Generación, mantenimiento y caracterización de organoides intestinales y colónicos derivados de células madre pluripotentes humanas

Summary

Aquí, se describen métodos detallados para generar, mantener y caracterizar organoides de intestino delgado y colon derivados de células madre pluripotentes humanas. Estos métodos están diseñados para mejorar la reproducibilidad, ampliar la escalabilidad y disminuir el tiempo de trabajo necesario para el recubrimiento y el paso de organoides.

Abstract

La especificación regional intestinal describe un proceso a través del cual se imparten morfología y función únicas a áreas definidas del tracto gastrointestinal (GI) en desarrollo. La especificación regional en el intestino está impulsada por múltiples vías de desarrollo, incluida la vía de la proteína morfogenética ósea (BMP). Sobre la base de la especificación regional normal, se desarrolló un método para generar organoides colónicos humanos (HCO) a partir de células madre pluripotentes humanas (hPSC), que incluyen células madre embrionarias humanas (hES) y células madre pluripotentes inducidas (iPSC). Una inducción de tres días de la señalización de BMP modela suficientemente los cultivos del tubo del intestino medio/posterior en HCOs especiales que expresan la proteína de unión a secuencia 2 rica en AT (SATB2) que contienen todos los principales tipos de células epiteliales presentes en el colon humano, así como células mesenquimales en codesarrollo. La omisión de BMP (o la adición del inhibidor de BMP NOGGIN) durante este período crítico de modelado dio lugar a la formación de organoides intestinales humanos (HIO). Las HIO y las HCO se parecen morfológica y molecularmente al intestino delgado y al colon en desarrollo humano, respectivamente. A pesar de la utilidad de las HIO y las HCO para estudiar el desarrollo intestinal humano, la generación de HIOs y HCOs es un reto. En este artículo se presentan métodos para generar, mantener y caracterizar HIOs y HCOs. Además, se proporcionan los pasos críticos del protocolo y las recomendaciones de solución de problemas.

Introduction

El estudio del desarrollo del colon humano es difícil debido a las restricciones en el uso de tejido fetal humano. Los modelos animales han sido invaluables e históricamente utilizados para enfoques genéticos en ratones para estudiar el desarrollo intestinal. Sin embargo, las diferencias entre el desarrollo intestinal del ratón y el humano limitan la aplicabilidad de los ratones como sistema modelo. Por ejemplo, aunque la formación de criptas en el intestino delgado y el colon de los ratones ocurre después del nacimiento, los humanos nacen con^{criptas completamente} formadas. Además, el intestino delgado y el col....

Protocol

1. Generación de organoides intestinales y colónicos humanos

1. Preparación de placas recubiertas de ECM
   1. Agregue 50 mL de medio DMEM frío en un tubo cónico de 50 mL.
   2. Retire una alícuota de 4 ECM con calificación hESC (consulte la tabla de materiales) del congelador a -80 °C y descongele con hielo.
      NOTA: Consulte el certificado de análisis del producto para determinar el volumen de ECM calificado por ESC requerido para preparar un stock 4x.
   3. Si el ECM calificado para hESC no se descongela completamente, tome 750 μL de DMEM del tubo cónico de 50 mL y mézclelo con el ECM.
   ....

Results

La generación exitosa de esferoides durante la etapa de inducción del intestino medio/posterior es indicativa de un patrón exitoso. Realice la tinción de FI para CDX2 en esferoides flotantes y en la monocapa para confirmar que el patrón es correcto. Aunque la tinción en la etapa definitiva del endodermo (DE) puede indicar la eficacia de la inducción de DE, la generación de esferoides no es posible sin una inducción eficiente de DE. Para probar la eficiencia de la inducción de DE, realice la tinción de FI y/o RT-qPCR para.......

