Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

Artículo de método

Regulación de células madre mesenquimales de la fagocitosis de macrófagos; Cuantificación e imágenes

2.6K visualizaciones

⸱

DOI:

10.3791/62729

⸱

16 de julio de 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Molloy College

En este artículo

Resumen

Aquí se presenta un protocolo para cuantificar y producir imágenes dinámicas de la regulación mediada por células madre mesenquimales (MSC) de la fagocitosis de macrófagos (MΦ) de partículas de levadura no opsonizada (zymosan) que se conjugan con una molécula fluorescente sensible al pH.

Resumen

Las células madre mesenquimales (MSC) se han estudiado tradicionalmente por sus propiedades regenerativas, pero más recientemente, sus características inmunorreguladoras han estado a la vanguardia. Interactúan y regulan la actividad de las células inmunes. El enfoque de este estudio es la regulación MSC de la actividad fagocítica de los macrófagos. La fagocitosis de macrófagos (MΦ) es una parte importante de la respuesta del sistema inmune innato a la infección, y los mecanismos a través de los cuales msc modulan esta respuesta están bajo investigación activa. Aquí se presenta un método para estudiar la fagocitosis MΦ de partículas de zymosan no opsonizadas conjugadas a una molécula fluorescente sensible al pH mientras están en coculto con MSC. A medida que aumenta la actividad fagocítica y las partículas de zymosan etiquetadas están encerradas dentro del ambiente ácido del faglisosoma, la intensidad de fluorescencia de la molécula sensible al pH aumenta. Con las longitudes de onda de excitación y emisión apropiadas, la actividad fagocítica se mide utilizando un espectrofotómetro fluorescente y los datos cinéticos se presentan como cambios en las unidades fluorescentes relativas durante un período de 70 minutos. Para apoyar estos datos cuantitativos, el cambio en la actividad fagocítica se visualiza utilizando imágenes dinámicas. Los resultados que utilizan este método demuestran que cuando se está en coculto, msc mejora la fagocitosis MΦ de la zymosan no opsonizada de MΦ tanto naïve como IFN-γ tratada. Estos datos se suman al conocimiento actual de la regulación MSC del sistema inmune innato. Este método se puede aplicar en futuras investigaciones para delinear completamente los mecanismos celulares y moleculares subyacentes.

Introducción

Las células madre mesenquimales (MSC) son células progenitoras que dan lugar a células de tejido conectivo. Los MSC están presentes en tejidos de mamíferos adultos y se pueden aislar de la médula ósea1. Debido a sus propiedades inmunomoduladoras, estas células son ampliamente estudiadas2. Los primeros estudios se centraron en la regulación MSC de las células T3,4,5,6, pero más recientemente, su regulación de las células macrófagos (MΦ), un componente celular importante de la inmunidad innata, ha recibido una mayor atención7,8,9,10,11,12,13,14 . La importancia de la interacción MSC-MΦ en el tratamiento de la enfermedad inflamatoria se ve subrayada por el hecho de que el agotamiento de monocitos/macrófagos abroga los efectos terapéuticos de MSC en modelos animales8. Aquí, el foco es la interacción de contacto celular del MSC con MΦ. Los MSC tienen la capacidad de regular el fenotipo de MΦ promoviendo el cambio de respuestas inflamatorias a antiinflamatorias, lo que lleva a actividades de reparación de tejidos8,9,10,11,y se ha hecho mucho para demostrar estos mecanismos reguladores. En otras circunstancias, MSC puede apoyar o exacerbar una respuesta inflamatoria impulsada por MΦ12,13 y mejorar la actividad fagocítica de MΦ14,15. Sin embargo, existe una falta crítica de datos existentes que identifiquen los mecanismos y las condiciones bajo las cuales MSC regula la actividad fagocítica MΦ.

