Establecimiento de una plataforma electrofisiológica para modelar la ELA con astrocitos y neuronas derivados de células madre pluripotentes humanas específicas de la región

Resumen

Describimos un método para diferenciar astrocitos y neuronas derivados pluripotentes inducidos por humanos de la médula espinal y su cocultivo para el registro electrofisiológico.

Resumen

Los astrocitos y neuronas derivados de células madre pluripotentes humanas (hiPSC-A) y las neuronas (hiPSC-N) proporcionan una herramienta poderosa para modelar la fisiopatología de la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) in vitro. Las grabaciones de matriz de electrodos múltiples (MEA) son un medio para registrar potenciales de campo eléctrico de grandes poblaciones de neuronas y analizar la actividad de la red a lo largo del tiempo. Se demostró previamente que la presencia de hiPSC-A que se diferencian utilizando técnicas para promover un fenotipo de astrocito de la médula espinal mejoró la maduración y la actividad electrofisiológica de las neuronas motoras (MN) hiPSC de la médula espinal específicas regionalmente en comparación con las cultivadas sin hiPSC-A o en presencia de astrocitos de roedores. Aquí se describe un método para cocultivar hiPSC-A de la médula espinal con hiPSC-MN y registrar la actividad electrofisiológica utilizando grabaciones MEA. Si bien los protocolos de diferenciación descritos aquí son particulares para los astrocitos y las neuronas que son regionalmente específicos de la médula espinal, la plataforma de cocultivo se puede aplicar a astrocitos y neuronas diferenciadas con técnicas específicas para otros destinos, incluidos hiPSC-A cortical e hiPSC-N. Estos protocolos tienen como objetivo proporcionar un ensayo electrofisiológico para informar sobre las interacciones glia-neurona y proporcionar una plataforma para probar medicamentos con potencial terapéutico en la ELA.

Introducción

Los astrocitos y neuronas derivados de células madre pluripotentes humanas (hiPSC-A) y las neuronas (hiPSC-N) son herramientas poderosas para modelar la fisiopatología de la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) in vitro y proporcionan un paradigma traslacional para las estrategias de descubrimiento de fármacos¹. Los investigadores han demostrado que el cocultivo de hiPSC-A con hiPSC-N mejora la maduración morfológica, molecular, electrofisiológica y farmacológica de ambos tipos celulares, generando redes neuronales complejas e interacciones astrocito-neurona que se asemejan a sus contrapartes in vivo

Protocolo

1. Preparación de medios de cultivo celular

1. Preparar los medios de cultivo celular individuales utilizando las composiciones mencionadas en la Tabla 1.
2. Mezclar y filtrar estéril el medio en frascos filtrados de 500 ml, y almacenar protegido de la luz a 4 °C durante un máximo de 2 semanas.

2. Mantenimiento y paso de células madre pluripotentes inducidas humanas no confluentes (hiPSC)

1. Descongele la matriz de la membrana basal (almacenada en alícuotas a -80 °C) en un refrigerador de 2-8 °C durante la noche.
2. Diluir la matriz de la membrana basal a 1:100 (v/v) en solución salina tamp....

Resultados

El protocolo de patrones de la médula espinal para la generación de hiPSC-MN y hiPSC-A de la médula espinal se describe en la Figura 1. En este protocolo, las hiPSC se mantienen y pasan como colonias no confluentes (Figura 2A). La neurogénesis se inicia (inducción neural) a través de la inhibición dual de SMAD mediante la adición de LDN193189 y SB431542, inactivando las vías de la proteína morfogenética ósea (BMP) y del factor de crecimiento transformante beta (.......