Discussion

La diferenciación de las hPSC en HIO y HCO es un proceso complejo que requiere controles de calidad en cada paso. Las hPSC iniciales deben tener una diferenciación mínima antes de iniciar la diferenciación en DE. La optimización de la densidad de hPSCs plateadas para la diferenciación de DE es fundamental para el éxito del protocolo. Para garantizar la calidad de la diferenciación de DE, realice IF para FOXA2 y SOX17 para determinar la eficiencia de la diferenciación de DE. La diferencia.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Solución de albúmina sérica bovina (BSA) al 1%	N/A	N/A	N/A
Tubo Corning de 15 ml	Halcón	21008-918	N/A
30% Sacarosa	N/A	N/A	Hecho en PBS.
5% Suero de burro normal	Laboratorio de investigación inmunológica de Jackson	017-000-121	N/A
Tubo Corning de 50 ml	Halcón	21008-951	N/A
Accutasa	Thermo Scientific	A1110501	Solución de desprendimiento celular; alícuota 5 ml de Accutasa en tubos de 10 ml con un total de 20 tubos y almacenar a -20 ° C hasta por 6 meses. Colocar a 4 ° C C durante la noche antes de usar.
Activina A	Sistemas de guiado celular	GFH6-100x10	Reconstituir el polvo liofilizado a 100 µ g/ml en PBS estéril que contiene 0,1% de albúmina sérica bovina (BSA). Alícuota 38 µ L de Activina A en tubos de microcentrífuga preenfriados y almacenar a -80 ° C (Los tubos caducan a los 12 meses de la fecha de recepción).
Activina día 1 medio (RPMI 1640)	Corning	MT10041CV	Use aminoácidos no esenciales (NEAA, Corning 11140050) y almacene a 4 °C. Medio básico del día 1: 500 ml de RPMI 1640 y 500 ml de NEAA. Cuando prepare Activin día 1 medio, agregue 13 ml de medio básico día 1, 13 µ l de Activina A (100 µ g/mL), y 2 µ l de BMP4 (100 µ g/ml). El medio base es estable hasta por 3 semanas, pero debe usarse inmediatamente después de la adición de factores de crecimiento.
Activina día 2 medio (RPMI 1640, 0,2% FBS vol/vol)	Hyclone	SH30070.03D	Use aminoácidos no esenciales (Corning 11140050) y guárdelos a 4 °C. Medio básico del día 2: 500 ml de RPMI 1640, 500 ml de NEAA y 1 ml de suero al 0,2%. Al preparar Activin Day 2 medium, agregue 12.5 mL de basic day 2 medium y 12.5 µ L de Activina A (100 µ g/ml). El medio base es estable hasta por 3 semanas, pero debe usarse inmediatamente después de la adición de factores de crecimiento.
Activina día 3 medio (RPMI 1640, 2% FBS vol/vol)	Hyclone	SH30070.03D	Use aminoácidos no esenciales (Corning 11140050) y guárdelos a 4 °C. Medio básico del día 3: 500 ml de RPMI 1640, 500 ml de NEAA y 10 ml de suero al 2%. Cuando prepare Activin día 3 medio, agregue 12,5 ml de día básico 3 y 12,5 µ L de Activina A (100 µ g/ml). El medio base es estable hasta por 3 semanas, pero debe usarse inmediatamente después de la adición de factores de crecimiento.
Alexa Fluor 488 Burro anti-Cabra	Thermo Scientific	Referencia A11055	Dilución 1:500 (anticuerpo secundario)
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Conejo	Thermo Scientific	Referencia A21206	Dilución 1:500 (anticuerpo secundario)
Alexa Fluor 546 Donkey anti-Ratón	Thermo Scientific	A10036	Dilución 1:500 (anticuerpo secundario)
Alexa Fluor 647 Donkey anti-Ratón	Thermo Scientific	Referencia A31571	Dilución 1:500 (anticuerpo secundario)
Molde base	Pescador	22-363-552	N/A
Medio intestinal básico (DMEM avanzado)	Gibco	12491015	Al preparar el medio intestinal básico, agregue 500 ml de DMEM, 500 ml de N2 (Gibco 17-502-048), 500 ml de B27 (Gibco), 500 ml de L-glutamina para obtener 2 ml de L-glutamina (Corning A2916801), 5 ml de 100 U/ml de penicilina-estreptomicina (Gibco 15-140-122) y 7,5 ml de L  1 M HEPES para obtener 15 mM HEPES. El medio base es estable hasta por 3 semanas, pero debe usarse inmediatamente después de la adición de factores de crecimiento.
