tienen un ancho constante. Las espinas rechonchos tienen una base y punta anchas. Las espinas ramificadas son protuberancias con más de una punta.

2. Evaluación de la activación de las espinas dendríticas DD mediante señalización colinérgica presináptica

1. Crear gusanos transgénicos utilizando técnicas convencionales (por ejemplo, microinyección)^8,9
   1. Utilice el promotor flp-13 para impulsar la expresión del sensor Ca⁺⁺ , GCaMP6s, en las neuronas DD y el promotor unc-4 para impulsar la expresión de Chrimson, una canalrodopsina desplazada al rojo, en las neuronas VA presinápticas (Figura 4A). Ver la lista de plásmidos en el Archivo Suplementario 1.
2. Prepare All-trans Retinal (ATR) y placas de control.
   NOTA: ATR es un cofactor requerido para que Chrimson funcione como un canal iónico activado optogenéticamente.
   1. Preparar una solución madre ATR de 100 mM en etanol (100%). Conservar a -20 °C en alícuotas de 1 mL.
   2. Bajo una campana de flujo laminar, agregue 300 μL de cultivo bacteriano OP50 durante la noche y 0.25 μL de ATR a cada placa de agar nutriente NGM (medio de crecimiento de nematodos) de 60 mm y extienda con una varilla de vidrio estéril.
   3. Para los controles, agregue 300 μL de bacterias OP50 y 0,25 μL de etanol (100%) a un grupo separado de placas NGM.
   4. Deje que las placas reposen en la campana a temperatura ambiente durante 24 h (protegidas de la luz ambiental) para permitir el crecimiento bacteriano.
      NOTA: Las placas pueden usarse después de la incubación inicial de 24 h o mantenerse a 4 °C para usar dentro de los 5 días.
3. Configuración del experimento
   1. Coloque cinco larvas en etapa NC3569 L4 en ATR o placas de control con semillas OP50 que carezcan de ATR y crezcan en la oscuridad a 23 ° C.
   2. Tres días después, utilice un microscopio de disección estereoscópica para confirmar el desarrollo de la vulva para seleccionar la progenie de la etapa L4 de ATR y placas de control para obtener imágenes como se describe en los pasos 2.4.1-2.4.3.
   3. En un portaobjetos de microscopio, coloque 2 μL de poliperlas de 0,05 μm (2,5% de sólidos p/v) (consulte la Tabla de materiales).
   4. Use un alambre de platino ("sinfín recogedor") para agregar un pequeño glóbulo de súper pegamento a la solución y gire suavemente para generar "hebras" filamentosas de pegamento. Luego agregue 3 μL de tampón M9 (Figura 4B).
   5. Coloque aproximadamente diez larvas L4 en la solución y aplique un cubreobjetos.
      NOTA: Las fibras de pegamento entrarán en contacto aleatoriamente con los gusanos y los inmovilizarán después de aplicar el cubreobjetos. Los gusanos que están incrustados en grandes glóbulos de pegamento aparecen desecados y no deben ser fotografiados.
   6. Sellar los bordes del cubreobjetos mencionados en el paso 1.4.4.
4. Registro de transitorios de Ca⁺⁺ evocados en espinas dendríticas.
   1. Use un microscopio confocal de disco giratorio equipado con una cámara CCD sensible, una lente objetivo de aceite TIRF de 100x y líneas láser de 488 nm y 561 nm (consulte la Tabla de materiales).
   2. Ajuste la etapa del microscopio para colocar las espinas DD en el plano focal.
   3. Configuración de la adquisición de lapso de tiempo para iluminar la muestra con una línea láser de 488 nm en cada fotograma (para detectar la fluorescencia GCaMP6s) y la línea láser de 561 nm a intervalos periódicos (para la excitación Chrimson).
