Artículo de método

Generación, mantenimiento y caracterización de organoides intestinales y colónicos derivados de células madre pluripotentes humanas

DOI:

10.3791/62721

⸱

9 de julio de 2021

 ,  ,  , 
1Department of Regenerative Medicine and Cell Biology, Medical University of South Carolina

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí, se describen métodos detallados para generar, mantener y caracterizar organoides de intestino delgado y colon derivados de células madre pluripotentes humanas. Estos métodos están diseñados para mejorar la reproducibilidad, ampliar la escalabilidad y disminuir el tiempo de trabajo necesario para el recubrimiento y el paso de organoides.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La especificación regional intestinal describe un proceso a través del cual se imparten morfología y función únicas a áreas definidas del tracto gastrointestinal (GI) en desarrollo. La especificación regional en el intestino está impulsada por múltiples vías de desarrollo, incluida la vía de la proteína morfogenética ósea (BMP). Sobre la base de la especificación regional normal, se desarrolló un método para generar organoides colónicos humanos (HCO) a partir de células madre pluripotentes humanas (hPSC), que incluyen células madre embrionarias humanas (hES) y células madre pluripotentes inducidas (iPSC). Una inducción de tres días de la señalización de BMP modela suficientemente los cultivos del tubo del intestino medio/posterior en HCOs especiales que expresan la proteína de unión a secuencia 2 rica en AT (SATB2) que contienen todos los principales tipos de células epiteliales presentes en el colon humano, así como células mesenquimales en codesarrollo. La omisión de BMP (o la adición del inhibidor de BMP NOGGIN) durante este período crítico de modelado dio lugar a la formación de organoides intestinales humanos (HIO). Las HIO y las HCO se parecen morfológica y molecularmente al intestino delgado y al colon en desarrollo humano, respectivamente. A pesar de la utilidad de las HIO y las HCO para estudiar el desarrollo intestinal humano, la generación de HIOs y HCOs es un reto. En este artículo se presentan métodos para generar, mantener y caracterizar HIOs y HCOs. Además, se proporcionan los pasos críticos del protocolo y las recomendaciones de solución de problemas.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El estudio del desarrollo del colon humano es difícil debido a las restricciones en el uso de tejido fetal humano. Los modelos animales han sido invaluables e históricamente utilizados para enfoques genéticos en ratones para estudiar el desarrollo intestinal. Sin embargo, las diferencias entre el desarrollo intestinal del ratón y el humano limitan la aplicabilidad de los ratones como sistema modelo. Por ejemplo, aunque la formación de criptas en el intestino delgado y el colon de los ratones ocurre después del nacimiento, los humanos nacen concriptas completamente formadas. Además, el intestino delgado y el colon humanos contienen tipos de células que no se encuentran en los ratones, incluidas las células enteroendocrinas que expresan motilina (MLN) en el intestino delgado2 y las células caliciformes que expresan mucina 5B (MUC5B) en el colon 3,4. Por esta razón, es importante contar con un sistema de cultivo celular que modele con precisión los eventos moleculares dinámicos que definen las primeras etapas del desarrollo del colon. Por lo tanto, dirigir las hPSC para generar células con características de colon proporciona un modelo poderoso para el estudio del desarrollo del colon humano.

Se han desarrollado protocolos para facilitar la formación reproducible5, sincrónica y eficiente de organoides similares al intestino6 y similares al colon7 a partir de hPSC. Estos protocolos utilizan un procedimiento de diferenciación escalonada que imita el desarrollo del intestino y el colon fetales (Figura 1). En primer lugar, se genera el endodermo definitivo a partir de células madre pluripotentes humanas mediante tratamiento con Activina A, un mimético ganglionar. La exposición del endodermo definitivo a altos niveles de WNT y factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) induce la morfogénesis en los esferoides del tubo del intestino medio/posterior CDX2+ . A continuación, los esferoides del intestino medio/intestino posterior se incrustan en la matriz extracelular (MEC) y se modelan en HIO o HCO mediante una manipulación transitoria de la señalización de BMP. La inhibición de la señalización de BMP mediante el uso de NOGGIN o la adición de medio de crecimiento solo da como resultado la formación de HIO, que se asemejan al intestino delgado proximal humano.

Al activar la señalización de BMP mediante BMP2, los esferoides del intestino medio/posterior se modelan en HCO, que conservan el patrón en el epitelio y el mesénquima7. Las HCO contienen células caliciformes enriquecidas en el colon que expresan MUC5B y son competentes para generar células enteroendocrinas específicas del colon que expresan insulina 5 (INSL5). El mesénquima aislado de las HCO expresa homeobox A13 (HOXA13) y HOXD13, que también se expresan en el mesénquima primario del colon humano8. Es importante recordar que el paso de patronaje se produce durante los días 7-10 del protocolo de diferenciación. Este período de tres días es suficiente para inducir un patrón colónico que se mantiene después de un cultivo in vitro prolongado.