Los MΦ tienen familias de receptores que reconocen patógenos opsonizados (recubiertos de anticuerpos o complemento) o no opsonizados que conducen a la fagocitosis16. La activación y actividad de este último está menos estudiada17. En un ambiente in vitro no inflamatorio, los MSC mejoran la fagocitosis MΦ de patógenos no opsonizados13. Sin embargo, el reconocimiento de patógenos no opsonizados por MΦ puede reducirse después de la exposición a un ambiente inflamatorio producido por linfocitos durante una respuesta inmune adaptativa. El IFN-γ, liberado por las células asesinas naturales y los linfocitos efectores, tiene un efecto inhibidor sobre la fagocitosis MΦ de partículas no opsonizadas18. Se desarrolló un modelo de coculto para estudiar los mecanismos de regulación del contacto directo MSC de la fagocitosis MΦ. El objetivo del experimento presentado aquí es determinar si los MSC regulan la fagocitosis MΦ de patógenos no opsonizados después de que MΦ haya sido expuesto al IFN-γ(Figura 1).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

NOTA: Todas las técnicas de preparación de medios y cultivo celular se llevan a cabo en condiciones asépticas utilizando un gabinete de bioseguridad con flujo laminar. Todas las etapas de incubación del cultivo descritas se llevan a cabo utilizando una incubadora diseñada para mantener una atmósfera de 37 ° C, 5% de CO2y 95% de humedad.

1. Cultivo celular

  1. Preparación del medio de crecimiento
    1. Para MSC y LADMAC, agregue 50 ml de FBS y 5 ml de mezcla de antibióticos / antimicóticos 100x a 500 ml de DMEM de glucosa alta.
    2. Para el MΦ, añadir 50 ml de FBS, 100 ml de medio de condición LADMAC (preparado siguiendo los pasos de la sección 1.2) y 5 ml de mezcla antibiótica 100x a 500 ml de DMEM de glucosa alta.
      NOTA: Las células LADMAC producen el factor estimulante de colonias (CSF-1) necesario para apoyar el crecimiento de las células MΦ.
  2. Preparación de medio acondicionado LADMAC
    1. Para sembrar células LADMAC procedentes de material congelado, añadir 19 ml de medio de crecimiento de la sección 1.1 en cada uno de los cinco matraces tratados con cultivo celular T75 cm2 y colocar en la incubadora de cultivo celular durante 15 min para equilibrar a 37 °C.
    2. Mientras tanto, descongele rápidamente una alícuota de 106 células congeladas incubando en un baño de agua de 37 ° C durante 2-3 min o hasta que se descongele. Agregue las células a 9 ml de medio de crecimiento MSC fresco en un tubo cónico estéril de 15 ml o 50 ml y centrífuga a 125 x g en un rotor de cucharón oscilante durante 5 minutos.
    3. Aspire o decante el sobrenadante, agregue 5 ml de medio de crecimiento fresco y pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo para volver a colocar el pellet celular.
    4. Añadir 1 ml de suspensión celular a cada uno de los cinco matraces T75 cm2 utilizando una pipeta serológica estéril y colocarlos en la incubadora de cultivo celular.
    5. Cada 2-3 días, agregue 10 ml adicionales de medio durante un período de 7 a 10 días. Luego, recoja las células y el sobrenadante en tubos cónicos estériles de 50 ml utilizando una pipeta serológica estéril y una centrífuga a 125 x g durante 5 min.
    6. Separe el sobrenadante del pellet celular y filtre estérilmente el sobrenadante utilizando una unidad de filtro de vacío estéril de un solo uso de 0,2 μm.
      1. Retire el conjunto del aspirador del paquete y conéctelo mediante tubos de vacío a la bomba del aspirador. Vierta el sobrenadante en el compartimento superior y reemplace la cubierta. Encienda la bomba aspiradora para filtrar en el compartimento inferior.
      2. Preparar las alícuotas pipeteando en tubos cónicos estériles de 50 ml y almacenar a -20 °C.
    7. Para congelar el pellet celular, vuelva a colocarlo en un medio de congelación a 106 celdas/ml, colóquelo en un recipiente de congelación y luego colóquelos en un congelador de -80 °C. Después de 24 h, transfiera al almacenamiento LN2.
  3. Propagar células en preparación para el coculto
    1. Para sembrar células MSC y MΦ de la población congelada, equilibrar 9 ml de medio de crecimiento apropiado preparado en la sección 1.1 en cada una de las cuatro antenas tratadas con cultivo celular de 100 mm para cada tipo de célula y colocar en la incubadora de cultivo celular durante 15 min.
    2. Mientras tanto, descongele rápidamente las alícuotas de 106 células congeladas incubándolas en un baño de agua de 37 ° C durante 2-3 minutos o hasta que se descongelen. Luego, agregue las células MSC descongeladas a 9 ml de medio de crecimiento MSC fresco y agregue las células MΦ descongeladas a 9 ml de medio de crecimiento MΦ fresco en tubos cónicos estériles de 15 o 50 ml y centrífuga a 125 x g en rotor de cucharón oscilante durante 5 minutos.
    3. Aspire o decante el sobrenadante y resuspante cada pellet en 4 ml del medio de crecimiento fresco apropiado mediante el pipeteo suave hacia arriba y hacia abajo. Añadir 1 ml de suspensión celular a cada uno de los cuatro platos de 100 mm para cada tipo de célula que se han equilibrado en el paso 1.3.1.
    4. Devuelva los platos con células a la incubadora. Cambie el medio cada 2-3 días hasta que el 70%-80% sea confluente.