Sistema de detección de PCR en tiempo real Biorad CFX96 Touch	Biorad	N/A	Se pueden utilizar otros sistemas qRT-PCR.
Solución de recuperación celular	Corning	354253	Solución degradante de ECM
CHIR99021	Reprocell	4000410	Reconstituya agregando 2,15 ml de DMSO a 10 mM. Preparar 50 µ L alícuotas y almacenar a -20 °C. Almacene el polvo a 4 ° C; C, protegido de la luz.
CTRL HIO medio de patrón	N/A	N/A	Medio intestinal básico y 100 ng/mL EGF.
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542	Dilución 1:100 (anticuerpo secundario)
Monocapa DE	N/A	N/A	La monocapa se generó en pasos anteriores (Sección 4.4).
Dispase	Gibco	17105041	Vuelva a suspender el polvo liofilizado en DMEM avanzado (Gibco MT15090CV) a una concentración final de 1 mg / ml. Filtre la solución para la esterilización aspirando con un tubo de esterilización con filtro Millipore. Hacer 10 mL de alícuotas (1 mg/mL) y almacenar a -20 ° C hasta por 6 meses. Colocar a 4 ° C C durante la noche antes de usar.
FEAG	Thermo Scientific	236-EG-01M	Al preparar 100 ng/mL EGF reconstituir 500 µ g/ml en PBS estéril. A continuación, agregue 2 ml de PBS estéril a 1 mg de EGF y haga 500 µ g/ml de solución de EGF. Alícuota 100 µ L de EGF en 20 tubos.
Fisherbrand Placas Petri de 6 cm con tapa transparente	Pescador	FB0875713A	N/A
Elevador de celda Fisherbrand	Pescador	08-100-240	N/A
Fisherbrand Viales roscados de vidrio transparente clase B con cierres adjuntos	Pescador	03-338B	N/A
Pipeta de Pasteur de Vidrio de Borosilicato Desechable Fisherbrand	Pescador	13-678-2D0	N/A
Medio de montaje deslizante Fluoromount G	VWR	100241-874	N/A
DMEM avanzado de Gibco	Gibco	12-491-023	N/A
Cabra anti-E-Cadherina	R& Sistemas D	AF648	Dilución 1:400 (anticuerpo primario)
Cabra anti-SOX17	R& Sistemas D	AF1924	Dilución 1:500 (anticuerpo primario)
Medio de patrón HCO	N/A	N/A	Medio intestinal básico, 100 ng/mL EGF y 100 ng/mL BMP2. Al preparar BMP2, agregue 1 ml de BSA estéril de 4 mM HCl al 0,1% a los viales de BMP2 (100 µ g). Alícuota 25 µ L de solución de BMP4 en 4 tubos. El medio base es estable hasta por 3 semanas, pero debe usarse inmediatamente después de la adición de factores de crecimiento.
Hemocitómetro	Sigma-Aldrich	Z359629	N/A
Células madre pluripotentes humanas (hPSC)	Instalación de células madre pluripotentes	N/A	Células sembradas en una placa de 24 pocillos recubierta de Matrigel (Thermo Scientific 73520-906).
Solución helada de paraformaldehído al 4% (PFA)	N/A	N/A	N/A
Solución salina tamponada con fosfato helada (PBS)	N/A	N/A	El pH debe ser de 7,4.
Lápiz de barrera hidrofóbica ImmEdge	Laboratorios Vector	101098-065	N/A
Células madre pluripotentes inducidas (iPSC)	Centro de células madre pluripotentes (Centro Médico del Hospital Infantil de Cincinnati)	N/A	Se pueden usar otras líneas hESC o iPSC, pero el protocolo debe optimizarse para cada línea celular.
Micrótomo de Leica	N/A	N/A	N/A
LSM 880			microscopio confocal
Matriz de membrana basal Matrigel	Corning	354234	N/A
Matriz calificada por Matrigel hESC	Corning	354277	Prepare 4 alícuotas de Matrigel que correspondan a volúmenes suficientes para hacer suficiente Matrigel diluido para 4 platos de 6 pocillos.
Medio de inducción del intestino posterior medio (RPMI 1640)	Corning	MT10041CV	Aminoácidos no esenciales (Corning 11140050), 2% FBS vol/vol (Hyclone SH30070.03T), 3 µ M CHIR99021 y 500 ng/mL FGF4. El medio base es estable hasta por 3 semanas, pero debe usarse inmediatamente después de la adición de factores de crecimiento.