Los protocolos que se describen a continuación son para investigadores que están familiarizados con el cultivo de hPSC sin alimentador. Para los investigadores que no están familiarizados con este tipo de cultivo de hPSC, se recomienda un curso de capacitación sobre hPSC como los que ofrece Stem Cell Technologies o el Pluripotent Stem Cell Facility (PSCF) en el Hospital Infantil de Cincinnati. La calidad de las hPSC de inicio es crítica y puede afectar a todos los pasos posteriores. El protocolo que sigue comenzaría con las hPSC que se han cultivado durante 4 días y están listas para dividirse.

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Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Generación de organoides intestinales y colónicos humanos

  1. Preparación de placas recubiertas de ECM
    1. Agregue 50 mL de medio DMEM frío en un tubo cónico de 50 mL.
    2. Retire una alícuota de 4 ECM con calificación hESC (consulte la tabla de materiales) del congelador a -80 °C y descongele con hielo.
      NOTA: Consulte el certificado de análisis del producto para determinar el volumen de ECM calificado por ESC requerido para preparar un stock 4x.
    3. Si el ECM calificado para hESC no se descongela completamente, tome 750 μL de DMEM del tubo cónico de 50 mL y mézclelo con el ECM.
    4. Transfiera la mezcla de ECM calificada por DMEM/hESC al tubo cónico de 50 mL con DMEM y mezcle bien. Agregue 0,5 mL por pocillo en cada una de las 4 placas de cultivo celular de 24 pocillos.
    5. Agite las placas para distribuir el ECM de manera uniforme por todo el pocillo y asegurarse de que toda la superficie esté cubierta. Con parafilm, selle las placas recubiertas de ECM y déjelas a temperatura ambiente en una cabina de bioseguridad durante al menos 1 h. Guarde las placas recubiertas de ECM a 4 °C durante un máximo de 2 semanas o hasta que las necesite.
  2. Recubrimiento de una sola celda de hPSC
    1. Coloque una placa de 24 pocillos recubierta de ECM dentro de un gabinete de bioseguridad durante 30 minutos para permitir que alcance la temperatura ambiente.
    2. Coloque el medio mTeSR1, la solución de desprendimiento de celdas y el DMEM avanzado dentro de un baño de agua a 37 °C y deje que se calienten durante 30 minutos.
    3. Verifique que las hPSC sean al menos un 85% confluentes con una diferenciación mínima. Retire las células diferenciadas si es necesario.
    4. Prepare el medio de siembra en un tubo cónico de 50 mL de la siguiente manera: 13 mL de mTeSR1 y 13 μL de 10 mM de inhibidor de la proteína quinasa asociada a Rho (ROCK).
      NOTA: Y-27632 inhibe la anoikis y aumenta la supervivencia de las células individuales.
    5. Para recolectar células de una placa de 6 pocillos, aspire el medio de 3 a 4 pocillos y lávese una vez con 2 mL de DMEM avanzado por pocillo.
    6. Aspire el DMEM avanzado y dispense 1 mL de la solución de disociación celular en cada pocillo. Incubar la placa durante 5-7 min dentro de una incubadora con 5% de CO2, a 37 °C. Verifique bajo el microscopio que las células estén en suspensión.
    7. Disocie los grupos restantes de células pipeteando hacia arriba y hacia abajo 4-5 veces con una pipeta de 5 ml.
    8. Agregue 2 mL de DMEM avanzado en cada pocillo, pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo 4-5 veces, y transfiéralo a un tubo cónico de 15 mL. Centrifugar las celdas a 300 × g durante 3 min a temperatura ambiente.
    9. Aspire el medio del tubo sin aspirar el pellet de celda y agregue 6 mL del medio preparado de mTeSR1 más inhibidor de ROCK. Vuelva a suspender suavemente las células pipeteando hacia arriba y hacia abajo 3-4 veces y luego transfiera la suspensión al resto del medio inhibidor de mTeSR1/ROCK dentro del tubo de 50 mL. Vuelva a suspender vigorosamente 4-5 veces y cuente las células con un hematitómetro.
    10. Aspire el ECM de la placa de 24 pocillos justo antes de colocar las celdas. Vuelva a suspender las células pipeteando hacia arriba y hacia abajo 2-3 veces y dispense 0,5 ml de la suspensión celular en cada pocillo.
      NOTA: La densidad óptima de recubrimiento debe ser determinada por el experimentador. Aquí, el número óptimo de células es de 80.000 a 200.000 células por pocillo.
    11. Mueva suavemente la placa 3 veces en el sentido de las agujas del reloj, 3 veces en el sentido contrario a las agujas del reloj, 3 veces hacia adelante y hacia atrás, y 3 veces de lado a lado para dispersar uniformemente las células.
    12. Transfiera la placa a una incubadora a 37 °C, 5% de CO2 e incube durante 24 h.
      NOTA: No altere la placa durante las primeras horas para asegurar la dispersión adecuada de las células dentro de los pocillos.
    13. Después de 24 h (Figura 2A), aspirar el medio gastado, añadir 0,5 mL por pocillo de mTeSR1, incubar de nuevo a 37 °C, 5% de CO2 durante 24 h (Figura 2B) y luego continuar con el siguiente paso.
  3. Diferenciación del endodermo definitivo (DE) de las hPSCs
