Extracción del cofactor _F420 para el análisis de la longitud de la cola de poliglutamato a partir de cultivos puros metanogénicos y muestras ambientales

_F420 es un cofactor generalizado pero a menudo descuidado, que funciona como un transportador obligado de hidruro de dos electrones en los procesos metabólicos primarios y secundarios de archaea y bacteria1,2. _F420 es una 5-deazaflavina y estructuralmente similar a las flavinas, por lo que sus propiedades químicas y biológicas son más comparables con las de NAD⁺ o NADP⁺. Debido a la sustitución del nitrógeno por carbono en la posición 5 del anillo de isoaloxazina, es un fuerte reductor, exhibiendo así un bajo potencial redox estándar de -340 ^mV1,3. _F420 comprende un anillo de 5-deazaflavina y un enlazador de 2-fosfo-L-lactato (_F420-0). Una cola de oligoglutamato que contiene n+1 monómeros de glutamato se puede unir a la molécula (_F420-n+1)⁴.

Durante mucho tiempo, el cofactor _F420 se ha asociado únicamente con Archaea y Actinobacteria. Esto ha sido revocado en gran medida. Análisis recientes revelaron que _F420 se distribuye entre diversos organismos anaeróbicos y aeróbicos del filo Proteobacteria, Chloroflexi y potencialmente Firmicutes que habitan una miríada de hábitats como suelos, lagos y el intestino ^humano1,5. En 2019, Braga et ^al.6, demostraron que la proteobacterium Paraburkholderia rhizoxinica produce un derivado _F420 único, que contiene un 3-fosfoglicerato en lugar de una cola de 2-fosfolactato, que podría estar muy extendida en varios hábitats. Dentro del dominio Archaea, _F420 se ha encontrado en varios linajes, incluyendo órdenes ^{metanogénico7}, metanotrófico8,9 y reductor de ^sulfato10, y se supone que se produce en Thaumarchaeota11. _F420 es mejor conocido como una coenzima redox esencial en la metanogénesis hidrogenotrófica y metilotrófica. La forma reducida de _F420 (_F420H2) funciona como donante de electrones para la reducción de metilentetrahidrometanopterina (metileno-H4MPT, Mer) y metenil-H4MPT12,13. También se puede utilizar como portador de electrones en vías de transporte de electrones independientes de _H2 de metanógenos que contienen ^{citocromos12,14}. Además, la forma oxidada de _F420 tiene una fluorescencia azul-verde característica al excitarse a 420 nm, lo que facilita la detección de metanógenos microscópicamente (Figura 1). Debido a su bajo potencial redox, _F420 facilita (i) la reducción exógena de un amplio espectro de compuestos orgánicos recalcitrantes o tóxicos, (ii) la síntesis de antibióticos o fitotoxinas de tetraciclina y lincosamida en estreptomicetos (filo Actinobacteria), y (iii) resistencia al estrés oxidativo o nitrosativo u otras condiciones desfavorables en micobacterias (filo Actinobacteria)^1,5,15, 16,17,18,19,20,21,22. En consecuencia, las oxidorreductasas dependientes de _F420 son biocatalizadores prometedores para fines industriales y farmacéuticos, así como para la biorremediación de ambientes ^{contaminados1,23}. A pesar de estos hallazgos recientes, las funciones exactas del cofactor _F420 todavía se conocen marginalmente en Actinobacteria u otros filos bacterianos.

