Perfilado de polisomas sin fabricantes de gradiente ni sistemas de fraccionamiento

Summary

Este protocolo describe cómo generar un perfil de polisoma sin utilizar generadores de gradiente automatizados o sistemas de fraccionamiento de gradiente.

Abstract

El fraccionamiento de polisomas por centrifugación por gradiente de densidad de sacarosa es una herramienta poderosa que se puede utilizar para crear perfiles de ribosomas, identificar ARNm específicos que son traducidos por ribosomas y analizar factores asociados a polisomas. Si bien los fabricantes automatizados de gradientes y los sistemas de fraccionamiento de gradiente se usan comúnmente con esta técnica, estos sistemas son generalmente costosos y pueden ser prohibitivos para los laboratorios que tienen recursos limitados o no pueden justificar el gasto debido a su necesidad poco frecuente u ocasional de realizar este método para su investigación. Aquí, se presenta un protocolo para generar de forma reproducible perfiles polisomáticos utilizando equipos estándar disponibles en la mayoría de los laboratorios de biología molecular sin instrumentos especializados de fraccionamiento. Además, se proporciona una comparación de perfiles de polisomas generados con y sin un sistema de fraccionamiento de gradiente. Se discuten estrategias para optimizar y producir perfiles polisómicos reproducibles. Saccharomyces cerevisiae se utiliza como organismo modelo en este protocolo. Sin embargo, este protocolo se puede modificar y adaptar fácilmente para generar perfiles de ribosomas para muchos organismos y tipos de células diferentes.

Introduction

Los ribosomas son complejos de ribonucleoproteínas mega-Dalton que realizan el proceso fundamental de traducir el ARNm en proteínas. Los ribosomas son responsables de llevar a cabo la síntesis de todas las proteínas dentro de una célula. Los ribosomas eucariotas comprenden dos subunidades designadas como la subunidad ribosómica pequeña (40S) y la subunidad ribosómica grande (60S) de acuerdo con sus coeficientes de sedimentación. El ribosoma completamente ensamblado se designa como el monosoma 80S. Los polisomas son grupos de ribosomas dedicados a traducir una sola molécula de ARNm. El fraccionamiento de polisomas por centrifugación por gradiente de densidad de sacaros....

Protocol

1. Preparación de gradientes de sacarosa al 7% - 47%

NOTA: El rango lineal del gradiente de sacarosa se puede modificar para lograr una mejor separación dependiendo del tipo de célula utilizada. Este protocolo está optimizado para perfiles de polisomas para S. cerevisiae.

1. Preparar soluciones madre de sacarosa al 7% y 47% en tampón de gradiente de sacarosa (20 mM Tris-HCl pH 7.4, 60 mM KCl, 10 mM MgCl₂ y 1 mM DTT). Esterilizar con filtro las soluciones madre de sacarosa a través de un filtro de 0,22 μm y almacenar a 4 °C.
2. Prepare 14 ml de soluciones de sacarosa al 17%, 27% y 37% dispensando y mezclando....

Results

En la Figura 3 se muestran tres perfiles polisómicos representativos. Todos los perfiles son de la misma cepa de levadura. Un perfil polisomático típico tendrá picos bien resueltos para las subunidades ribosómicas 40S, 60S y 80S, así como para los polisomas. La cresta de cada subunidad ribosómica y pico del polisoma será evidente en cada perfil (Figura 3). En la Figura 3A se muestra un perfil representativo de un sistema automatizad.......

Discussion

Aquí se ha descrito un método para crear perfiles polisómicos sin el uso de costosos sistemas de fraccionamiento automatizado. La ventaja de este método es que hace que el perfil de polisomas sea accesible para los laboratorios que no tienen sistemas de fraccionamiento automatizados. Las principales desventajas de este protocolo son el tedioso fraccionamiento manual y la sensibilidad reducida en comparación con el sistema de fraccionamiento de densidad dedicado.

Este protocolo implica una prep.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fraccionador automático	Brandel
Clariostar Lector de placas multimodo	BMG Labtech
Cicloheximida	Sigma Aldrich	C7698
Dithiothreitol	Invitrogen	15508-013
Perlas de vidrio, lavadas con ácido	Sigma Aldrich	G8772	425– 600 μ m
Heparina	Sigma Aldrich	H4784
Cloruro de magnesio, 1 m	KD Medical	CAC-5290
, 22 g, cubo de metal	Hamilton Company	7748-08	longitud personalizada 9 pulgadas, estilo de punta 3
Ultracentrífuga Optima XL-100K Beckman	Coulter
Tubos de centrífuga de polipropileno	Beckman Coulter	331372
Estante de clavijas para tubo de ensayo de polipropileno	Fisher Scientific	14-810-54A
Cloruro de potasio	Sigma Aldrich	P9541
Qubit 4 Fluorímetro	Thermo Fisher Scientific	Q33228
Qubit Kit de ensayo HS	Thermo Fisher Scientific	Q32855
Inhibidor de ARNasa	Applied Biosystems	N8080119
Sacarosa	Sigma Aldrich	S0389
SW41 Paquete de rotor de cubeta oscilante	Beckman Coulter	331336
jeringa, 3 mL	Coviden	888151394
Tris, 1 m,  pH 7.4	KD Medical	RGF-3340
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100
Microplaca UV-Star, 96 pocillos	Greiner Bio-One