    1. En un tubo cónico de 15 mL, agregue 13 mL de medio Activin Day 1 (consulte la Tabla de materiales), 13 μL de 100 μg/mL de Activina A y 1,95 μL de BMP4 de 100 μg/mL. Calentar el medio en un baño de agua a 37 °C.
    2. Aspire el medio mTeSR1 de la placa de 24 pocillos y agregue 0,5 mL de medio Activin Día 1 por pocillo. Coloque la placa en una incubadora a 37 °C, 5% de CO2 e incube durante 24 h. Revise las celdas después de 24 h.
      NOTA: La muerte celular extensa debe ser evidente, como se muestra en la Figura 2C. Aunque la monocapa parecerá escasa, las colonias de células se habrán expandido.
    3. Prepare el medio completo Activin Day 2 añadiendo 12,5 μL de 100 μg/mL de Activina A en 12,5 mL de medio Activin Day 2 en un tubo cónico de 15 mL. Coloque el tubo en un baño de agua a 37 °C.
    4. Extraiga la placa de diferenciación de 24 pocillos de la incubadora deCO2 y retire el medio gastado. Dispensar 0,5 mL de medio Activin Day 2 precalentado por pocillo y volver a colocar la placa dentro de la incubadora deCO2 durante 24 h.
      NOTA: Se debe tener cuidado al dispensar el medio. No dispense el medio directamente en el centro del pocillo, ya que esto separará las células de la monocapa. Dispense con cuidado el medio por el costado del pozo. Al día siguiente, se forma una monocapa de células con una muerte celular insignificante. Las celdas ahora deberían ser ~90 a 95% confluentes (Figura 2D).
    5. Prepare el medio completo Activin Day 3 añadiendo 12,5 μL de 100 μg/mL de Activina A en 12,5 mL de medio Activin Day 3 en un tubo cónico de 15 mL. Coloque el tubo en un baño de agua a 37 °C.
    6. Retire el medio gastado y dispense 0,5 mL de medio Activin Día 3 por pocillo.
      NOTA: Se debe tener cuidado al dispensar el medio. No dispense el medio directamente en el centro del pocillo, ya que esto separará las células de la monocapa. Dispense con cuidado el medio por el costado del pozo. Al día siguiente, la monocapa debería alcanzar la confluencia completa con poca o ninguna muerte celular en esta etapa. No intente generar esferoides del intestino medio posterior si la monocapa no es confluente 24 h después de agregar el medio Activin Día 3. Consulte la Figura 2E para conocer la morfología ideal de la monocapa de DE antes de proceder a la generación de esferoides del intestino posterior medio.
    7. Realice la tinción de inmunofluorescencia (IF) de la monocapa para la expresión de la proteína A2 de la caja de horquilla (FOXA2) y el factor de transcripción 17 (SOX17) de la región Y determinante del sexo (SRY) al optimizar la diferenciación de DE.
  4. Diferenciación de la DE en esferoides del intestino medio posterior
    1. En un tubo cónico de 50 mL, añadir 25 mL de medio de inducción del intestino medio posterior con FGF4 (sin CHIR99021) y colocarlo en un baño de agua a 37 °C durante 30 min.
    2. Para preparar el medio de inducción completo del intestino medio posterior, agregue 7,5 μL de CHIR99021 después de que el medio esté tibio.
    3. Retirar el medio gastado, dispensar 0,5 mL de medio de inducción del intestino medio posterior por pocillo e incubar a 37 °C, 5% de CO2 durante 24 h.
    4. Después de que se haya producido la condensación de las células dentro de la monocapa al día siguiente (Figura 3A), reemplace el medio gastado con medio de inducción fresco del intestino medio posterior y vuelva a colocar la placa en una incubadora de CO2 al 5% a 37 °C durante 24 h.
      NOTA: Las estructuras tubulares se notarán después de 48 h de inducción del intestino medio posterior, como se muestra en la Figura 3B. Los esferoides del intestino medio posterior comenzarán a brotar fuera de la monocapa el día 3, como se muestra en la Figura 3C.
    5. Para evitar desechar los esferoides flotantes mientras cambia el medio, transfiera el medio viejo a un tubo de 15 ml y centrifugue a 300 × g durante 1 min. Vuelva a suspender los esferoides en 12,5 mL de medio de inducción fresco del intestino medio retroactivo, agregue 0,5 mL por pocillo en la misma placa de 24 pocillos e incube a 37 °C, 5% de CO2 durante 24 h.
    6. En el día 4 de la inducción del intestino posterior (Figura 3D), recoja los esferoides flotantes de los pocillos de la placa recogiendo el medio en un tubo de 15 mL seguido de una centrifugación a 300 × g durante 1 min. Continúe con el siguiente paso para incrustar esferoides del intestino medio posterior en ECM.
  5. Recubrimiento y modelado de esferoides del intestino medio/posterior en ECM
    1. Descongele la matriz de membrana basal ECM a 4 °C durante la noche antes de la incrustación.
      NOTA: Este ECM es diferente del ECM calificado por hESC. El ECM debe ponerse en hielo, y el volumen apropiado de ECM se puede alícuota en tubos de microcentrífuga preenfriados de 1,5 mL sobre hielo. La tabla 1 contiene información sobre el volumen de ECM. Asegúrese de que el volumen de ECM sea de al menos el 75% en la gota en la que se incrustarán los esferoides.
    2. Calentar una placa de 24 pocillos en una incubadora a 37 °C.