Existen al menos tres vías para la biosíntesis _F4202,6,24. Al principio, la vía de biosíntesis se divide en una biosíntesis de 5-deazaflavina y una rama del metabolismo de 2-fosfolactato. La parte reactiva de la molécula _F420 se sintetiza a través de la _FO-sintasa utilizando los sustratos tirosina y 5-amino-6-ribitylamino-2,4(1H, 3H)-pirimidinediona. El resultado es el cromóforo de nivel de riboflavina _FO. Dentro de la rama del metabolismo del lactato actualmente aceptada, el L-lactato es fosforilado a 2-fosfo-L-lactato por una L-lactato quinasa (CofB); El 2-fosfo-L-lactato, a su vez, es guanilado a L-lactilo-2-difosfo-5'-guanosina por la 2-fosfo-L-lactato guanililtransferasa (CofC). En el siguiente paso, L-lactyl-2-diphospho-5'-guanosine está unida a _FO por una 2-fosfo-L-lactato transferasa (CofD) para formar _F420-02. Finalmente, la enzima _F420-0:ɣ-glutamil ligasa (CofE) liga los monómeros de glutamato a _F420-0, formando el cofactor ^final6 en números ^{variables23,25}. Diferentes organismos muestran diferentes patrones en el número de residuos de glutamato adheridos, encontrándose colas más cortas para los metanógenos que en las micobacterias2,25,26. En general, los metanógenos muestran longitudes de cola de dos a tres, con hasta cinco en el metanógeno acetoclástico, Methanosarcina sp., mientras que las longitudes de cola encontradas en Mycobacterium sp. variaron de cinco a siete residuos de glutamato2,25,26,27. Sin embargo, hallazgos recientes mostraron que _F420 de cadena larga se une a oxidorreductasas dependientes de _F420 con una afinidad más alta que _F420 de cadena corta; además, _F420 de cadena larga unida aumenta la afinidad del sustrato pero disminuye la tasa de recambio de las enzimas ^{respectivas23}.

La detección del cofactor _F420 a menudo se basa en su fluorescencia. De este modo, sus derivados de oligo glutamato se separaron mediante ^hplc27,28 de fase invertida (RP^). Recientemente, Ney et al. utilizaron hidróxido de tetrabutilamonio como reactivo de emparejamiento de iones para la cola de glutamato cargada negativamente para mejorar la separación en RP-HLPC con ^éxito5. Aquí, presentamos un método para la preparación de muestras, lisis posterior, extracción, purificación, separación y cuantificación del cofactor _F420 no solo de cultivos puros sino también de diferentes muestras ambientales (es decir, suelos y lodos digestores).

NOTA: La extracción y el análisis del cofactor _F420 es un proceso de tres pasos que incluye la lisis de la muestra, la prepurificación del cofactor a través de la extracción en fase sólida (SPE) y la detección del cofactor a través de RP-HPLC emparejado con iones (IP-RP-HPLC) con detección de fluorescencia. Antes de comenzar, prepare los materiales y reactivos como se indica en la Tabla 1.

1. Lisis de la muestra

1. Agregue hasta 5 g de muestra a los tubos apropiados (por ejemplo, tubos cónicos de 50 ml).
2. Añadir 5 ml del tampón de lisis (solución madre 2x, Tabla 1) a las muestras.
3. Llevar a un volumen final de 10 mL con agua destilada para alcanzar una concentración final de 0,5 g·^mL-1.
4. Vórtice las muestras diluidas durante 20 s.
5. Autoclave durante 30 min a 121 °C.
6. Para muestras secas como el suelo forestal, lleve a un volumen final de 20 ml con agua destilada después del autoclave y vórtice la muestra diluida.
   PRECAUCIÓN: El aumento de la temperatura durante el autoclave puede hacer que los tubos se rompan.

