Aislamiento del extracto nuclear activo de Caenorhabditis elegans y reconstitución para la transcripción in vitro

Resumen

Aquí, describimos un protocolo detallado para aislar el extracto nuclear activo de la etapa larvaria 4 de C. elegans y visualizar la actividad de transcripción en un sistema in vitro .

Resumen

Caenorhabditis elegans ha sido un importante sistema modelo para la investigación biológica desde que se introdujo en 1963. Sin embargo, C. elegans no se ha utilizado completamente en el estudio bioquímico de reacciones biológicas utilizando sus extractos nucleares, como la transcripción in vitro y la replicación del ADN. Un obstáculo significativo para el uso de C. elegans en estudios bioquímicos es interrumpir la gruesa cutícula externa del nematodo sin sacrificar la actividad del extracto nuclear. Si bien se utilizan varios métodos para romper la cutícula, como la homogeneización o la sonicación de Dounce, a menudo conducen a la inestabilidad de las proteínas. No existen protocolos establecidos para aislar proteínas nucleares activas de larvas o adultos de C. elegans para reacciones in vitro . Aquí, el protocolo describe en detalle la homogeneización de la etapa larvaria 4 C. elegans utilizando un homogeneizador Balch. El homogeneizador Balch utiliza presión para forzar lentamente a los animales a través de un estrecho espacio que rompe la cutícula en el proceso. El diseño uniforme y el mecanizado preciso del homogeneizador Balch permiten una molienda constante de animales entre experimentos. El fraccionamiento del homogeneizado obtenido del homogeneizador Balch produce un extracto nuclear funcionalmente activo que se puede utilizar en un método in vitro para evaluar la actividad de transcripción de C. elegans.

Introducción

El pequeño nematodo de vida libre Caenorhabditis elegans es un organismo modelo simple pero poderoso para abordar una amplia gama de preguntas biológicas. Desde su introducción en 1963, los nematodos han sido invaluables para responder preguntas en neurobiología, metabolismo, envejecimiento, desarrollo, inmunidad y ^genética1. Algunas de las muchas características del animal que lo convierten en un organismo modelo ideal incluyen el corto tiempo de generación, la efectividad de la interferencia de ARN, el cuerpo transparente y los mapas completos tanto de su linaje celular como de su sistema nervioso.

Si bien....

Protocolo

1. Preparación de los medios de comunicación

1. Prepare placas de agar de caldo de lisogenia (LB) estériles y medios líquidos siguiendo las instrucciones del fabricante.
2. Streak Escherichia coli (E. coli) cepa OP50 en una placa de agar LB. Incubar la racha de bacterias a 37 °C durante la noche.
3. Guarde la placa de rayas de E. coli OP50 a 4 °C después de la incubación. La placa op50 de E. coli se puede almacenar de forma segura a 4 °C durante 2 semanas si se envuelve en parafilm para evitar la pérdida de humedad.
4. Prepare 2 L de nematodos medios de crecimiento (NGM) usando la receta de la Tab....

Resultados

Siguiendo los pasos descritos se debe producir extracto nuclear funcional (Figura 1), la desviación en los pasos de molienda o lavado puede conducir a una actividad deficiente o bajos rendimientos. Si se obtiene extracto nuclear funcional de C. elegans , transcribirá la región aguas abajo del promotor cmv en la plantilla de ADN cuando se agregue al ensayo in vitro descrito anteriormente. La transcripción de ARN resultante se puede purificar.......