    3. Recoja los esferoides flotantes de los 24 pocillos con una pipeta de 1000 μL y transfiéralos a un tubo cónico de 15 mL. Centrifugar los esferoides a 300 × g durante 1 min a temperatura ambiente. Aspire la mayor parte del medio, pero deje el volumen requerido para el recubrimiento (Tabla 1).
    4. Prepare las puntas de pipeta de 1000 μL y 200 μL cortando sus extremos. Saque la placa precalentada de 24 pocillos.
    5. Mezcle los esferoides flotantes, transfiera el volumen adecuado al tubo de ECM colocado en hielo y, a continuación, vuelva a suspender los esferoides y la ECM pipeteándolos para mezclarlos bien.
    6. Tome 65 μL de la mezcla de esferoides y ECM con las puntas de pipeta cortadas de 200 μL y cárguelas hasta el centro de cada pocillo en la placa de 24 pocillos. Para asegurarse de que se forma una buena gota de ECM, levante la pipeta suave y lentamente mientras se dispensa la mezcla.
      NOTA: Placa de 30 a 100 esferoides por pocillo.
    7. Transfiera suavemente la placa a una incubadora de 37 °C, 5% de CO2 e incube durante 5 min.
    8. Dale la vuelta a la placa e incuba durante 15-25 minutos, lo que ayudará a que las gotas del ECM mantengan una estructura similar a una cúpula.
    9. Durante la incubación, prepare el medio requerido y caliéntelo. Una vez que el ECM esté solidificado, agregue 0,5 mL de medio de patrón IO o HCO en cada pocillo e incube a 37 °C, 5% de CO2. Consulte la Figura 3E para obtener una imagen de los esferoides en ECM.
    10. Cultive los esferoides en el medio de modelado durante 3 días.
    11. Después de 3 días, cambie el medio de patrón OHIO o HCO a un medio de crecimiento normal e incube a 37 °C, 5% de CO2.
      NOTA: Los organoides en este punto de tiempo (Día 10) son organoides en etapa temprana. Sobre la base del objetivo del proyecto, algunos organoides en fase temprana pueden utilizarse para el análisis de patrones tempranos, como se detalla en la sección 2.
  6. Excrecencia y paso de organoides intestinales y colónicos humanos
    1. Después del día 10, cambie el medio de crecimiento cada 3 días.
      NOTA: Dependiendo de la densidad de recubrimiento y el crecimiento de los organoides, es posible que se requieran cambios de medio más frecuentes. Los cambios en el medio deben realizarse antes de que el rojo fenol (indicador de pH) en el medio se vuelva amarillo.
    2. Incubar los organoides hasta el día 21 (Figura 3F).
      NOTA: El tratamiento con BMP2 dará como resultado un número reducido de organoides (~ 3 veces menos que los HIO) que crecen a partir de esferoides. Por lo tanto, es necesario revestir un mayor número de esferoides para la generación de HCO.
  7. División de organoides el día 21
    1. Inspecciona los organoides.
      NOTA: Los organoides deben dividirse en el día 21, ya que la MEC está casi degradada en el día 21 debido al crecimiento y la expansión de los organoides.
    2. Prepare las puntas de pipeta de 1000 μL y 200 μL cortando sus extremos.
    3. Calentar una placa Nunc de 24 pocillos en una incubadora a 37 °C.
    4. Alícuota el volumen apropiado de ECM en los tubos preenfriados de 1,5 mL (Tabla 1).
    5. Raspe suavemente la gota de ECM con los organoides con una punta de pipeta de 1000 μL y pipetee la mezcla hacia arriba y hacia abajo varias veces para romper la ECM.
    6. Transfiera la mezcla a una placa de Petri de 60 mm y verifique los organoides bajo un microscopio. Si es necesario, separe los organoides entre sí con pinzas estériles. Asegúrese de que la separación no dañe el epitelio de los organoides.
    7. Transfiera los organoides a un tubo cónico de 15 ml y centrifugue a 300 × g durante 30 s. Aspire el sobrenadante y deje ~1 mL de medio en el tubo.
      NOTA: El volumen del medio se puede cambiar según el propósito del experimento. Si se requieren más organoides por gota de ECM, se puede disminuir el volumen del medio. Sin embargo, si se requieren menos organoides, se puede aumentar el volumen medio.
    8. Mezcle bien los organoides, transfiera el volumen adecuado al tubo de MEC colocado en hielo y, a continuación, vuelva a suspender los organoides y la MEC pipeteándolos para mezclarlos bien.
    9. Añada 65 μL de la mezcla de esferoides y ECM en el centro de cada pocillo de la placa de 24 pocillos utilizando las puntas de pipeta cortadas de 200 μL.
      NOTA: Es fundamental tomar primero los organoides y luego la MEC durante el pipeteo. Por lo tanto, mientras se dispensa la mezcla, los organoides se encuentran en la parte superior de la gota de ECM.
    10. Coloque la placa en una incubadora a 37 °C, 5% de CO2 durante 5 min.
    11. Voltee la placa boca abajo durante otros 15-25 minutos para ayudar a que las gotas de ECM mantengan una estructura similar a una cúpula.
    12. Añadir 0,5 mL de medio de excrecencia HIO/HCO en cada pocillo e incubar a 37 °C, 5% de CO2.
      NOTA: El medio de crecimiento es el mismo para las OHIO y las HCO después del patrón.
    13. Cambie el medio cada 2-3 días hasta el día 35 (Figura 3G).