Discusión

Hasta la fecha, los métodos basados en hiPSC y MEA para registros electrofisiológicos de cocultivos astrocito-neurona han encontrado una aplicación limitada en el campo de ALS⁶ y aún no en plataformas completamente humanas, en contraste con su uso más generalizado para el modelado in vitro de la epilepsia⁹. Esta plataforma, sin embargo, tiene el potencial de abordar cuestiones fisiopatológicamente relevantes en la investigación de la ELA, como los mecanismos de hip.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Placas de cultivo estériles de 10 cm	Falcon	353003
matraces de cultivo estériles de 25 cm2	Falcon	353136
2-Mercaptoetanol (β-ME)	Thermofisher	21985023	Concentración de trabajo 110 µ M
500 mL 0,2 y micro; m CA Filter System	Corning	430769
pipeta de 5 mL	Falcon	357543
6 placas de cultivo estériles de pocillos	Falcon	3046
Anfotericina B	Gibco	15290018	Concentración de trabajo 2.0 μ g/mL
Detergente aniónico con enzima proteasa - Terg-A-Zyme	Sigma-Aldrich	Z273287	Concentración de trabajo 1% m/v
Ácido ascórbico (ASAC)	Sigma	A4403	Disuelva 100 mg en 250 mL de dH2O para obtener un caldo de 0,4 mg/ml. Filtro estéril a través de un 0.22 µ m filtrar, alícuota y congelar a -80 ºC. Diluir a 1:1000 para su uso. (concentración de trabajo 0,4 y micro; g/mL).
Axion CytoView MEA 24 placas (M384-tMEA-24W)	Axion	OPT-24
Plataforma Axion Edge MEA	Matriz	Maestro Edge
- Matrigel	Corning	354277	Detalles en el protocolo
Microscopio de sobremesa (estéril bajo campana de cultivo celular)	Zeiss	415510-1100-000	Primo Vert
Bicuculline	Sigma Aldrich	14340	Concentración de trabajo10 μ M
Factor neurotrófico ciliar (CNTF)	Peprotech	450-13	Dissolve 100 µ g en 1 mL de PBS estéril, y luego agregue 9 mL de BSA-PBS estéril al 0,1% a 10 & micro; g/mL. Alícuota y congelar a -80 ºC. Diluir a 1: 1000 para su uso. (concentración de trabajo 10 ng/mL).
Tanques de CO2 y regulador para Axion Edge	AirGas/Harris	9296NC
Compound E	Abcam	ab142164	Dissolve 250 µ g en 2.0387 mL de DMSO para obtener un 250 µ M stock. Alícuota y congelar a -80 ºC. Diluir 1:2000 para su uso. (concentración de trabajo 125 nM).
Cyanquixaline  (CNQX)	Sigma Aldrich	C239	Concentración de trabajo 50 μ M
Ácido dihidrocaínico (DHK)	Tocris	111	Concentración de trabajo 50 μ M y 300 μ M
DMEM/F12	Thermofisher	113300	Concentración de trabajo 1x
Essential 8 Medium + Essential 8 Supplement	Thermofisher	A1517001	Combine 10 mL de Essential 8 (10x)  suplemento con 500 mL de Essential 8 Growth Medium (1x)
Suero Fetal Bovino (FBS)	Thermofisher	16140071	Concentración de trabajo 1x
Neurotrófico derivado de líneas celulares gliales (GDNF)	Peprotech	450-10	Disolver 100 µ g en 1 mL de PBS a 100 µ g/mL, y luego agregue 9 mL de BSA-PBS estéril al 0,1% a 10 µ g/mL. Alícuota y congelar a -80 ºC. Diluir a 1: 1000 para su uso. (concentración de trabajo 10 ng/mL).
Hemocitómetro	Election Microscopy Sciences	63510-20
Heparina	Millipore-sigma	H3149-100KU	Disuelva 200 mg en 100 mL de PBS para obtener 2 mg/mL de solución madre. Alícuota el stock en 15 mL y 500 µ Tubos L. Diluir 1:1000 para su uso. (concentración de trabajo 2 y micro; g/mL).
Incubadora de cultivos celulares con control de humedad	ThermoFisher	370	set to 37 º C, 5 % CO2
Factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF-1)	R& Sistemas D	291-G1-200	Disolver 200 µ g en 2 mL de PBS a 100 µ g/mL, luego agregue 18 mL de 0.1%BSA-PBS para hacer 10 µ g/mL de almacenamiento y almacenamiento a -80 ºC. Alícuota y congelación a -80 ºC. Diluir 10 µ g/mL de stock a 1:1000 para su uso. (concentración de trabajo 10 ng/mL).