2. Semilla MSC en platos experimentales, Día 1

NOTA: Antes de sembrar el MSC, diseñe el diseño experimental de la placa de 96 pozos para espectrofotometría fluorescente y la diapositiva de cámara para imágenes dinámicas. Para la placa de 96 pozos, flanquee los pozos experimentales con pozos que contienen células, pero no los use en el ensayo. Marque al menos cuatro pozos que se utilizarán para el reactivo en blanco (RBL). Consulte la Tabla 1 para ver una plantilla de ejemplo de 96 pozos y la Tabla 2 para un ejemplo de una plantilla de diapositiva de cámara de 4 pozos. Se recomiendan placas negras o blancas de 96 pozos con fondos transparentes. Un portaobjetos de cámara de vidrio de borosilicato de 1,5 mm es óptimo, pero el número de cámaras se puede ajustar dependiendo del diseño del estudio. En la figura 2se incluye un diagrama de flujo resumido de los métodos siguientes.

  1. Con una confluencia del 70%-80%, aspire el medio de crecimiento de los cultivos en platos de 100 mm y agregue 5 ml de PBS para aislar el MSC.
  2. Aspire el PBS, agregue 2 ml de tripsina / EDTA al 0.05% y colóquelo en la incubadora de cultivo durante 3-5 min.
  3. Después de 3 min, verifique el desprendimiento celular con un microscopio invertido. Si las celdas están separadas, continúe con el siguiente paso; de lo contrario, continúe la incubación durante otros 1-2 minutos. No incubar más de 5-6 min.
  4. Agregue 5 ml de medio de crecimiento fresco al plato con las células separadas. Enjuague el plato con la mezcla de tripsina / medio y recolecte las células en un tubo cónico limpio y estéril de 50 ml con una pipeta serológica estéril.
  5. Centrífuga durante 5 min a 125 x g. Aspire el sobrenadante y resuspante el pellet celular en 10 ml de medio de crecimiento fresco mediante el pipeteo suave hacia arriba y hacia abajo.
  6. Para contar las células, agregue 10 μL de la suspensión celular a 30 μL de solución de azul de tripano al 0,4% en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Luego, pipetee 10 μL de la mezcla debajo de la cubierta de una cámara de conteo de hemocitómetros.
  7. Usando un microscopio de campo invertido o brillante, con el objetivo 10x, cuente las células no teñidas (viables) en cuatro de los cuadrados de 1 mm2. Calcule el número de celda utilizando la fórmula: celdas/mL = recuento de celdas/# 1 mm2 cuadrados x factor de dilución x 104.
    NOTA: Para este ejemplo, el número de 1 mm2 cuadrados contados es cuatro, y el factor de dilución es 4.
  8. Utilice la ecuación C1V1 = C2V2 para calcular y preparar una suspensión de 1 x10 5 celdas/ml. Prepare 1 ml de suspensión de celda/ml para cada columna de la placa de 96 pozos que se llena y 0,75 ml para cada cámara de la corredera de la cámara de 4 pozos que se llena de acuerdo con el diseño de la placa.
    NOTA: C1 = recuento de celdas, V1 = lo que se está calculando, C2 = 1 x10 5, V2 = 5.50 mL.
  9. Determine V1, reste de los 5,50 ml deseados del volumen total para determinar el volumen del medio fresco necesario para preparar la suspensión. Añadir el volumen de celdas (V1) de la suspensión original al volumen de medio fresco para un total de 5,50 mL con 1 x 105 celdas/mL.
  10. Agregue 100 μL de suspensión de 1 x10 5 celdas/ ml a cada pozo de la placa de 96 pozos de acuerdo con el diseño de la placa utilizando un micropipetador multicanal y 530 μL a cada uno de los pozos de la corredera de la cámara utilizando una micropipeta de acuerdo con el diseño de la placa. Incubar durante la noche.
    NOTA: Para este experimento, los MSC están chapados en las columnas 1, 2, 3 y 6 de la placa de 96 pozos(Tabla 1)y los pozos 1 y 2 de la diapositiva de la cámara de 4 pozos(Tabla 2). Por lo tanto, se preparan al menos 5,50 ml de una suspensión de 1 x10 5 celdas/ml. Los MΦ al 80% de confluencia se tratan con mediadores inflamatorios el mismo día en que se siembran los MSC en las placas experimentales.