2. Verificación del patrón de organoides mediante reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa con transcripción inversa (RT-qPCR)

  1. Antes de recolectar ARN, prepare 1x tampón de lisis de ARN siguiendo las instrucciones del fabricante.
  2. Deseche el medio gastado y agregue 350 μL de tampón de lisis a cada pocillo de la placa de 24 pocillos. Lisear los organoides pipeteando hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de 1 mL. Para una mejor lisis, vórtice brevemente a velocidad máxima durante 5 s.
  3. Mantenga todas las muestras a -80 °C hasta que estén listas para la extracción de ARN. Una vez listas, retire las muestras de ARN del congelador a -80 °C y descongélelas en hielo durante 10 minutos. Agite los tubos vigorosamente a temperatura ambiente durante 10-15 minutos para asegurar la lisis completa de las muestras.
  4. Vuelva a colocar las muestras en hielo y proceda a la extracción del ARN según las instrucciones del fabricante. Transfiera las muestras de ARN a un congelador a -80 °C si no está listo para continuar con el siguiente paso.
  5. Realice la extracción de ARN, el tratamiento con ADNasa, la síntesis de ADNc y la RT-qPCR utilizando una metodología estándar. Consulte la Tabla 2 para obtener una lista de nombres y secuencias de cebadores.

3. Verificación del patrón de organoides por inmunofluorescencia

  1. Recolección y fijación de organoides
    1. Aspire el medio HIO o HCO de los pocillos apropiados y agregue 1 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) helada a cada pocillo. Disocie los organoides del ECM con una punta de pipeta cortada de 200 μL. Pipetea hacia arriba y hacia abajo para disociar grandes trozos de ECM de los organoides.
    2. Transfiera los organoides a un tubo cónico de 15 mL y llene el resto del tubo con PBS helado y mezcle suavemente invirtiendo el tubo. Permita que los organoides se asienten por gravedad y aspiren el PBS.
      NOTA: Si los organoides no se sedimentan por gravedad, centrifugar a 300 × g durante 1 min.
    3. Aspire el PBS y agregue 1 mL de solución helada que degrada la ECM. Mantenga el tubo en hielo durante 10-15 minutos en una plataforma giratoria con una suave agitación.
      NOTA: Incline el tubo en un ángulo de 45° para permitir la mezcla adecuada de los organoides y la solución de recuperación celular. Después de 10-15 minutos, los organoides deben depositarse en el fondo del tubo, lo que indica la digestión completa de la MEC.
    4. Agregue PBS frío en el tubo hasta 15 mL; Mezcle bien invirtiendo el tubo varias veces. Cuando los organoides se depositen en el fondo del tubo, aspire el PBS y agregue 1 mL de paraformaldehído preenfriado al 4% para fijar los organoides. Incubar los organoides con paraformaldehído al 4% en hielo durante 1 h.
    5. Llene el resto del tubo con PBS helado y colóquelo horizontalmente sobre una plataforma oscilante a 4 °C durante la noche. Al día siguiente, deseche el paraformaldehído/PBS en el contenedor de residuos especificado y lávese una vez con 15 ml de PBS helado, como se describe en el paso 3.1.2.
    6. Aspire el PBS y llene el tubo con un 30% de sacarosa en PBS. Coloque el tubo horizontalmente sobre una plataforma oscilante a 4 °C durante la noche.
    7. Al día siguiente, incruste los organoides en un modelo base de 7 mm x 7 mm x 5 mm con medio OCT y congelación instantánea utilizando un baño de hielo seco / etanol.
    8. Seque los bloques con toallitas de laboratorio, envuélvalos en una toalla de papel y manténgalos en un congelador a -80 °C durante la noche. Al día siguiente, corte secciones de 5 μm en portaobjetos de microscopio con un criostato. Guarde los portaobjetos a -80 °C.
  2. Tinción por inmunofluorescencia de los organoides
    1. Procese los portaobjetos del congelador a -80 °C y realice la tinción de FI utilizando protocolos estándar.