Esferoides del intestino posterior medio	N/A	N/A	N/A
Unidades de filtro de vacío desechables estériles MilliporeSigma Steriflip	MilliporeSigma	SCGP00525	N/A
Ratón anti-CDX2	BioGenex	MU392-UC	Dilución 1:300 (anticuerpo primario)
Ratón anti-FOXA2	Abnova/Novus	H00003170-M01	Dilución 1:500
Medio de crecimiento completo mTeSR1	Tecnologías de células madre	85870	Agregue 100 ml de suplemento de mTeSR (85870) en un medio mTeSR de 400 ml (85870) y alícuotas en tubos de 50 ml para evitar la contaminación. Almacenar a 4° C hasta su uso.
Solución transparente de Murray (también conocida como BABB)	Murray's	N/A	Benzoato de bencilo 1:2 y alcohol bencílico.
Medio de patrón NOG HIO	N/A	N/A	Medio intestinal básico, 100 ng/mL EGF y 100 ng/mL NOGGIN (Dispense 25 µ g de NOGGIN en 250 µ l PBS estéril con BSA al 0,1%).
ARN de NucleoSpin	Takara	740955.25	Se pueden usar otros kits de aislamiento de ARN.
Placa de cultivo de tejidos de superficie delta Nunclon de 24 pocillos (Nunc)	Thermo Scientific	73521-004	N/A
Placa de cultivo de tejidos de superficie Nunclon delta de 24 pocillos recubierta con Matrigel	Thermo Scientific	73521-004	N/A
Placa de cultivo de tejidos de superficie delta Nunclon de 6 pocillos (Nunc)	Thermo Scientific	73520-906	N/A
Placa de cultivo de tejidos de superficie delta Nunclon de 6 pocillos recubierta con  Matrigel.	Thermo Scientific	73520-906	N/A
Medio de crecimiento para HIO, CTRL HIO y HCO	N/A	N/A	Medio intestinal básico y 100 ng/mL EGF (concentración final)
Solución salina de tampón de fosfato, 0,5 % Tritón X (PBS-T)	N/A	N/A	N/A
Imprimaciones	Tecnologías integradas de ADN, Inc. (IDT)	N/A	Los cebadores se enumeran en la Tabla 2 del protocolo.
Conejo anti-CDX2	Marca de celda	EPR22764Y	Dilución 1:100 (anticuerpo primario)
Conejo anti-SATB2	Marca de celda	EP281	Dilución 1:100 (anticuerpo primario)
Proteína BMP-4 humana recombinante	R& Sistemas D	314-BP-010	Reconstituir el polvo liofilizado a 100 µ g/ml en HCl estéril 4 mM que contiene 0,1% de albúmina sérica bovina (BSA). Agregue 4,17 ml de solución de HCl a 45,83 ml de agua molecular para un total de 50 ml de 1 M de HCl. Luego agregue 200 µ L de 1 M de HCl a 49,8 mL de agua de grado molecular por un total de 50 mL de 4 mM de HCl. A continuación, agregue 0,05 g de BSA a 50 ml de HCl 4 mM y filtre para que quede estéril. Alícuotas estériles 4 mM HCl 0,1% BSA a 33 tubos de microcentrífuga totalizando y almacenando a -20 °C. Añadir 100 °C; l de BSA estéril 4 mM HCl 0,1% a los viales BMP4 (10 µ g) para hacer solución BMP4 a 100 µ g/ml.
Proteína FGF-4 humana recombinante	R& Sistemas D	235-F4-01M	Reconstituir a 100 µ g/ml en PBS estéril que contiene albúmina sérica bovina al 0,1%. Agregue 0,05 g de BSA en 50 ml de PBS para hacer un 0,1% de BSA. Filtro 0.22 µ M BSA para esterilizar el BSA. Alícuota 10 mL de BSA al 0,1% en 5 tubos. Agregue 1 mg de FGF-4 en 10 ml de BSA estéril al 0,1%. Alícuota 250 µ L en tubos de microcentrífuga 40 preenfriados y almacenar a -80 °C.
Inhibidor de ROCK Y-27632	Tocris	1254	La concentración final es de 10 mM (10 mmol/L). Volver a suspender en DMSO a 10 mM y esterilizar con filtro. Agregue 3 ml de PBS estéril a cada vial. Aliqout 100 µ L de inhibidor de ROCK en 30 tubos y almacenar a -20 °C.
Kit de síntesis de ADNc SuperScript VILO	Thermo Scientific	11-754-250	N/A
Portaobjetos de microscopio SuperFrost Plus
Compuesto Tissue Tek O.C.T	VWR	25608-930	N/A