3. Activar el MΦ con IFN-γ, Día 1

  1. Preparar el medio de activación y el stock de IFN-γ.
    1. Para 200 ml de medio de activación, agregue 40 mg de BSA a 200 ml de DMEM de glucosa alta sin suero y filtro estéril utilizando una unidad de filtro de vacío estéril de un solo uso de 0,2 μm.
    2. Para preparar BSA/PBS al 0,1%, agregue 20 mg de BSA a 20 ml de PBS. Vórtice para disolver. Utilice un filtro de jeringa estéril de 0,2 μm para filtrar en un tubo cónico limpio y estéril de 50 ml.
    3. Añadir 1 ml de la solución estéril de BSA/PBS al 0,1% a 100 μg de IFN-γ liofilizado para lograr una solución de 100 μg/ml de stock. Conservar en alícuotas de 50 μL a -20 °C.
  2. Activar el MΦ con IFN-γ
    1. Añadir 2,5 μL de 100 μg/mL de material de IFN-γ por cada 1 ml del medio necesario. Por cada plato de 100 mm que se va a activar, preparar 10 ml de medio de activación que contenga IFN-γ a una concentración de 250 ng/ml.
    2. Aspire el medio de crecimiento de los cultivos MΦ y reemplácelo con 5 ml del medio de activación sin IFN- γ para enjuagar.
    3. Aspire el medio utilizado para el enjuague y reemplácelo con 10 ml de IFN- γ medio de activación suplementado para el plato experimental y con 10 ml de medio de activación no suplementado para el control. Incubar los cultivos durante 16-24 h.

4. Aislar el MΦ y preparar los co-cultivos, Día 2

  1. Retire el medio de activación de las células MΦ y reemplácelo con 5 ml de medio de crecimiento fresco. Raspe suavemente con un elevador de células y recoja las células en un tubo cónico de 50 ml.
  2. Cuente las células utilizando la exclusión azul tripano y la hemocitometría como se describe para MSC en, pasos 2.6-2.7.
  3. Usando la ecuación en los pasos 2.8-2.9, prepare dos suspensiones separadas de 2 x 105 células / ml, una con células del control y otra con células de los cultivos de MΦ tratados.
    NOTA: Prepare 1 ml de suspensión de celda/ml para cada columna de la placa de 96 pozos que se llena y 0,75 ml para cada cámara de la corredera de la cámara de 4 pozos que se llena de acuerdo con el diseño de la placa.
  4. Aspire suavemente el medio desde los pozos experimentales de la placa de 96 pozos que contiene MSC. Utilizando una micropipeta multicanal, agregue 100 μL de las suspensiones de células MΦ tratadas y de control en los pozos experimentales apropiados con y sin MSC de acuerdo con el diseño de la placa. Incubar durante la noche.
  5. Aspire suavemente el medio desde el portaobjetos de la cámara de 4 pozos que contiene MSC y, utilizando una micropipeta, agregue 530 μL de suspensión de células MΦ a los pozos apropiados de acuerdo con el diseño. Incubar durante la noche.