    2. Aplique cubreobjetos a los portaobjetos y séquelos a temperatura ambiente, protegidos de la luz durante al menos 2 horas o toda la noche antes de tomar imágenes.
    3. Tome imágenes de los portaobjetos utilizando un objetivo de 25x de un microscopio confocal.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La generación exitosa de esferoides durante la etapa de inducción del intestino medio/posterior es indicativa de un patrón exitoso. Realice la tinción de FI para CDX2 en esferoides flotantes y en la monocapa para confirmar que el patrón es correcto. Aunque la tinción en la etapa definitiva del endodermo (DE) puede indicar la eficacia de la inducción de DE, la generación de esferoides no es posible sin una inducción eficiente de DE. Para probar la eficiencia de la inducción de DE, realice la tinción de FI y/o RT-qPCR para...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La diferenciación de las hPSC en HIO y HCO es un proceso complejo que requiere controles de calidad en cada paso. Las hPSC iniciales deben tener una diferenciación mínima antes de iniciar la diferenciación en DE. La optimización de la densidad de hPSCs plateadas para la diferenciación de DE es fundamental para el éxito del protocolo. Para garantizar la calidad de la diferenciación de DE, realice IF para FOXA2 y SOX17 para determinar la eficiencia de la diferenciación de DE. La diferencia...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El laboratorio de Múnera está financiado por el Centro de Investigación de Disparidades del Cáncer de Carolina del Sur (SC CADRE) NIH/NCI 5U54CA210962-02, el Centro Central de Investigación de Enfermedades Digestivas y Hepáticas P20 GM130457 DK123704-01 MUSC de los NIH/NIDDK.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Solución de albúmina sérica bovina (BSA) al 1%N/AN/AN/A
Tubo Corning de 15 mlHalcón21008-918N/A
30% SacarosaN/AN/AHecho en PBS.
5% Suero de burro normalLaboratorio de investigación inmunológica de Jackson017-000-121N/A
Tubo Corning de 50 mlHalcón21008-951N/A
AccutasaThermo ScientificA1110501Solución de desprendimiento celular; alícuota 5 ml de Accutasa en tubos de 10 ml con un total de 20 tubos y almacenar a -20 ° C hasta por 6 meses. Colocar a 4 ° C C durante la noche antes de usar.
Activina ASistemas de guiado celularGFH6-100x10Reconstituir el polvo liofilizado a 100 µ g/ml en PBS estéril que contiene 0,1% de albúmina sérica bovina (BSA). Alícuota 38 µ L de Activina A en tubos de microcentrífuga preenfriados y almacenar a -80 ° C (Los tubos caducan a los 12 meses de la fecha de recepción).
Activina día 1 medio (RPMI 1640)CorningMT10041CVUse aminoácidos no esenciales (NEAA, Corning 11140050) y almacene a 4 °C. Medio básico del día 1: 500 ml de RPMI 1640 y 500 ml de NEAA. Cuando prepare Activin día 1 medio, agregue 13 ml de medio básico día 1, 13 µ l de Activina A (100 µ g/mL), y 2 µ l de BMP4 (100 µ g/ml). El medio base es estable hasta por 3 semanas, pero debe usarse inmediatamente después de la adición de factores de crecimiento.
Activina día 2 medio (RPMI 1640, 0,2% FBS vol/vol)HycloneSH30070.03DUse aminoácidos no esenciales (Corning 11140050) y guárdelos a 4 °C. Medio básico del día 2: 500 ml de RPMI 1640, 500 ml de NEAA y 1 ml de suero al 0,2%. Al preparar Activin Day 2 medium, agregue 12.5 mL de basic day 2 medium y 12.5 µ L de Activina A (100 µ g/ml). El medio base es estable hasta por 3 semanas, pero debe usarse inmediatamente después de la adición de factores de crecimiento.
Activina día 3 medio (RPMI 1640, 2% FBS vol/vol)HycloneSH30070.03DUse aminoácidos no esenciales (Corning 11140050) y guárdelos a 4 °C. Medio básico del día 3: 500 ml de RPMI 1640, 500 ml de NEAA y 10 ml de suero al 2%. Cuando prepare Activin día 3 medio, agregue 12,5 ml de día básico 3 y 12,5 µ L de Activina A (100 µ g/ml). El medio base es estable hasta por 3 semanas, pero debe usarse inmediatamente después de la adición de factores de crecimiento.
