Medición del pH, las químicas redox y la capacidad degradativa de los macropinosomas mediante microscopía ratiométrica de fluoróforo dual

Resumen

Describimos protocolos para medir el pH, los eventos oxidativos y la digestión de proteínas en macropinosomas individuales en células vivas. Se hace hincapié en la microscopía ratiométrica de fluoróforos duales y las ventajas que ofrece sobre las técnicas basadas en la población.

Resumen

En los últimos años, el campo de la macropinocitosis ha crecido rápidamente. La macropinocitosis ha surgido como un mecanismo central por el cual las células inmunes innatas mantienen la homeostasis y la inmunidad del organismo. Simultáneamente, y en contraste con su papel homeostático, también puede conducir a diversas patologías, incluyendo el cáncer y las infecciones virales. A diferencia de otros modos de endocitosis, las herramientas desarrolladas para estudiar la maduración de los macropinosomas permanecen subdesarrolladas. Aquí el protocolo describe herramientas recientemente desarrolladas para estudiar el entorno redox dentro de la luz de los macropinosomas tempranos y en maduración. Se describen metodologías para el uso de la microscopía de fluorescencia ratiométrica en la evaluación del pH, la producción de especies reactivas de oxígeno y la capacidad degradativa dentro de la luz de macropinosomas individuales en células vivas. Las mediciones de orgánulos individuales ofrecen la ventaja de revelar la heterogeneidad espaciotemporal, que a menudo se pierde con los enfoques basados en la población. Se hace hincapié en los principios básicos de la microscopía fluorófora dual, incluida la selección de sondas, la instrumentación, la calibración y los métodos de una sola célula frente a los basados en la población.

Introducción

La macropinocitosis se refiere a la absorción de grandes cantidades de líquido extracelular en orgánulos citoplasmáticos unidos a la membrana llamados macropinosomas^1,2. Es un proceso altamente conservado realizado por organismos unicelulares de vida libre, como la ameba Dictyostelium spp. ³, así como antozoos⁴ y metazoos². En la mayoría de las células, la macropinocitosis es un evento inducido. La ligadura de los receptores de la superficie celular induce la protrusión de extensiones de membrana plasmática impulsadas por actina c....

Protocolo

1. Preparación de las células

1. Cultive células Raw264.7 a 37 °C y 5% de CO₂ a 70% de confluencia en RPMI suplementado con 10% de suero inactivado por calor.
2. Un día antes del ensayo, semuela células Raw264.7 a una densidad de 5 x 10⁴ células por pozo en una placa de 96 pozos. Asegúrese de que cada pozo contenga 100 μL de medio de crecimiento. Asegúrese de que la placa de 96 pozos tenga lados negros y un fondo de vidrio para obtener imágenes.
   NOTA: Aquí, se utilizaron placas de 96 pozos para la obtención de imágenes. Las placas de 96 pozos permiten el uso de cantidades más pequeñas de células y reactivos en relación con las cá....

Resultados

Al medir el pH del macropinosoma, hay un período de tiempo durante el cual no se puede medir la dinámica de la acidificación. Este período corresponde a la fase de carga de dextrano (cuadro gris en la Figura 2C y Figura 3C,D)y variará según el tipo de celda utilizada. La duración de la fase de carga variará con (i) la actividad macropinocítica de las células y (ii) la sensibilidad del instrumento utilizado. Se recomienda ajustar este período al .......

Discusión

Aunque hay una serie de protocolos para mediciones de bajo y alto rendimiento de la captación macropinocítica en macrófagos, fibroblastos e incluso Dictyostelium spp. ^3,7,31,32,33, muy pocos intentos se han hecho para medir la bioquímica luminal de estos compartimentos dinámicos. Esto probablemente se deba a una escasez de sondas que puedan dirigirse .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Placa de 96 pocillos de pared negra	PerkinElmer	6005430
CypHer5e, NHS	éster Cytiva PA15401
Dextrano-amino 70 kDa	Invitrogen	D1862
DQ-ovoalbúmina	Invitrogen	D12053
FITC-dextran 70 kDa	Invitrogen	D1823
HBSS	Gibco	14287
Nigericina	Sigma Aldrich	N7143
OxyBurst Green-SE	Invitrogen	D2935
pHrodo Red, SE	Invitrogen	P36600
Raw264.7 cells	ATCC	TIB-71
RPMI medio	Gibco 11875093
SP5 Microscopio Confocal	Leica	-
TRITC-dextran 70 kDa	Invitrogen	D1819
u-Dish	Ibidi	81156