5. Ensayo de fagocitosis, lectura cinética fluorescente de 96 póyes, día 3

  1. Establecer los parámetros del ensayo
    1. El día del ensayo, encienda el lector de placas fluorescentes y ajuste por computadora la temperatura del sistema a 37 ° C.
    2. Abra el software system Pro y verifique el icono del instrumento en la esquina superior izquierda para determinar si el instrumento está conectado a la computadora. Si el círculo rojo con una línea está visible, haga clic en el icono del instrumento y elija el instrumento en la ventana emergente para realizar la conexión.
    3. Seleccione Nuevo experimento para acceder a la ventana emergente Ayudante de configuración de placas. En el menú Ayudante de configuración de placas, seleccione Configurar los ajustes de adquisición.
    4. Seleccione Monocromador en el menú de configuración de la configuración óptica. Seleccione FL (fluorescencia) para el modo de lectura y Kinetic para el tipo de lectura.
    5. En la misma ventana de configuraciones, en Categoría, haga clic en Longitudes de onday, a continuación, establezca los anchos de banda en 9 nm para la excitación y 15 nm para la emisión.
    6. Establezca el número de pares de longitud de onda en 1. Establezca las longitudes de onda LM1 a 510 nm para la excitación y a 540 nm para la emisión.
    7. Continúe por las categorías y seleccione Tipo de placa a continuación. Seleccione la opción que coincida con el tipo de placa que se está utilizando.
      NOTA: Es importante que la selección coincida con el tipo de placa. Las alturas de lectura son establecidas por el sistema de acuerdo con la selección.
    8. A continuación, seleccione Área de lectura y resalte el área de la placa de 96 pozos incluida en el diseño experimental.
    9. Seleccione PMT y Óptica,establezca GANANCIA DE PMT en Alta y Destellos por lectura en 6. Marque la casilla junto a Leer desde abajo si usa una placa de fondo transparente.
    10. Seleccione Temporización y establezca intervalos de 10 minutos durante un período de 70 minutos.
    11. Seleccione Agitar, marque la casilla Antes de la primera lectura y establezca en 5 s. Marque la casilla Entre lecturas y establezca 3 s. Ajuste la intensidad de agitación tanto para Bajo como para Lineal.
    12. Cierre la ventana. Cuando aparezca la ventana Ayudante de configuración de placas, seleccione Configurar el diseño de placas. Resalte los pozos BL del diseño de la placa y haga clic en Plate Blank.
    13. Resalte cada una de las filas experimentales, haga clic en Agregar,asigne un nombre al grupo y, a continuación, seleccione un color.
    14. En Opciones de asignación debajo del diseño de la placa, seleccione Seriey, a continuación, defina la serie en la ventana y haga clic en Aceptar. Repita para cada grupo.
  2. Preparar la suspensión zymosan
    1. Mientras espera que la temperatura del sistema alcance los 37 °C, resuspenda 1 mg de partículas de zymosan en 5 ml del medio de imágenes de células vivas.
      1. Agregue 1 ml de medio de imágenes de células vivas al vial que contiene las partículas y recójalas en un tubo de cultivo de vidrio. Enjuague el vial con 1 ml adicional de solución de imágenes y transfiéralo al mismo tubo de vidrio para asegurarse de que se transfieran todas las partículas. Agregue 3 ml de solución de imagen adicional para lograr una suspensión de partículas de 0,2 mg/ml.
    2. Vórtice con pulsos rápidos para 30-60 s. Luego, use un sonicador de sonda para sonicar con 60 pulsos rápidos.
      NOTA: Es muy importante crear una suspensión homogénea de partículas y no dejar que la suspensión repose demasiado tiempo antes de agregarla a los pozos experimentales. La aglomeración se repite rápidamente. La densidad de partículas por célula puede necesitar ser optimizada dependiendo de la fuente, el tratamiento y la densidad de MΦ utilizada. En los estudios presentados se utilizaron partículas de zymosan conjugadas. Sin embargo, E. coli conjugada y S. aureus también están disponibles.
  3. Añadir zymosan y leer el plato
    1. Aspire el medio de los pozos experimentales y enjuague 1x con 100 μL de la solución de imágenes de células vivas. Enjuague los pozos RBL con la solución de imágenes de células vivas también.
    2. Aspirar la solución de imágenes de células vivas de pozos experimentales y RBL y sustituirla por 100 μL de la suspensión de partículas de zymosan preparada en la sección 5.2.
    3. Abra la bandeja de placas del lector fluorescente utilizando la interfaz del panel táctil. Coloca la placa, sin tapa, en la bandeja con el pozo A1 en la esquina superior izquierda. Cierre la bandeja con el panel táctil y haga clic en el botón verde Leer en el menú superior.
    4. Cuando se complete la lectura, guarde el archivo en la carpeta correspondiente y exporte los datos en un formato de hoja de cálculo haciendo clic en Archivo y seleccionando Exportar.
    5. Calcule la media ± fluorescencia relativa SEM para cada grupo de réplica en cada punto de tiempo (10 min, 20 min, 30 min, etc.) en la hoja de cálculo(Archivo complementario 1)y transfiera los datos al software de gráficos.
    6. Utilice un formato de gráfico de líneas para presentar los datos y aplicar ANOVA bidireccional (Time x Treatment/MSC as factors) seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Tukey para determinar las diferencias entre los grupos individuales.
      NOTA: Mientras la lectura de la placa de 96 pozos está en curso, prepare la placa de imagen dinámica para la adquisición de imágenes de lapso de tiempo. Asegúrese de que la imagen dinámica proceda con el análisis de un pozo experimental a la vez.

