La microscopía electrónica de barrido serial de cara de bloque (SBEM) se aplica para obtener imágenes y analizar espinas dendríticas en el hipocampo murino.
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Artículo de método
Microscopía electrónica de barrido serial de cara de bloque (SBEM) para el estudio de espinas dendríticas
En este artículo
Resumen
Resumen
La microscopía electrónica tridimensional (3D EM) da la posibilidad de analizar parámetros morfológicos de espinas dendríticas con resolución a nanoescala. Además, algunas características de las espinas dendríticas, como el volumen de la columna vertebral y la densidad postsináptica (PSD) (que representa la parte postsináptica de la sinapsis), la presencia de terminal presináptico y el retículo endoplásmico liso o la forma atípica de PSD (por ejemplo, espinas multiinervadas), se pueden observar solo con EM 3D. Mediante el empleo de la microscopía electrónica de barrido de cara de bloque serie (SBEM) es posible obtener datos EM 3D más fácilmente y de una manera más reproducible que cuando se realiza la sección en serie tradicional. Aquí mostramos cómo preparar muestras de hipocampo de ratón para el análisis de SBEM y cómo este protocolo se puede combinar con el estudio de inmunofluorescencia de espinas dendríticas. La perfusión de fijación leve nos permite realizar estudios de inmunofluorescencia con microscopía de luz en una mitad del cerebro, mientras que la otra mitad fue preparada para SBEM. Este enfoque reduce el número de animales que se utilizarán para el estudio.
Introducción
La mayoría de las sinapsis excitatorias en el sistema nervioso central se encuentran en las espinas dendríticas, pequeñas protuberancias de una membrana neuronal. Estas protuberancias forman compartimentos bioquímicos confinados que controlan la transducción de señales intracelulares. La plasticidad estructural de las espinas dendríticas y las sinapsis está estrechamente relacionada con los cambios funcionales en la eficacia sináptica que subyacen a procesos tan importantes como el aprendizaje y la memoria1,2. Es importante tener en cuenta que la microscopía electrónica (EM) es la única técnica que permite det....
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Protocolo
La investigación se realizó de conformidad con las directrices del Instituto Nencki y el permiso del Comité De Ética Local. Los estudios se llevaron a cabo de conformidad con la Directiva del Consejo de las Comunidades Europeas de 24 de noviembre de 1986 (86/609/CEE), Ley de Protección animal de Polonia y aprobados por el primer Comité de Ética Local en Varsovia. Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el número de animales utilizados y su sufrimiento.
PRECAUCIÓN: Todos los procedimientos descritos a continuación deben llevarse a cabo en una campana extractora de humos de laboratorio. Debido a la naturaleza peligrosa de los reactivos....
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Resultados
Utilizando el método descrito anteriormente de alto contraste, se pueden obtener imágenes de buena resolución del tejido cerebral del ratón. Un gran campo de visión proporcionado por la técnica SBEM facilita la selección precisa de la región de interés. La imagen grande de la región CA1 del hipocampo se tomó para medir la longitud del estrato radiatum (SR)(Figura 2A)y para establecer la imagen con precisión en el centro(Figura 2B). A continuación, se ad.......
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Discusión
Hay muchas variaciones del método NCMIR primario descrito por Deerinck en 201010. Los principios básicos siguen siendo los mismos pero, dependiendo del tipo de material estudiado, se implementan ligeros cambios. Anteriormente se describió que se pueden utilizar diferentes resinas para incrustar especímenes para SBEM y por ejemplo en el caso de las plantas, Spurr's es la resina de elección debido a su baja viscosidad que permite una mejor infiltración a través de las paredes celulares
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Las imágenes SBEM, las imágenes de microscopía de luz y la preparación de muestras de microscopía electrónica se realizaron con el uso del equipo del Laboratorio de Imágenes de Tejido y Función que sirve como una instalación central de imágenes en el Instituto Nencki de Biología Experimental.
Para la preparación de la Figura 1, se utilizó la imagen de un ratón (Souris_02) y un vial del https://smart.servier.com/.