Alexa Fluor 488 Burro anti-CabraThermo ScientificReferencia A11055Dilución 1:500 (anticuerpo secundario)
Alexa Fluor 488 Donkey anti-ConejoThermo ScientificReferencia A21206Dilución 1:500 (anticuerpo secundario)
Alexa Fluor 546 Donkey anti-RatónThermo ScientificA10036Dilución 1:500 (anticuerpo secundario)
Alexa Fluor 647 Donkey anti-RatónThermo ScientificReferencia A31571Dilución 1:500 (anticuerpo secundario)
Molde basePescador22-363-552N/A
Medio intestinal básico (DMEM avanzado)Gibco12491015  Al preparar el medio intestinal básico, agregue 500 ml de DMEM, 500 ml de N2 (Gibco 17-502-048), 500 ml de B27 (Gibco), 500 ml de L-glutamina para obtener 2 ml de L-glutamina (Corning A2916801), 5 ml de 100 U/ml de penicilina-estreptomicina (Gibco 15-140-122) y 7,5 ml de L  1 M HEPES para obtener 15 mM HEPES. El medio base es estable hasta por 3 semanas, pero debe usarse inmediatamente después de la adición de factores de crecimiento.
Sistema de detección de PCR en tiempo real Biorad CFX96 TouchBioradN/ASe pueden utilizar otros sistemas qRT-PCR.
Solución de recuperación celularCorning354253Solución degradante de ECM
CHIR99021Reprocell4000410Reconstituya agregando 2,15 ml de DMSO a 10 mM. Preparar 50 µ L alícuotas y almacenar a -20 °C. Almacene el polvo a 4 ° C; C, protegido de la luz.
CTRL HIO medio de patrónN/AN/AMedio intestinal básico y 100 ng/mL EGF.
DAPISigma-AldrichD9542Dilución 1:100 (anticuerpo secundario)
Monocapa DEN/AN/ALa monocapa se generó en pasos anteriores (Sección 4.4).
DispaseGibco17105041Vuelva a suspender el polvo liofilizado en DMEM avanzado (Gibco MT15090CV) a una concentración final de 1 mg / ml. Filtre la solución para la esterilización aspirando con un tubo de esterilización con filtro Millipore. Hacer 10 mL de alícuotas (1 mg/mL) y almacenar a -20 ° C hasta por 6 meses. Colocar a 4 ° C C durante la noche antes de usar.
FEAGThermo Scientific236-EG-01MAl preparar 100 ng/mL EGF reconstituir 500 µ g/ml en PBS estéril. A continuación, agregue 2 ml de PBS estéril a 1 mg de EGF y haga 500 µ g/ml de solución de EGF. Alícuota 100 µ L de EGF en 20 tubos.
Fisherbrand Placas Petri de 6 cm con tapa transparentePescadorFB0875713AN/A
Elevador de celda FisherbrandPescador08-100-240N/A
Fisherbrand Viales roscados de vidrio transparente clase B con cierres adjuntosPescador03-338BN/A
Pipeta de Pasteur de Vidrio de Borosilicato Desechable FisherbrandPescador13-678-2D0N/A
Medio de montaje deslizante Fluoromount GVWR100241-874N/A
DMEM avanzado de GibcoGibco12-491-023N/A
Cabra anti-E-CadherinaR& Sistemas DAF648Dilución 1:400 (anticuerpo primario)
Cabra anti-SOX17R& Sistemas DAF1924Dilución 1:500 (anticuerpo primario)
Medio de patrón HCON/AN/AMedio intestinal básico, 100 ng/mL EGF y 100 ng/mL BMP2. Al preparar BMP2, agregue 1 ml de BSA estéril de 4 mM HCl al 0,1% a los viales de BMP2 (100 µ g). Alícuota 25 µ L de solución de BMP4 en 4 tubos. El medio base es estable hasta por 3 semanas, pero debe usarse inmediatamente después de la adición de factores de crecimiento.
HemocitómetroSigma-AldrichZ359629N/A
Células madre pluripotentes humanas (hPSC)Instalación de células madre pluripotentesN/ACélulas sembradas en una placa de 24 pocillos recubierta de Matrigel (Thermo Scientific 73520-906).
Solución helada de paraformaldehído al 4% (PFA)N/AN/AN/A
Solución salina tamponada con fosfato helada (PBS)N/AN/AEl pH debe ser de 7,4.
Lápiz de barrera hidrofóbica ImmEdgeLaboratorios Vector101098-065N/A
Células madre pluripotentes inducidas (iPSC)Centro de células madre pluripotentes (Centro Médico del Hospital Infantil de Cincinnati)N/ASe pueden usar otras líneas hESC o iPSC, pero el protocolo debe optimizarse para cada línea celular.
Micrótomo de LeicaN/AN/AN/A
LSM 880microscopio confocal
Matriz de membrana basal MatrigelCorning354234N/A