6. Ensayo de fagocitosis, imágenes dinámicas, Día 3

  1. Encienda el sistema de imágenes y la computadora. Haga doble clic para abrir el software. Seleccione el modo de programa Pro.
  2. Verifique el área del escenario para asegurarse de que no haya muestras presentes y que nada esté impidiendo el movimiento del escenario. Luego, haga clic en Calibrar ahora.
  3. En el menú Incubación de la barra lateral de la derecha, marque la casilla situada junto a la Unidad H XL y configúrela a 37 °C.
    NOTA: Espere hasta que la etapa incubada esté casi a la temperatura antes de preparar las muestras para la obtención de imágenes.
  4. Enjuagar el primer pozo experimental con 750 μL de medio de imagen y sustituirlo por 400 μL de la suspensión de partículas de zymosan preparada en la sección 5.2. Deje los pozos restantes en el medio de crecimiento.
    NOTA: Puede ser necesario volver a ensotrar y sonicar la suspensión de partículas brevemente si se ha asentado durante más de 15 minutos.
  5. Coloque la diapositiva en la etapa incubada del sistema de imágenes. Establezca un temporizador durante 10 minutos.
  6. Utilice el software de imágenes, seleccione Brightfield en la pestaña Localizar y, a continuación, haga clic en el icono del ocular en la ventana de configuración del sistema a continuación. Con el objetivo 10x en su lugar, use el ocular y la perilla de enfoque para enfocar las células.
  7. Seleccione la ficha Adquisición, utilice el menú desplegable Experimento y, a continuación, seleccione un conjunto de longitudes de onda que incluya el conjunto de filtros EGFP para acomodar las longitudes de onda de emisión de excitación de 509 nm y 533 nm del colorante sensible al pH.
  8. Cuando queden ~ 2 minutos en el temporizador, use el software para cambiar el objetivo a 20x haciendo clic en el icono de 20x en el menú de objetivos.
    1. Haga clic en el menú Canales, seleccione filtros EGFP y use el menú Exposición para establecer el tiempo de exposición en 400 ms para detectar el fluoróforo verde sensible al pH una vez que se ha encerrado en el faglisosoma.
    2. Haga clic en Live y ajuste el enfoque usando la perilla de enfoque.
  9. Haga clic en Detener para apagar la luz y marque la casilla junto a la configuración experimental de lapso de tiempo en la parte superior.
  10. En el menú Estrategia de enfoque, seleccione Enfoque automático de software. En el menú desplegable del menú Enfoque automático, seleccione Ajustes inteligentes y gruesos para reducir el tiempo de exposición a la luz mientras se ejecuta el enfoque automático.
  11. En el menú Lapso de tiempo, establezca el número deseado de adquisiciones en 30-60 y el tiempo de intervalo en 1 minuto.
  12. Después de establecer los parámetros de lapso de tiempo y después de 10 minutos de adición de partículas al primer pozo, haga clic en el botón Iniciar experimento para comenzar la adquisición.
  13. Cuando la adquisición se complete utilizando el primer pozo experimental, repita los pasos 6.4-6.12 para cada uno de los pozos experimentales restantes.
  14. Guarde todos los archivos del experimento con la fecha y los parámetros del título en la carpeta correspondiente.
  15. Cierre el software. Vuelva a abrir el software en modo de procesamiento y exporte los archivos en formato MP4 utilizando el menú Exportar.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