Este trabajo fue apoyado por el Centro Nacional de Ciencias (Polonia) Grant Opus (UMO-2018/31/B/NZ4/01603) otorgado a KR.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Anestésico:Mezcla de | |||
| ketamina/xilacina (Ketamina/Sedazin) | Biowet Pulawy, Pulawy, Polonia | ||
| Pentobarbital sódico (Morbital) | Biowet Pulawy, Pulawy, Polonia | ||
| Fijadores: | |||
| Glutaraldehído (GA) | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, EE. UU | G5882 | Grado I, 25% en H2O, especialmente purificado para su uso como fijador de microscopía |
| electrónica Ácido clorhídrico (HCl) | POCH, Gliwice, Polonia | 575283115 | p.a. puro. |
| Paraformaldehído (PFA) | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, EE. UU | . 441244 | prilado, 95% |
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7.4 | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, EE. UU. | P4417-50TAB | tabletas |
| Hidróxido de sodio (NaOH) | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, EE. UU | S5881 | ,  98%, pellets ( anhidro) |
| Fosfato de sodio dibásico (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, EE.UU. | S3264 | |
| Fosfato de sodio monobásico (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, EE. UU. | S3139 | |
| Perfusión: | |||
| Grande romo/romo curvado tijeras (~14.5 cm) | Fine Science Tools, Foster City, CA, USA | 14519-14 | |
| Microespátula (extremos planos dobles de 2", uno redondeado, uno cónico a 1/8") | Fine Science Tools, Foster City, CA, EE. UU | . 10091-12 | |
| Punta de aguja, 15 GA, roma (aguja de perfusión) | KD Medical GmbH Productos hospitalarios, Berlín, Alemania | KD-FINE 900413 | 1,80 x 40 mm |
| Par de pinzas finas | (Graefe)Fine Science Tools, Foster City, CA, EE. UU | . 11050-10 | |
| Bomba de perfusión | Fluido de plomo | BQ80S | |
| Viales de plástico | Profilab, Varsovia, Polonia | 534.02 | Frascos de plástico con tapón azul para almacenamiento de tejidos, 20 ml, 31 x 48 mm |
| Tijeras de iris rectas (~9 cm) | Fine Science Tools, Foster City, CA, EE. UU | . 14058-11 | |
| Preparación de cortes de cerebro para EM: placa fuerte> | |||
| 12 pocillos | NEST, Rahway, NJ, EE. UU. | 712001 | |
| Pegamento cianoacrílico | Fenedur, Montevideo, Uruguay | ||
| Viales de vidrio | Electronic Microscopy Sciences, Hatfield, PA, EE. UU | 72632 | Frasco de centelleo de 20 ml, un paquete de 100 |
| pipetas Pasteur | VWR, Radnor, PA, EE. UU. | 612-4545 | LDPE, desechable, 7,5 ml |
| Hoja de afeitar | Wilkinson Sword, Londres, Reino Unido | Hojas de afeitar de seguridad clásicas de doble filo | |
| Hoja de bisturí | Swann-Morton, Sheffield, Reino Unido | Nº 20 | |
| Vibratome | Leica Microsystems, Viena, Austria | Leica VT1000 S | |
| Brain S: preparación para IF: | |||
| placa de 96 pocillos | NEST, Rahway, NJ, EE. UU. | 701101 | |
| Criostat | Leica Microsystems, Viena, Austria | Leica CM 1950 | |
| Ethylene glycol | Bioshop, Burlington, Canadá | ETH001 | |
| Cuchilla desechable de perfil bajo 819 | Leica Biosystems Inc., EE. UU | 14035838925 | |
| Hoja de bisturí | Swann-Morton, Sheffield, Reino Unido | Nº 20 | |
| Azida sódica (NaN3) | POCH, Gliwice, Polonia | 792770426 | |
| Sacarosa | POCH, Gliwice, Polonia | 772090110 | |
| Medio de congelación de tejidos para criosección, OCT-Compound | Leica Biosystems, Suiza | 14020108926 | |
| Immunostaining: | |||
| placa de 24 pocillos | NEST, Rahway, NJ, EE. UU | . 702001 | |
| Anticuerpo anti-proteína de densidad sináptica 95 | Merck-Millipore, Burlington, MA, EE. UU | . MAB1598 | |
| Microscopio confocal | Zeiss, Gö ttingen, Alemania | Microscopio de disco giratorio Zeiss (63 y veces; objetivo de aceite, NA 1.4, tamaño de píxel 0.13 y micro; m × 0,13 y micro; m) | |
| Corredera | de cubierta Menzel Glaser, Braunschweig, Alemania | B-1231 | 24 x 60 mm |
| Burro anti-ratón IgG (H+L) Anticuerpo secundario altamente adsorbido cruzado, Alexa Fluor 555 | Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU | A31570 | |
| Medio de montaje Fluoromount-G, con DAPI | Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU | 00-4959-52 | |
| Portaobjetos de microscopio | Thermo Scientific, Waltham, MA, EE. UU. | AGAA00008 | SuperFrost |
| Suero de burro normal (NDS) | Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, EE. UU. | 017-000-121 | |
| Shaker | JWElectronic, Varsovia, Polonia | KL-942 | |
| TritonT X-100 Reactivo Grade | Bioshop, Burlington, Canadá | TRX506 | |
| Preparación de muestras de microsopy electrónico | |||
| Hexacianoferrato de potasio (II) trihidrato | POCH, Gliwice, Polonia | 746980113 | |
| Aclar 33C | Film Electroscopy Sciences, Hatfield, PA, EE. UU | . 50425 | Hoja de inclusión de película de fluoropolímero |