      NOTA: Por ejemplo, utilice una luz de 488 nm para capturar instantáneas consecutivas (200 ms) de señal GCaMP6s junto con un pulso de 200 ms de luz de 561 nm cada 5º fotograma (Figura 4C-E). Con esta configuración, los niveles de GCaMP antes y después de cada pulso de 561 nm se detectan a ~ 1 s de distancia (200 ms de láser de 488 nm para detectar GCaMP antes de la activación de VA, 200 ms de pulso de 561 nm para activar VA y ~ 600 ms para cambiar entre líneas láser y filtros de emisión. Con esta configuración, las neuronas VA se activan cada 2,5 s.
5. Análisis de imágenes de Ca⁺⁺ in vivo
   1. Utilice la deconvolución 2D y la alineación de imágenes para corregir pequeñas desviaciones derivadas del movimiento del gusano durante la adquisición (consulte la Tabla de materiales).
   2. Defina la columna dendrítica DD como la región de interés (ROI en las figuras 4C-D).
   3. Duplique el ROI y reubique en una región vecina dentro del gusano para recopilar la señal de fondo (es decir, ruido).
   4. Utilice el software apropiado (consulte la Tabla de materiales) para exportar las intensidades de GCaMP6s a Excel para cada punto de tiempo. Resta la fluorescencia de fondo de la fluorescencia del ROI de la columna vertebral.
   5. Determine el cambio en la fluorescencia restando la fluorescencia GCaMP6s en el marco inmediatamente antes de la excitación de 561 nm (F0) de cada punto de tiempo después de la excitación (ΔF), luego dividiendo por F0 para determinar ΔF / F0 (Figura 4E).
   6. Grafique las trazas normalizadas (Ver Tabla de materiales).
   7. Realice una prueba estadística pareada para cada medición de fluorescencia GCaMP6s antes y después de cada pulso de luz de 561 nm.
      NOTA: Este enfoque excluye efectivamente las fluctuaciones aleatorias en la fluorescencia GCaMP6s que de otro modo reducen el poder estadístico de comparar la señal media GCaMP6s de todas las mediciones antes y después de la excitación de 561 nm (Figura 4F).
   8. Para mediciones que muestran una distribución normal o gaussiana, use una prueba de ANOVA paramétrica pareada y corrija las comparaciones múltiples para cada uno de los dos grupos (ATR antes vs. después, sin ATR antes vs. después). Alternativamente, para los datos que normalmente no se distribuyen, utilice un ANOVA no paramétrico con corrección posthoc para pruebas múltiples.
      NOTA: Los gusanos cultivados en placas que carecen de ATR ("sin ATR") son controles necesarios y no deben mostrar transitorios de Ca⁺⁺ activados por 561 nm porque se requiere ATR para la función Chrimson.

Las mediciones con tres marcadores independientes (mCherry citosólico, LifeAct::GFP, MYR::mRuby) arrojaron una densidad promedio de 3.4 ± 1.03 espinas dendríticas DD por 10 μm de dendrita DD en adultos jóvenes de tipo salvaje (Figura 1B, C). Para este análisis, se excluyeron las mediciones obtenidas con el marcador GFP::Utrophin que produjo una densidad de columna significativamente menor (2.4 ± 0.74, Figura 1) debido a las interacciones de Utrophin con el citoesqueleto de actina6 que potencialmente impulsa la morfogénesis de la columna vertebral15. Las mediciones de la densidad de la columna vertebral en el microscopio óptico son comparables al valor de 4,2 espinas/10 μm de dendrita obtenido de la reconstrucción de 12 espinas a partir de micrografías electrónicas de la neurona DD12. El enfoque de imágenes de células vivas confirmó que la morfología delgada / en forma de hongo de las espinas DD predomina en las formas de columna vertebral adultas frente a las alternativas (por ejemplo, filopodionas, rechonchas, ramificadas) (Figura 2B), que también es típica de las espinas en el sistema nervioso de mamíferos maduros16.