Después de calcular la media ± SEM para cada grupo en todos los puntos de tiempo, los datos se presentan en formato de gráfico de líneas con el eje Y como la intensidad fluorescente relativa y el eje X como tiempo. El archivo complementario 1 proporciona un ejemplo de datos sin procesar de una lectura cinética de la placa de 96 pozos en formato de hoja de cálculo.

En este estudio, los resultados óptimos presentados en la Figura 3Ay la Tabl...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

El análisis de la fagocitosis utilizando biopartículas conjugadas a un colorante sensible al pH es una herramienta relativamente nueva que ha demostrado ser ventajosa sobre las partículas tradicionales etiquetadas con fluorescentes12,19,20. Con las partículas tradicionales etiquetadas con fluorescentes, solo es factible el análisis de punto final. La detección se realiza con microscopía fluorescente y/o espectrofluorometría desp...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por el mecanismo del Instrumento Principal de Investigación de la NSF bajo los números de subvención 1626093 y 1919583.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Microplaca de poliestireno negro de 96 pocillosMilliporeSigmaCLS3603-48EA
0,4% solución azul de tripanoMilliporeSigmaT8154-20ML
Tubos de centrífuga de polipropileno estéril cónicos de 15 mL y 50 mLThermoFisher ThermoFisher339653
Cubreobjetos de 4 pocillos con pocillos no extraíblesThermoFisher155382PK
Antibiótico-Antimicótico (100X)  Sistema de imagen GibcoThermoFisher15240096
Axiobserver 7Zeiss
Albúmina sérica bovina (BSA)MilliporeSigmaA8806-1G
Elevador de célulasMilliporeSigmaCLS3008-100EA
Matraces de cultivo, tratamiento con cultivo de tejidos, superficie 75  cm2, cuello inclinado, con capuchón, filtradoMilliporeSigmaC7231-120EA
D1 ORL UVA [D1]ATCCCRL-12424Línea Celular MSC de Ratón
DMEM, Alta GlucosaThermoFisher11965092
Suero Bovino Fetal, calificado, inactivado por calorHemocitómetro ThermoFisher16140071
FisherScientific02-671-51B
I-11.15ATCCCRL-2470Ratón MΦ Línea celular
LADMAC Línea celularATCCCRL-2420Las células LADMAC secretan el factor de crecimiento factor estimulante de colonias 1 (CSF-1).
Solución de imagen de células vivasThermoFisherA14291DJ
PBS, pH 7.4ThermoFisher10010031
pHrodo Green Zymosan Biopartículas ConjugadasThermoFisherP35365
Murina recombinante IFN-γPreprotech315-05
Spectramax i3XMolecular Devices Unidades
estériles de filtro al vacío de un solo uso, 250 mL, 0,2 y micro; mThermoFisher568-0020
Filtros de jeringa estériles, 0,2 micrómetrosThermoFisher723-2520
Placas de cultivo tratadas para cultivo de tejidos, 100 mm x 20 mmMilliporeSigmaCLS430167-100EA
Tripsin-EDTA (0,05%), rojo fenolThermoFisher25300054

