Este protocolo describe cómo generar un perfil de polisoma sin utilizar generadores de gradiente automatizados o sistemas de fraccionamiento de gradiente.
Artículo de método
Este protocolo describe cómo generar un perfil de polisoma sin utilizar generadores de gradiente automatizados o sistemas de fraccionamiento de gradiente.
El fraccionamiento de polisomas por centrifugación por gradiente de densidad de sacarosa es una herramienta poderosa que se puede utilizar para crear perfiles de ribosomas, identificar ARNm específicos que son traducidos por ribosomas y analizar factores asociados a polisomas. Si bien los fabricantes automatizados de gradientes y los sistemas de fraccionamiento de gradiente se usan comúnmente con esta técnica, estos sistemas son generalmente costosos y pueden ser prohibitivos para los laboratorios que tienen recursos limitados o no pueden justificar el gasto debido a su necesidad poco frecuente u ocasional de realizar este método para su investigación. Aquí, se presenta un protocolo para generar de forma reproducible perfiles polisomáticos utilizando equipos estándar disponibles en la mayoría de los laboratorios de biología molecular sin instrumentos especializados de fraccionamiento. Además, se proporciona una comparación de perfiles de polisomas generados con y sin un sistema de fraccionamiento de gradiente. Se discuten estrategias para optimizar y producir perfiles polisómicos reproducibles. Saccharomyces cerevisiae se utiliza como organismo modelo en este protocolo. Sin embargo, este protocolo se puede modificar y adaptar fácilmente para generar perfiles de ribosomas para muchos organismos y tipos de células diferentes.
Los ribosomas son complejos de ribonucleoproteínas mega-Dalton que realizan el proceso fundamental de traducir el ARNm en proteínas. Los ribosomas son responsables de llevar a cabo la síntesis de todas las proteínas dentro de una célula. Los ribosomas eucariotas comprenden dos subunidades designadas como la subunidad ribosómica pequeña (40S) y la subunidad ribosómica grande (60S) de acuerdo con sus coeficientes de sedimentación. El ribosoma completamente ensamblado se designa como el monosoma 80S. Los polisomas son grupos de ribosomas dedicados a traducir una sola molécula de ARNm. El fraccionamiento de polisomas por centrifugación por gradiente de densidad de sacaros....
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1. Preparación de gradientes de sacarosa al 7% - 47%
NOTA: El rango lineal del gradiente de sacarosa se puede modificar para lograr una mejor separación dependiendo del tipo de célula utilizada. Este protocolo está optimizado para perfiles de polisomas para S. cerevisiae.
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En la Figura 3 se muestran tres perfiles polisómicos representativos. Todos los perfiles son de la misma cepa de levadura. Un perfil polisomático típico tendrá picos bien resueltos para las subunidades ribosómicas 40S, 60S y 80S, así como para los polisomas. La cresta de cada subunidad ribosómica y pico del polisoma será evidente en cada perfil (Figura 3). En la Figura 3A se muestra un perfil representativo de un sistema automatizad.......
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Aquí se ha descrito un método para crear perfiles polisómicos sin el uso de costosos sistemas de fraccionamiento automatizado. La ventaja de este método es que hace que el perfil de polisomas sea accesible para los laboratorios que no tienen sistemas de fraccionamiento automatizados. Las principales desventajas de este protocolo son el tedioso fraccionamiento manual y la sensibilidad reducida en comparación con el sistema de fraccionamiento de densidad dedicado.
Este protocolo implica una prep.......
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Los autores no tienen nada que revelar.
Los autores agradecen al Dr. Percy Tumbale y a la Dra. Melissa Wells por su lectura crítica de este manuscrito. Este trabajo fue apoyado por el Programa de Investigación Intramuros del Instituto Nacional de Salud de los Estados Unidos; Instituto Nacional de Ciencias de la Salud Ambiental de los Estados Unidos (NIEHS; ZIA ES103247 a R.E.S).
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| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Fraccionador automático | Brandel | ||
| Clariostar Lector de placas multimodo | BMG Labtech | ||
| Cicloheximida | Sigma Aldrich | C7698 | |
| Dithiothreitol | Invitrogen | 15508-013 | |
| Perlas de vidrio, lavadas con ácido | Sigma Aldrich | G8772 | 425– 600 μ m |
| Heparina | Sigma Aldrich | H4784 | |
| Cloruro de magnesio, 1 m | KD Medical | CAC-5290 | |
| , 22 g, cubo de metal | Hamilton Company | 7748-08 | longitud personalizada 9 pulgadas, estilo de punta 3 |
| Ultracentrífuga Optima XL-100K Beckman | Coulter | ||
| Tubos de centrífuga de polipropileno | Beckman Coulter | 331372 | |
| Estante de clavijas para tubo de ensayo de polipropileno | Fisher Scientific | 14-810-54A | |
| Cloruro de potasio | Sigma Aldrich | P9541 | |
| Qubit 4 Fluorímetro | Thermo Fisher Scientific | Q33228 | |
| Qubit Kit de ensayo HS | Thermo Fisher Scientific | Q32855 | |
| Inhibidor de ARNasa | Applied Biosystems | N8080119 | |
| Sacarosa | Sigma Aldrich | S0389 | |
| SW41 Paquete de rotor de cubeta oscilante | Beckman Coulter | 331336 | |
| jeringa, 3 mL | Coviden | 888151394 | |
| Tris, 1 m, pH 7.4 | KD Medical | RGF-3340 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Microplaca UV-Star, 96 pocillos | Greiner Bio-One |
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