Se utilizó una estrategia optogenética para preguntar si las presuntas espinas dendríticas detectadas por microscopía óptica de alta resolución (Figura 1 y Figura 2) responden a la liberación de neurotransmisores de sitios presinápticos, un sello distintivo característico de las espinas dendríticas en las neuronas de mamíferos. Se utilizó luz verde (561 nm) para activar una variante de canalrodopsina, Chrimson, en neuronas colinérgicas presinápticas y luz azul (488 nm) para detectar fluorescencia dependiente de Ca++ emitida por una sonda citoplasmática GCaMP en espinas dendríticas DD postsinápticas. Este experimento detectó ráfagas transitorias de señal GCaMP en espinas DD inmediatamente después de la activación optogenética de Chrimson en neuronas VA presinápticas (Figura 3). El éxito de este experimento depende de la expresión confiable de Chrimson en todas las neuronas VA presinápticas. En este caso, se utilizó un cromosómico integrado17 del marcador Punc-4::Chrimson para asegurar una expresión consistente de VA. Este experimento también podría llevarse a cabo con una matriz extracromosómica. La expresión carmesí en una neurona VA específica puede confirmarse de forma independiente, por ejemplo, acoplando el transgén Chrimson a una secuencia líder transplicada SL2 con una GFP localizada nuclearmente aguas abajo como marcador de coexpresión2. Es esencial realizar un experimento de control en ausencia de ATR para confirmar que la señal GCaMP medida depende de la activación optogenética de Chrimson, que es estrictamente dependiente de ATR (Figura 4D). Finalmente, debido a que las señales evocadas de Ca++ son transitorias, es crucial adoptar un protocolo de imagen que permita la conmutación rápida (<1 s) entre la excitación de 561 nm y la adquisición de señales GCaMP con el láser de 488 nm (Figura 4).

Figura 1: Etiquetado de espinas dendríticas DD . (A) (Arriba) Seis neuronas Dorsales D (DD1-DD6) en el cordón nervioso ventral de C. elegans. (Abajo) En los adultos, las espinas DD (punta de flecha) dirigidas ventralmente contactan con los terminales presinápticos de las neuronas motoras Ventral A (VA) y Ventral B (VB) (magenta), y las comisuras DD se extienden al cordón nervioso dorsal para proporcionar salida GABAérgica a los músculos del cuerpo (flecha)18. Esta cifra ha sido modificada de la Referencia2. (B) Micrografías fluorescentes (Airyscan) de espinas DD marcadas con mCherry citosólico, mRuby miristoilado (MYR::mRuby), LifeAct::GFP y GFP::Utrophin en gusanos adultos jóvenes. Las puntas de flecha grises apuntan a las espinas. Barra de escala = 2 μm. (C) Densidad (espinas/10 μm) de espinas dendríticas de la neurona DD marcadas con mCherry citosólico (3.77 ± 0.9), MYR::mRuby (3.09 ± 0.8), LifeAct::GFP (3.44 ± 1.1) o GFP::Utrophin (2.41 ± 0.8). Todas las muestras se distribuyen normalmente. One-Way ANOVA muestra que las densidades de columna vertebral para mCherry, MYR::mRuby y LifeAct::GFP citosólicos no son significativamente (NS) diferentes, mientras que la densidad de la columna vertebral se reduce para GFP::Utrophin vs. mCherry marcado citosólicamente (p = 0,0016) y LifeAct::GFP (p = 0,0082). La línea roja discontinua representa la densidad de la columna vertebral de las neuronas DD evaluadas a partir de la reconstrucción EM 3D (4,2 espinas / 10 μm). Esta cifra ha sido modificada de la Referencia2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Imágenes de espinas dendríticas DD. (A) (Arriba) Esquema de las formas de la columna vertebral. (Abajo) Imágenes de Airyscan de cada tipo de columna vertebral (barra de escala = 500 nm) etiquetadas con LifeAct::GFP (verde) y reconstrucciones 3D mediante micrografías electrónicas seriadas de un adulto congelado a alta presión (azul). (B) Frecuencia de la columna vertebral por tipo, visualizada con LifeAct::GFP: Delgado/Hongo (55.5 ± 14.5%), Filopodial (10.3 ± 8.70%), Rechoncho (18.8 ± 10.7%), Ramificado (15.42 ± 6.01%). Frecuencia de