Ácido Kainc	Abcam	ab144490	Concentración de trabajo 5 μ M
Knockout Serum Replacement (KSR)	Thermofisher	10828	Concentración de trabajo 1x
Laminin	Thermofisher	23017-015	Solución madre 1 mg/mL, concentración de trabajo 10 µ g/mL (recubrimiento), 1 y micro; g/mL (medios celulares)
LDN193189	Stemgent	04-0074	Disolver 2 mg de LDN en 500 µ L de cloroformo para obtener 10 mM de stock. Alícuota esto y se congela a -80 ºC. Para su uso, diluya el material de 1 a 10 en DMSO [a 1 mM] primero, luego diluya 1:5000 de 1 mM en el medio deseado para obtener 0.2 µ Solución
de trabajo M L-glutamina	Thermofisher	25030	Concentración de trabajo 100x
Placas de vidrio MEA	Sistemas multicanal	60MEA200/30iR-Ti-gr
Pipeta multicanal P200	Gilson	PJ22224
Neurobasal	Thermofisher	21103049	Concentración de trabajo 1x
Aminoácidos no esenciales (NEAA)	Thermofisher	11140050	Concentración de trabajo 100x
Pencillin/Estreptomicina	Thermofisher 15140122		Concentración de trabajo 100x
Poliornitina (PLO)	Sigma-Aldrich	P3655	Disuelva 100 mg en 1 mL de ddW para obtener 100 mg/mL de solución madre. Alícuota la acción en 100 µ Tubos L. (concentración de trabajo 100 µ g/mL)
Cloruro de potasio (KCl)	NA	NA Concentración	trabajo100 mM
Purmorfamina (PMN)	Millipore-Sigma	540223	Disuelva 5 mg en 9,6 mL de DMSO para obtener una solución de 1 mM. Alícuota y congelar a -80 ºC. Diluir 1:1000 para su uso. (concentración de trabajo 1 y micro; M).
Factor neurotrófico recombinante derivado del cerebro humano (BDNF)	Peprotech	450-02	Centrífuga brevemente antes de la reconstitución. Disolver 100 µ g en 1 mL de PBS a 100 &; g/mL, y luego agregue 9 mL de BSA-PBS estéril al 0,1% a 10 µ g/mL. Alícuota y congelar a -80 ºC. Diluir a 1: 1000 para su uso. (concentración de trabajo 10 ng/mL).
Ácido retinoico (RA)	Sigma	R2625	Disuelva 100 mg en 3,3 mL de DMSO para obtener 100 mM de solución madre. Alícuota la culata 100 µ L/tubo y congelar a -80 ºC. Toma 200 µ L de 100 mM de caldo y diluir 10x (añadir 1,8 mL de DMSO) para hacer 10 mM de caldo. Alícuota 50 y micro; L/tubo  y almacenar a -80 ºC. Diluir a 1:10000 para su uso. (concentración de trabajo 2 y micro; M).
ROCK-I nhibitor	Peprotech 1293823		Disolver 5 mg en 1480 µ L de dH2O para obtener 10 mM de caldo, alícuota y congelar a -80 ºC. Diluir a 1:500 para su uso. (concentración de trabajo 20 y micro; M).
SB431542	Sigma	S4317	Disuelva 5 mg en 1,3 ml de DMSO para obtener 10 mM de solución madre. Alícuota y congelar a -80 ºC. Diluir a 1:1000 para su uso. (Trabajando con 10 y Micro; M)
Campanas de cultivo celular estériles Baker	Company	SG-600
Suplemento B - B27 Suplemento	Thermofisher	21985023	Concentración de trabajo 50x
Suplemento N - N2 Suplemento	Thermofisher	17502048	Concentración de trabajo 100x
Centrífuga de cultivo celular de sobremesa	ThermoFisher	75004261	Sorvall Legend X1R
Termoplástico  película - Parafilm	PARAFILM	P7793
Proteasa de disociación tisular - Dispasa	StemCell Technologies	7923	Concentración de trabajo 1x
Inhibidor de tripsina	Sigma	T6522-1G	Disuelva 1 g en 100 ml ddH2O para obtener un stock de 10 mg/mL. Alícuota y almacenar a 4 ºC. Diluir 1:10 del volumen de tripsina para su uso. (concentración de trabajo 1 mg/mL).
Tripsina-EDTA (0,05%)	Thermofisher	2530054	Concentración de trabajo 1x
Baño de agua	ThermoFisher	2332	Isotemp