| DMP-30, 2,4,6-Tris (dimetilaminometil)fenol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, EE. UU. | T58203 | Acelerador de medio de inclusión epoxi |
| Durcupan ACM monocomponente A, M | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | 44611 | Durcupan ACM monocomponente A, M resina epoxi |
| Durcupan ACM monocomponente B | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, EE.UU. | 44612 | Durcupan ACM monocomponente B, endurecedor 964 |
| Durcupan ACM monocomponente D | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, EE.UU. | 44614 | Durcupan ACM monocomponente D , plastificante |
| Alcohol etílico absoluto | POCH, Gliwice, Polonia | 64-17-5 | Alcohol etílico absoluto 99,8 % puro P.A.-BASIC |
| Horno de laboratorio Genlab | Wolflabs, York, Reino Unido | Mino/18/SS | Horno Genlab MINO/18/SS Volumen de 18l, sin circulación de ventilador, sin pantalla digital, gradiente de temperatura estándar, tasa de recuperación estándar, sin temporizador, 250 grados; C temperatura máxima, suministro eléctrico de 240 V |
| Ácido L-aspártico | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, EE. UU | A-9256 | grado de reactivo, 98% (HPLC) |
| Nitrato de plomo (II) | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | 467790 | 99.95% trazas de metales |
| base Tetróxido de osmio | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, EE. UU | . 75632 | para microscopía electrónica, 4% en H2 |
| O medidor de pH | Elmetron, Zabrze, Polonia | CP-5-5 | |
| Rotator | BioSan, Jó zefó w, Polonia | Rotor Multi Bio RS-24 | Multi Bio RS-24 |
| Hidróxido de sodio (NaOH) | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | S5881 | , 98%, pellets (anhidros) |
| Mini agitador de girasol | Grant bio, Shepreth,Reino Unido | PD-3D Filtro | |
| jeringa | Millipore, Burlington, MA, EE. UU. | SLGP033NB | 0,22 y micro; m tamaño de poro |
| Tiocarbohidrazida | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | 88535 | purum p.a., para microscopía electrónica, 99.0% (N) |
| Acetato de uranilo | Serva, Heidelberg, Alemania | 77870 | Acetato de uranilo· 2H2O, grado de investigación |
| Baño de agua | WSL, Swietochlowice, Polonia | LWT | |
| Montaje de muestras para placa de cultivo SBEM | |||
| 96-pocillos | VWR, Radnor, PA, EE. UU | . 734-2782 | Placas de 96 pocillos, fondo redondo, sin tratar |
| Pinzas de manipulación de muñones AM Gatan 3View | Micro to Nano, Haarlem, Países Bajos Países Bajos | 50-001521 | |
| Prismáticos | OPTA-TECH, Varsovia, Polonia | X2000 | |
| Pegamento conductor | Chemtronics, Georgia, EE. UU. | CW2400 | eopxy |
| conductor Gatan 3Ver talones de pin de muestra | Micro to Nano, Haarlem, Países Bajos Países Bajos | 10-006003 | |
| Parafilm | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, EE.UU | P7793 | tamaño del rollo 20 en. y tiempos; 50 |
| ft Pelco pintura plateada conductora | Ted Pella, Redding, CA, EE. UU | . 16062-15 | PELCO® Pintura de plata conductora, 15 g |
| Hojas de afeitar de doble filo Ciencias de | la Microscopía Electrónica, Hatfield, PA, EE. UU | . 72000 | Acero inoxidable recubierto de "PTFE". PERSONNA marca .004" de grosor, envuelto individualmente, 250 cuchillas en una caja. |
| Microscopio electrónico de barrido | Zeiss, Oberkochen, Alemania | Sigma VP con cámara Gatan 3View2, tensión de aceleración 2,5 kV, presión variable 5 Pa, apertura 20 y micro; m, tiempo de permanencia 6 µ s, grosor de corte 60 nm, aumento 15 000 x, resolución de imagen 2048 x 2048 píxeles, tamaño de píxel 7,3 nm | |
| recorte 90 ° cuchillo de diamante | Diatome Ltd., Nidau, Suiza | DTB90 | |
| Ultramicrótomo | Leica Microsystems, Viena, Austria | Tutoriales | |
| FijiJ | https://fiji.sc/ | ||
| Navegador de imágenes de microscopía | http://mib.helsinki.fi/ | http://mib.helsinki.fi/tutorials.html | |
| Reconstruir | https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0 | https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0) | |
| Animales | |||
| Ratones | Adulto de 3 meses de edad y 20± 1 mes de antigüedad hembra Ratones Thy1-GFP(M) (Thy1-GFP +/-) (Feng et al., 2000) que expresan GFP en una población escasamente distribuida de neuronas glutamatérgicas. Los animales fueron criados como heterocigotos con el fondo C57BL/6J en la Casa de Animales del Instituto Nencki de Biología Experimental. |
Referencias
- Bosch, M., Hayashi, Y. Structural plasticity dendritic spines. Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 383-388 (2012).
- Borczyk, M., Radwanska, K., Giese, K. P. The importance of ultrastructural analysis of memory. Brain Research Bulletin. 173, 28-36 (2021).
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