Propagación de células y órganos dentales y respiratorios en microgravedad

Summary

Este protocolo presenta un método para el cultivo y crecimiento 3D de células similares a ameloblastos en microgravedad para mantener su forma alargada y polarizada, así como la expresión de proteínas específicas del esmalte. También se describen las condiciones de cultivo para el cultivo de construcciones de ingeniería periodontal y órganos pulmonares en microgravedad.

Abstract

La gravedad es uno de los determinantes clave de la función celular humana, la proliferación, la arquitectura citoesquelética y la orientación. Los sistemas de biorreactores rotativos (RCCS) imitan la pérdida de gravedad a medida que ocurre en el espacio y, en cambio, proporcionan un entorno de microgravedad a través de la rotación continua de células o tejidos cultivados. Estos RCCS aseguran un suministro ininterrumpido de nutrientes, factores de crecimiento y transcripción, y oxígeno, y abordan algunas de las deficiencias de las fuerzas gravitacionales en placas de cultivo de células u órganos 2D (bidimensionales) inmóviles. En el presente estudio hemos utilizado CCR para cocultivar células del asa cervical y células de la pulpa dental para que se conviertan en ameloblastos, para caracterizar las interacciones progenitor/andamio periodontal y para determinar el efecto de la inflamación sobre los alvéolos pulmonares. Los entornos de RCCS facilitaron el crecimiento de células similares a los ameloblastos, promovieron la proliferación de progenitores periodontales en respuesta a los recubrimientos de andamios y permitieron una evaluación de los efectos de los cambios inflamatorios en los alvéolos pulmonares cultivados. Este manuscrito resume las condiciones ambientales, los materiales y los pasos a lo largo del camino y destaca los aspectos críticos y los detalles experimentales. En conclusión, los RCCS son herramientas innovadoras para dominar el cultivo y el crecimiento 3D (tridimensional) de células in vitro y para permitir el estudio de sistemas celulares o interacciones no susceptibles a entornos de cultivo 2D clásicos.

Introduction

La gravedad afecta todos los aspectos de la vida en la Tierra, incluida la biología de las células individuales y su función dentro de los organismos. Las células detectan la gravedad a través de mecanorreceptores y responden a los cambios en la gravedad reconfigurando las arquitecturas citoesqueléticas y alterando la división celular ^1,2,3. Otros efectos de la microgravedad incluyen la presión hidrostática en vesículas llenas de fluido, la sedimentación de orgánulos y la convección impulsada por flotabilidad del flujo y el calor⁴. Los estudios sobre e....

Protocol

Se obtuvo toda la aprobación institucional necesaria para garantizar que el estudio cumpliera con las pautas institucionales de cuidado animal de TAMU.

1. Montaje y esterilización del biorreactor

1. Esterilice cuatro recipientes de alta relación de aspecto (HARV) para el biorreactor en un autoclave en el ciclo del instrumento de plástico durante 20 minutos a 121 °C según lo recomendado por el fabricante.
2. Después de la esterilización, ensamble los recipientes en una campana de cultivo celular apretando los tornillos provistos con el biorreactor, después de lo cual los recipientes están listos para usar.

Results

La cámara interior del biorreactor proporciona un entorno para que las células proliferen y se diferencien, se adhieran a un andamio o se congreguen para formar tejidos como ensamblajes. Cada vaso HARV contiene hasta 10 ml de medio y facilita una circulación constante de nutrientes para que cada célula tenga una excelente oportunidad de sobrevivir. La Figura 1A ilustra la fijación de los puertos de la jeringa a la placa frontal del recipiente donde se conectan las válvulas estériles de una s.......

Discussion

Los pasos críticos del protocolo para el crecimiento de células en microgravedad incluyen el biorreactor, el andamio, las células utilizadas para el cultivo 3D y el recubrimiento de andamio como medio para inducir la diferenciación celular. El tipo de biorreactor utilizado en nuestros estudios comprende el biorreactor RCCS-4, una modificación reciente del dispositivo de cultivo de tejido cilíndrico giratorio original del Sistema de Cultivo de Células Rotativas (RCCS) desarrollado por la NASA para cultivar células en micr.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibiótico-antimicótico	ThermoFisher Scientfic	15240096
Ácido ascórbico	Sigma Aldrich	A4544
BGJb Fitton-Jackson Medios de modificación	ThermoFisher Scientfic	12591
BIOST PGA andamio	Synthecon	Custom	Disponible de la empresa a través de un pedido personalizado
BMP-2	R& D Systems	355-BM
BMP-4	R& D Systems	314-BP
DMEM Media	Sigma Aldrich	D6429-500mL
FBS	ThermoFisher Scientfic 16140071
Fibricol	Advanced Biomatrix	5133-20mL
Fibronectina	Corning 354008
Galanina	Sigma Aldrich	G-0278
Disco de gelatina	Avanzado Biomatrix	CytoForm 500
Láminas de grafeno	Advanced Biomatrix	CytoForm 300
hEGF	Peprotech	AF-100-15
hFGF	ThermoFisher Scientfic	AA1-155
Disco de hidroxiapatita	Advanced Biomatrix	CytoForm 200
Il-6 proteína	PeproTech	200-06
Medios SFM de queratinocitos (1X)	ThermoFisher Scientfic	17005042
Laminina	Corning	354259
Péptido LRAP	Péptido 2.0	Secuencia personalizada: MPLPPHPGSPGYINLSYEVLT PLKWYQSMIRQPPLSPILPEL PLEAWPATDKTKREEVD
Matrigel	Corning	354234
Millipore Membrana de nitrocelulosa	Merck Millipore
RCCS Biorreactor	Synthecon	RCCS 4HD
SpongeCol	Advanced Biomatrix	5135-25EA
Válvula de jeringa llave de paso unidireccional con bloqueo Luer macho giratorio	Smiths Medical	MX5-61L
Jeringas con aguja 3cc	McKESSON	16-SN3C211
Tripsina EDTA (0.25%)	ThermoFisher Scientfic