Matriz calificada por Matrigel hESCCorning354277Prepare 4 alícuotas de Matrigel que correspondan a volúmenes suficientes para hacer suficiente Matrigel diluido para 4 platos de 6 pocillos.
Medio de inducción del intestino posterior medio (RPMI 1640)CorningMT10041CVAminoácidos no esenciales (Corning 11140050), 2% FBS vol/vol (Hyclone SH30070.03T), 3 µ M CHIR99021 y 500 ng/mL FGF4. El medio base es estable hasta por 3 semanas, pero debe usarse inmediatamente después de la adición de factores de crecimiento.
Esferoides del intestino posterior medioN/AN/AN/A
Unidades de filtro de vacío desechables estériles MilliporeSigma SteriflipMilliporeSigmaSCGP00525N/A
Ratón anti-CDX2BioGenexMU392-UCDilución 1:300 (anticuerpo primario)
Ratón anti-FOXA2Abnova/NovusH00003170-M01Dilución 1:500
Medio de crecimiento completo mTeSR1Tecnologías de células madre85870Agregue 100 ml de suplemento de mTeSR (85870) en un medio mTeSR de 400 ml (85870) y alícuotas en tubos de 50 ml para evitar la contaminación. Almacenar a 4° C hasta su uso.
Solución transparente de Murray (también conocida como BABB)Murray'sN/ABenzoato de bencilo 1:2 y alcohol bencílico.
Medio de patrón NOG HION/AN/AMedio intestinal básico, 100 ng/mL EGF y 100 ng/mL NOGGIN (Dispense 25 µ g de NOGGIN en 250 µ l PBS estéril con BSA al 0,1%).
ARN de NucleoSpinTakara740955.25Se pueden usar otros kits de aislamiento de ARN.
Placa de cultivo de tejidos de superficie delta Nunclon de 24 pocillos (Nunc)Thermo Scientific73521-004N/A
Placa de cultivo de tejidos de superficie Nunclon delta de 24 pocillos recubierta con MatrigelThermo Scientific73521-004N/A
Placa de cultivo de tejidos de superficie delta Nunclon de 6 pocillos (Nunc)Thermo Scientific73520-906N/A
Placa de cultivo de tejidos de superficie delta Nunclon de 6 pocillos recubierta con  Matrigel.Thermo Scientific73520-906N/A
Medio de crecimiento para HIO, CTRL HIO y HCON/AN/AMedio intestinal básico y 100 ng/mL EGF (concentración final)
Solución salina de tampón de fosfato, 0,5 % Tritón X (PBS-T)N/AN/AN/A
ImprimacionesTecnologías integradas de ADN, Inc. (IDT)N/ALos cebadores se enumeran en la Tabla 2 del protocolo.
Conejo anti-CDX2Marca de celdaEPR22764YDilución 1:100 (anticuerpo primario)
Conejo anti-SATB2Marca de celdaEP281Dilución 1:100 (anticuerpo primario)
Proteína BMP-4 humana recombinanteR& Sistemas D314-BP-010Reconstituir el polvo liofilizado a 100 µ g/ml en HCl estéril 4 mM que contiene 0,1% de albúmina sérica bovina (BSA). Agregue 4,17 ml de solución de HCl a 45,83 ml de agua molecular para un total de 50 ml de 1 M de HCl. Luego agregue 200 µ L de 1 M de HCl a 49,8 mL de agua de grado molecular por un total de 50 mL de 4 mM de HCl. A continuación, agregue 0,05 g de BSA a 50 ml de HCl 4 mM y filtre para que quede estéril. Alícuotas estériles 4 mM HCl 0,1% BSA a 33 tubos de microcentrífuga totalizando y almacenando a -20 °C. Añadir 100 °C; l de BSA estéril 4 mM HCl 0,1% a los viales BMP4 (10 µ g) para hacer solución BMP4 a 100 µ g/ml.
Proteína FGF-4 humana recombinanteR& Sistemas D235-F4-01MReconstituir a 100 µ g/ml en PBS estéril que contiene albúmina sérica bovina al 0,1%. Agregue 0,05 g de BSA en 50 ml de PBS para hacer un 0,1% de BSA. Filtro 0.22 µ M BSA para esterilizar el BSA. Alícuota 10 mL de BSA al 0,1% en 5 tubos. Agregue 1 mg de FGF-4 en 10 ml de BSA estéril al 0,1%. Alícuota 250 µ L en tubos de microcentrífuga 40 preenfriados y almacenar a -80 °C.
Inhibidor de ROCK Y-27632Tocris1254La concentración final es de 10 mM (10 mmol/L). Volver a suspender en DMSO a 10 mM y esterilizar con filtro. Agregue 3 ml de PBS estéril a cada vial. Aliqout 100 µ L de inhibidor de ROCK en 30 tubos y almacenar a -20 °C.
Kit de síntesis de ADNc SuperScript VILOThermo Scientific11-754-250N/A
Portaobjetos de microscopio SuperFrost Plus
Compuesto Tissue Tek O.C.TVWR25608-930N/A

Referencias

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