Referencias

  1. Phinney, D. G., Prockop, D. J. Concise review: Mesenchymal stem/multipotent stromal cells: The state of transdifferentiation and modes of tissue repair--current views. Stem Cells. 25 (11), 2896-2902 (2007).
  2. Bernardo, M. E., Fibbe, W. E. Mesenchymal stromal cells: sensors and switchers of inflammation. Cell Stem Cell. 13 (4), 392-402 (2013).
  3. Tobin, L. M., Healy, M. E., English, K., Mahon, B. P. Human mesenchymal stem cells suppress donor CD4(+) T cell proliferation and reduce pathology in a humanized mouse model of acute graft-versus-host disease. Clinical and Experimental Immunology. 172 (2), 333-348 (2013).
  4. Giuliani, M., et al. Long-lasting inhibitory effects of fetal liver mesenchymal stem cells on T-lymphocyte proliferation. PLoS One. 6 (5), 19988(2011).
  5. Plumas, J., Chaperot, L., Richard, M. J., Molens, J. P., Bensa, J. C., Favrot, M. C. Mesenchymal stem cells induce apoptosis of activated T cells. Leukemia. 19 (9), 1597-1604 (2005).
  6. Luz-Crawford, P., et al. Mesenchymal stem cells generate a CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cell population during the differentiation process of Th1 and Th17 cells. Stem Cell Research & Therapy. 4 (3), 65(2013).
  7. Waterman, R. S., Tomchuck, S. L., Henkle, S. L., Betancourt, A. M. A new mesenchymal stem cell (MSC) paradigm: Polarization into a pro-inflammatory MSC1 or an Immunosuppressive MSC2 phenotype. PLoS One. 5 (4), 10088(2010).
  8. Nemeth, K., et al. marrow stromal cells attenuate sepsis via prostaglandin E(2)-dependent reprogramming of host macrophages to increase their Interleukin-10 production. Nature Medicine. 15 (1), 42-49 (2009).
  9. Maggini, J., et al. Mouse Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stromal Cells Turn Activated Macrophages into a Regulatory-Like Profile. PLoS One. 5 (2), 9252(2010).
  10. Takizawa, N., et al. marrow-derived mesenchymal stem cells propagate immunosuppressive/anti-inflammatory macrophages in cell-to-cell contact-independent and-dependent manners under hypoxic culture. Experimental Cell Research. 358 (2), 411-420 (2017).
  11. Kim, J., Hematti, P. Mesenchymal stem cell-educated macrophages: a novel type of alternatively activated macrophages. Experimental Hematology. 37 (12), 1445-1453 (2009).
  12. Evans, J. F., Salvador, V., George, S., Trevino-Gutierrez, C., Nunez, C. Mouse aorta-derived mesenchymal progenitor cells contribute to and enhance the immune response of macrophage cells under inflammatory conditions. Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 56(2015).
  13. Cho, D. I., et al. Mesenchymal stem cells reciprocally regulate the M1/M2 balance in mouse bone marrow-derived macrophages. Experimental Molecular Medicine. 46, 70(2014).
  14. Fernandez, N., et al. Mouse mesenchymal progenitor cells expressing adipogenic and osteogenic transcription factors suppress the macrophage inflammatory response. Stem Cells International. 2017, 5846257(2017).
  15. Jackson, M. V., et al. Mitochondrial transfer via tunneling nanotubes is an important mechanism by which mesenchymal stem cells enhance macrophage phagocytosis in the in vitro and in vivo models of ARDS. Stem Cells. 34 (8), 2210-2223 (2016).
  16. Chaplin, D. D. Overview of the immune response. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (2), Suppl 2 3-23 (2010).
  17. Lim, J., et al. Characterizing the mechanisms of nonopsonic uptake of cryptococci by macrophages. Journal of Immunology. 200 (10), 3539-3546 (2018).
  18. Wang, Z., et al. Interferon-γ inhibits nonopsonized phagocytosis of macrophages via an mTORC1-c/EBP pathway. Journal of Innate Immunity. 7 (2), 165-176 (2015).
  19. Lindner, B., Burkard, T., Schuler, M. Phagocytosis assays with different PH-sensitive fluorescent particles and various readouts. Biotechniques. 68, 245-250 (2020).
  20. Kapellos, T. S., et al. A novel real time imaging platform to quantify macrophage pahgocytosis. Biochemical Pharmacology. 116, 107-119 (2016).
  21. Takahashi, D., et al. Flow cytometric quantitation of platelet phagocytosis by monocytes using a pH-sensitive dye, pHrodo-SE. Journal of Immunological Methods. 447, 57-64 (2017).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Etiquetas

C lulas madre mesenquimalesM todo de cocultivoInmunidad innataEnsayo de fagocitosisPart culas de zimosanoImagen fluorescenteInterfer n gammaRecuento celularFluorescencia del fagolisosoma
Regulación de células madre mesenquimales de la fagocitosis de macrófagos; Cuantificación e imágenes
Contáctenos
Recomendar a la biblioteca

Privacidad

Términos de uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados.