Este protocolo demuestra un método novedoso para aplicar terapias génicas a subpoblaciones de células en ratas neonatas a edades postnatales de 5 a 10 días mediante la inyección de un modificador quimiogenético anterógrado en la corteza somatomotora y una recombinasa Cre retrógradamente transportable en la médula espinal cervical.
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Artículo de método
Apuntando al tracto corticoespinal en ratas neonatas con un vector viral doble utilizando cirugía combinada de cerebro y columna vertebral
En este artículo
Resumen
Resumen
Abordar con éxito los obstáculos que limitan la investigación en ratas neonatales es importante para estudiar las diferencias en los resultados observados en las lesiones pediátricas de la médula espinal (LME) en comparación con las LME adultas. Además, la introducción confiable de terapias en las células diana del sistema nervioso central (SNC) puede ser un desafío, y las imprecisiones pueden comprometer la eficacia del estudio o la terapia. Este protocolo combina la tecnología de vectores virales con una novedosa técnica quirúrgica para introducir con precisión terapias génicas en ratas neonatas en el día postnatal 5. Aquí, un virus diseñado para el transporte retrógrado (retroAAV2) de Cre se introduce en los terminales axónicos de las neuronas corticoespinales en la médula espinal, donde posteriormente se transporta a los cuerpos celulares. Luego se inyecta un receptor de diseño de orientación invertida (DIO) de doble floxed activado exclusivamente por el virus DREADD (DREADD) en la corteza somatomotora del cerebro. Esta técnica de doble infección promueve la expresión de los DREADDs solo en las neuronas coinfectadas del tracto corticoespinal (CST). Por lo tanto, la coinyección simultánea de la corteza somatomotora y los terminales CST cervicales es un método válido para estudiar la modulación quimiogenética de la recuperación siguiendo modelos de LME cervical en ratas neonatales.
Introducción
Si bien la LME es una ocurrencia relativamente rara en la población pediátrica, es particularmente traumática y causa una discapacidad permanente que requiere una inmensa previsión logística. Además, una mayor proporción de LME pediátricas se clasifica como cervical y completa en comparación con la población adulta 1,2. Un sello distintivo entre las especies de mamíferos es que los recién nacidos se recuperan notablemente mejor de la LME que los adultos, y esto ofrece una oportunidad para evaluar los mecanismos impulsores de la recuperación en poblaciones más jóvenes 3,4,5
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Protocolo
Todos los siguientes procedimientos quirúrgicos y de cuidado de animales han sido aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Temple. El protocolo descrito es una cirugía de supervivencia, y los animales fueron finalmente sacrificados por inyección intraperitoneal de 100 mg/kg de pentobarbital sódico al finalizar sus puntos temporales.
1. Preparación prequirúrgica
- Prepare al menos dos agujas de vidrio extraídas para la inyección viral con pipetas capilares de vidrio de 3,5 nL; una aguja para el DREADD y una aguja para el rCre. Como medida de precaución, prepare 4-5 agujas en caso de que se rompan intr....
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Resultados
La inyección y el transporte exitosos del vector viral deben resultar en la transducción de neuronas unilaterales en la médula espinal y la corteza motora. La Figura 4 demuestra el etiquetado de las neuronas CST de capa V en la corteza motora de una sección coronal cerebral que expresa Cre-dependiente-DREADDs-mCherry co-inyectado con una inyección contralateral de rCre en la columna vertebral. Las secciones fueron teñidas con el anticuerpo dsRed.
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Discusión
La modulación genética inducible de la actividad cerebral con modificadores quimiogenéticos inyectables es una herramienta poderosa para estudiar los diversos mecanismos que subyacen a la recuperación de la LME. La precisión de la orientación para los receptores inducibles acoplados a proteínas G (DREADDs) aumenta aún más cuando se considera que el rastreo de fluorescencia valida la precisión anatómica en histología. Este artículo discute un método confiable para explorar si la inhibición o estimulación de vías neuronale.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por una beca de los Hospitales Shriners para Niños SHC-84706.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| #11 hojas de bisturí | Roboz | RS-9801-11 | Para usar con el bisturí. |
| #10 Hojas de bisturí | Roboz | RS-9801-10 | Para usar con el bisturí. |
| Jeringas de 1 mL | Becton, Dickinson and Company 309659 | Para inyección anestésica SC y bolo líquido | |
| 4.0 sutura de seda | Ethicon | 771-683G | Para el cierre de la piel |
| 4.0 Sutura crómica de catgut | DemeTECH | NN374-16 | Para volver a unir el músculo durante el cierre. |
| 48000 Micropipeta Biseladora | World Precision Instruments | 32416 | Se utiliza para biselar las puntas de los tubos capilares de vidrio estirado para formar agujas de vidrio funcionales. |
| Solución de yodo al 5% Productos | Purdue L.P. | L01020-08 | Para uso en la esterilización del sitio quirúrgico. |
| 70% Etanol | N/A | N/A | Para la esterilización de agujas de vidrio recién preparadas, modelos animales durante la preparación quirúrgica |
| Ketamina (Ketaset) | Zoetis | 240048 | Para mantener al animal en el plano correcto de conciencia durante la cirugía. |
| Esterilizador de perlas | CellPoint | 5-1450 | Para esterilizar instrumental quirúrgico con calor. |
| Báscula digital | Okaus | REV.005 | Para pesar al animal durante la preparación quirúrgica. |
| Accesorio de aguja flexible | World Precision Instruments | MF34G-5 | Para limpiar agujas de vidrio y cargar aceite rojo en agujas de vidrio. |
| Tubos capilares de vidrio | World Precision Instruments | 4878 | Para agujas de vidrio estiradas: deben diseñarse para inyectores de nanolitros. |
| Hemostáticos | Roboz | RS-7231 | Para uso general en cirugía. |
| Pinza curva de punta media | Roboz | RS-5136 | Para uso general en cirugía. |
| Micromanipulador con escala Vernier Kanetec | N/A | Para una orientación precisa durante la cirugía. | |
| Microtijeras | Roboz | RS-5621 | Para cortar látigos de vidrio de tubos capilares de vidrio recién extraídos. |
| Instrumento estereotáxico estándar de laboratorio | Stoelting | 51600 | Para mantener el soporte esterotáxico neonatal en su lugar |
| Lab Standard con ratón & Adaptador para neonatos | 51615 | Para la fijación del cráneo neonatal durante la cirugía craneal y las inyecciones | |
| Microscopio con escala de luz y vernier Ocular | Leitz Wetzlar | N/A | Se utiliza para visualizar y medir el biselado de tubos capilares de vidrio estirados en agujas de vidrio funcionales. |
| Controlador de bomba de microjeringa | World Precision Instruments | 62403 | Para controlar la velocidad de inyección. |
| Nanolitro 2000 Inyector de cabeza de bomba | World Precision Instruments | 500150 | Para cargar e inyectar virus de forma controlada. |
| Extractor de agujas | Narishige | PC-100 | Para calentar y separar tubos capilares de vidrio para formar agujas de vidrio. |
| pAAV-CMV-scCre | Wu lab | Plásmido | |
| Cre pAAV-hSyn-DIO-hM3Dq-mCherry (plásmido #44361) | Bryan Roth' s laboratorio a través del | plásmido Addgene | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | Para ayudar con la carga del virus en el nanoinyector. |
| Agujas PrecisionGlide (25G x 5/8) | Becton, Dickinson and Company | 305122 | Para usar con las jeringas de 1 ml y 10 ml para permitir la inyección del modelo animal. |
| Pinza de dientes de rata | Roboz | RS-5152 | Para agarre de apófisis espinosas. |
| Aceite rojo | N/A | N/A | Para proporcionar un frente para la visualización del virus que ingresa al tejido durante la inyección. |
| Retractores | Roboz | RS-6510 | Para mantener abierta la herida quirúrgica. |
| Rongeurs | Roboz | RS-8300 | Para extraer músculo de la columna vertebral durante la cirugía. |
| Mango de hoja de bisturí | Roboz | RS-9843 | Para cortar la piel abierta y la almohadilla de grasa del modelo animal durante la cirugía. |
| Tijeras | Roboz | RS-5980 | Para uso general en cirugía. |
| Pinzas de extracción de grapas | Kent Scientific INS750347 | Para quitar las grapas, en caso de que se hayan aplicado incorrectamente. | |
| Tela estéril | Phenix Research Products | BP-989 | Para proporcionar una superficie estéril para la operación. |
| Aplicadores estériles con punta de algodón | Puritan | 806-WC | Para absorber la sangre en la herida quirúrgica manteniendo la esterilidad. |
| Gasa estéril | Covidien | 2146 | Para limpiar el área quirúrgica y las herramientas quirúrgicas manteniendo la esterilidad. |
| Solución salina estéril | Baxter Healthcare Corporation 281324 | Para usar en la limpieza de la sangre y para reemplazar líquidos después de la cirugía. | |
| Guantes quirúrgicos | N/A | N/A | Para uso del cirujano para mantener el campo estéril durante la cirugía. |
| Almohadilla térmica quirúrgica | N/A | N/A | Para mantener la temperatura corporal del modelo animal durante la cirugía. |
| Microscopio quirúrgico | N/A | N/A | Para una mejor visualización de la herida quirúrgica. |
| Grapadora quirúrgica | Kent Scientific | INS750546 | Para aplicar las grapas. |
| Almohadilla de calentamiento por convección de agua | Baxter Healthcare Corporation | L1K018 | Para uso en el área de recuperación postoperatoria para mantener la temperatura corporal del animal inconsciente. |
| Ganchos ponderados | N/A | N/A | Para mantener abierta la herida quirúrgica. |
| Vendaje líquido | NewSkin | 985838 | Para aplicar a lo largo de las suturas después de la cirugía y favorecer la cicatrización de heridas |
| Lámpara de jaula de alambre | ZooMed | LF10EC | Para ayudar a los animales a recuperarse de la anestesia y retener la temperatura corporal caliente de forma natural |
Referencias
- Parent, S., Mac-Thiong, J., Roy-Beaudry, M., Sosa, J. F., Labelle, H. Spinal cord injury in the pediatric population: A systematic review of the literature. Journal of Neurotrauma. 28 (8), 1515-1524 (2011).
- Vitale, M. G., Goss, J. M., Matsumoto, H., Roye, D. P.
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Reimpresiones y permisos