espinas por tipo visualizadas con MYR::mRuby: Delgada/Seta (52,2 ± 16,5%), Filopodial (5,68 ± 7,0%), Rechoncha (33,1 ± 14,8%), Ramificada (9,02 ± 9,6%). Prueba T no pareada, filopodial (p = 0,0339); Las espinas Stubby (p = 0.0009) y Branched (p = 0.011) etiquetadas con el marcador MYR::mRuby son significativamente diferentes de LifeAct::GFP. Esta cifra ha sido modificada de la Referencia2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Estrategias para adquirir imágenes de alta resolución de espinas DD . (A-B) (Arriba) Imágenes fluorescentes de dendritas DD1 marcadas con un marcador citosólico (mCherry) por (A) detector Airyscan y (B) adquisición de Nyquist. (Abajo) La dendrita DD (rojo) se representa con un software de análisis de imágenes (opción de trazador automático de filamentos), y las espinas DD (azul) se ilustran gráficamente utilizando el módulo de detección de espinas semiautomático. La flecha apunta a la columna vertebral ramificada agrandada en C y D. Las puntas de flecha denotan espinas delgadas / hongo vecinas agrandadas en C y D. Barra de escala = 2 μm. (C-D) Ejemplos ampliados de espina ramificada (flecha) (flecha) y (abajo) dos espinas delgadas / hongo vecinas (puntas de flecha) obtenidas con (C) detector Airyscan o por (D) adquisición de Nyquist. Barra de escala = 500 nm. Datos reproducidos de2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Evaluación de la función de las espinas DD. (A) Las neuronas motoras DD expresan el indicador Ca++ GCaMP6s (verde), y las neuronas motoras VA expresan la variante canalrodopsina, Chrimson (magenta)7. (B) Método de representación esquemática para montar gusanos para mediciones de Ca++ . (1) En un portaobjetos de microscopio limpio, (2) coloque 2 μL de perlas de polietileno de 0.05 μm, (3) use un alambre de platino ("pico de gusano") para agregar un pequeño glóbulo de súper pegamento y (4) gire en la solución para generar hebras filamentosas de pegamento. (5) Añadir 3μL de tampón M9. (6) Coloque aproximadamente diez larvas L4 en la solución, (7) aplique el cubreobjetos y selle los bordes con vaselina/cera. (C-D) La activación de las neuronas VA se correlaciona con transitorios de Ca++ en las espinas DD1. La imagen de fluorescencia GCaMP6s (a intervalos de 0,5 s) con activación periódica de la luz de Chrimson (intervalos de 2,5 s) evoca transitorios de Ca++ con (C) + ATR (n = 12) pero no en controles (D) (-ATR, n = 12). Los paneles son instantáneas a lo largo del tiempo (s), antes y después del pulso de luz de 561 nm (línea rosa vertical). Barras de escala = 2 μm. La señal GCaMP6s se adquiere de un ROI (Región de interés) en la punta de cada columna vertebral. (E) Fluorescencia GCaMP6s durante el período de grabación de 10 s trazado para +ATR (verde) vs -ATR (control, gris) (n = 12 videos). Las barras rosadas verticales denotan iluminación de 561 nm (por ejemplo, activación Chrimson). Cada animal fue estimulado 4 veces con luz de 561 nm. Las mediciones se recogieron antes y después de cada pulso de luz de 561 nm. (F) Gráfico de la fluorescencia GCaMP6s antes y después de cada pulso de luz de 561 nm. La fluorescencia GCaMP6s se midió 1 s después de cada pulso de luz de 561 nm. Debido a que las muestras no se distribuyen normalmente, se aplicó una prueba de Friedman no paramétrica pareada para corregir las comparaciones múltiples de la fluorescencia GCaMP6s antes vs. después de una estimulación lumínica de 561 nm para gusanos cultivados con ATR (+ATR, verde) (*** p = 0,0004, n = 48 mediciones) o en ausencia de ATR (-ATR, gris) (NS, no significativo, p = 0,0962, n = 48 mediciones). Esta cifra ha sido modificada de la Referencia2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Archivo complementario 1: Lista de plásmidos utilizados en el estudio. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 2: Composición y preparación del tampón M9. Haga clic aquí para descargar este archivo.

No declaramos ningún conflicto de intereses.