Discusión

C. elegans es un organismo modelo atractivo para estudiar el sistema de transcripción eucariota debido a su bajo costo de mantenimiento y la facilidad de manipulación genética. Aquí se describe un protocolo para el aislamiento consistente del extracto nuclear funcionalmente activo de L4 C. elegans . Aunque este protocolo se centró en visualizar la actividad de transcripción, el ADNc producido post-transcripcionalmente se puede cuantificar mediante RT-qPCR para obtener una medición más precisa de la acti.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Consumibles y reactivos
0.2 mL 8-Strip Tubos & Tapas de tiras planas, transparentes	Genesee Scientific	24-706
Tubos de PCR individuales de 0,2 mL	Genesee Scientific	24-153G
1,7 mL microtubos estériles	Genesee Scientific	24-282S
Etanol de grado molecular absoluto 100%	Fisher Scientific	BP2818
100% etanol, Koptec	Decon Labs	V1001
pipeta serológica de 10 mL	VWR international	89130-898
Placas de Petri de 150 mm	Tritech Research	T3325
Tubos de centrífuga cónicos de 15 mL	Genesee Scientific	28-103
Jeringas de plástico de 20 mL	Fisher Scientific	14955460
2 mL jeringas Norm-Ject	Henke-Sass Wolf GmbH	4020
500 mL vaso de filtro de vacío 0,22 y micro; m PES, Stericup Millipore Express Plus	Millipore Sigma	SCGPU10RE
tubos de centrífuga cónicos de 50 mL	ThermoFisher Scientific	339652
pipeta serológica de 50 ml	VWR international	89130-902
pipeta serológica de 5 mL	VWR international	89130-896
Agar, Criterion	VWR International	C7432
Agarosa	Denville Scientific	CA3510-6
Rotulador a prueba de alcohol	VWR International	52877-310
Bacto peptona	VWR International	90000-264
Caenorhabditis elegans	CGC	N2
Dicloruro de calcio	Millipore Sigma	C4901
Colesterol	Millipore Sigma	C8667 C8667 C8667
Con de clonación de templo de ADN, Forward 5'- ctc atg ttt gac agc tta tcg atc cgg gc -3'
Clonación de templos de control de ADN, Forward 5'- aca gga cgg gtg tgg tcg cca tga t -3'
Agua
Dithiothreitol	Invitrogen	15508-013
Tinción de gel de ADN, Invitrogen seguro SYBR		S33102
Mezcla de escalera de ADN, O' gobernante genético	Fisher Scientific	SM1173
Tinte de carga de ADN, 6x TriTrack	Fisher Scientific
DNasa, Referencia-CERO	Lucigen
Hielo
Escherichia coli OP50 cepa	CGC	OP50
Ácido acético glacial	Fisher Scientific	A38
Glicerol	Millipore Sigma	G6279
Sistema de transcripción in vitro de extracto nuclear HeLa, HeLaScribe	Promega	E3110
Solución de Hepes, 1 M Gibco	Millipore Sigma	15630080
Ácido clorhídrico 37%	Millipore Sigma	P0662
Blanqueador de hipoclorito	Caldo Clorox
LB	Millipore Sigma	L3022
Dicloruro de magnesio	Millipore Sigma	M8266
Sulfato de magnesio	Millipore Sigma	M7506
Platos de peso medio	Fisher Scientific	02-202-101
portaobjetos de microscopio, Vista vision	VWR International	16004-368
agua de grado molecular, Hypure	Hyclone Laboratories
Nistatina	Millipore Sigma	Sistema de PCR N1638
, FailSafe con premezcla A	Lucigen
Cloruro de potasio	Millipore Sigma	P39111
Fosfato de potasio dibásico	Millipore Sigma	P3786
Fosfato de potasio monobásico	Millipore Sigma	P0662
Inhibidor de la proteasa, cóctel de un solo uso Halt 100x	ThermoFisher Scientific	78430
kit de ensayo de proteínas, Qubit	ThermoFisher Scientific	Q33211
kit de transcripción inversa, Sensiscript	Qiagen	205211
kit de extracción de ARN Kit micro RNeasy	Qiagen	74004
	Applied Biosystems
Cloruro de sodio	VWR International	BDH9286-12KG
Hidróxido de sodio	Millipore Sigma	1-09137
Filtro de jeringa estéril con 0.2 y micro; m Membrana de polietersulfona	VWR international	28145-501
Sacarosa	VWR International	200-334-9
cebadores de transcripción, Forward 5'- gcc ggg cct ctt gcg gga tat -3'
cebadores de transcripción, reverso 5'- cgg cca aag cgg tcg gac agt-3'
Tris-Base	Fisher Scientific	BP152
Tween20	Millipore Sigma	P2287
Equipo
-20 ° Incubadora C	ThermoFisher Scientific
20 ° Incubadora C	ThermoFisher Scientific
37 ° incubadora C	Forma Scientific
4 ° C frigorífico	ThermoFisher Scientific-80
° Congelador C	Eppendorf
Autoclave	Sanyo
Balch homogeneizador, isobiotec homogeneizador celular	Isobiotec
Vortexer de sobremesa	Fisher Scientific	2215365
Centrífuga, Eppendorf 5418 R	Centrífuga Eppendorf	5401000013
, VWR Clinical 50	VWR International	82013-800
Microscopio de disección, Leica M80	Fluorómetro Leica Microsystems
, Qubit 2.0	Invitrogen	Q32866
Sistema de imágenes en gel, iBright FL1500	ThermoFisher Scientific	A44241
Sistema de gel	ThermoFisher Scientific
Heat block	VWR International	12621-048
Microcentrífugas, Eppendorf 5424	Eppendorf	22620401
PIPETBOY acu 2	Integra	155017
Pipeta L-1000 XLS+, Pipet-Lite LTS	Pipeta	de 17014382
L-10 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014388
Pipeta L-200 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014391
Pipeta L-20 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin 17014392
Plataforma oscilante	VWR International, Eppendorf Mastercycler
Pro, Eppendorf 950030010

desionizadaFERR1161DB0715K secoSH30538FS99100 Inhibidor de ARNasa N8080119Rainin