2. Prepurificación del cofactor F ₄₂₀ mediante extracción en fase sólida (SPE)

NOTA: Todos los pasos de SPE se llevan a cabo a temperatura ambiente

1. Enfríe las muestras a temperatura ambiente.
2. Centrifugar las muestras en autoclave durante 5 min a 11.000 x g.
3. Prepare columnas SPE de 5 ml llenas con 100 mg de sorbente polimérico de modo mixto de aniones débiles.
4. Acondicionar el intercambiador de aniones con 3 ml de metanol (solución de condición, Tabla 1).
5. Equilibrar el intercambiador de aniones con 3 ml de agua destilada (solución de equilibrio, Tabla 1).
6. Cargue hasta 9,0 ml del sobrenadante desde el lisado centrifugado en la columna SPE.
7. Lave las impurezas con 5 ml de acetato de amonio de 25 mM (solución de lavado SPE 1, Tabla 1).
8. Lave las impurezas con 5 ml de metanol (solución de lavado SPE 2, Tabla 1).
9. Elute el cofactor _F420 en 1,0 mL de tampón de elución (Tabla 1).
   NOTA: Prepare un nuevo búfer de elución. Debido al vacío aplicado y la alta presión de vapor del tampón de elución, los volúmenes de elución pueden diferir de una muestra a otra. Para asegurar el mismo volumen final en todas las muestras, se recomienda pesar los recipientes de recolección antes y después de la elución y calcular el volumen de elución efectivo. Equilibre las diferencias mediante la adición de un búfer de elución.

3. Detección del cofactor _F420

1. Ajuste el horno a 40 °C y el detector de fluorescencia a 420 nm de longitud de onda de extinción y 470 nm de longitud de onda de emisión. Lograr la separación mediante modo de gradiente utilizando las fases móviles A y B (Tabla 1): 0-3 min: 26% B; 3-24 min: 26%-50% B; 24-25 min: 50% B; 25-27 min: 50%-26% B; 27-35 min: 26% B a un caudal de 0,75 mL·^min-1.
   NOTA: Garantizar el equilibrio de las condiciones de la columna antes de inyectar las muestras enjuagando la columna al menos con 3 volúmenes de columna de 74% móvil fase A y 26% móvil fase B (Tabla 1).
   1. Filtre las muestras eluidas de la SPE en viales de HPLC utilizando un filtro de PTFE con un tamaño de poro de 0,22 μm.
      NOTA: Se recomiendan filtros de PTFE con un tamaño de poro de 0,22 μm.
   2. Inyecte 50 μL de la muestra eluida en el sistema HPLC para analizar la composición y concentración del cofactor _F420 .
      NOTA: Como no se utiliza ningún estándar cuantitativo en este protocolo, las muestras y variantes deben compararse por área de pico.

Los cultivos puros de Methanosarcina thermophila y Methanoculleus thermophilus, ambos arqueas metanogénicas termófilas, se cultivaron en medios adecuados como se describió anteriormente29,30. Para Methanosarcina thermophila, el metanol se utilizó como fuente de energía, mientras que Methanoculleus thermophilus se cultivó con H2 / CO2. El crecimiento se comprobó mediante evaluación microscópica, mientras que la actividad se examinó mediante la medición de metano (CH4) mediante cromatografía de gases como se describió anteriormente31. Se utilizaron cultivos puros para la extracción del cofactor F420 según el protocolo presentado. Además, en otoño de 2020 se tomaron muestras ambientales que incluían muestras de lodos de un reactor de biogás mesófilo (planta de tratamiento de aguas residuales, Zirl, Austria; para obtener detalles sobre los parámetros de los lodos, consulte 32), una pradera utilizada agrícolamente (Innsbruck, Austria) y suelo forestal (Lans, Austria) para la extracción y el análisis del cofactor F420.

El crecimiento de cultivos puros ha sido verificado por microscopía (Figura 1), con el CH4 producido analizado mediante cromatografía de gases durante 14 días de incubación (datos no mostrados). La eficiencia de la extracción del cofactor F420 de cultivos puros se probó mediante la aplicación de diferentes estrategias de desintegración: batido con latidos cerámicos de 0,5-1,0 mm, tratamiento ultrasónico y desintegración presión-temperatura utilizando 121 ° C y presión de 1,2 bar (autoclave). La máxima eficiencia de extracción se hizo evidente mediante el tratamiento de presión-temperatura aplicando un tampón como se describe en la sección de protocolo y, por lo tanto, se aplicó para todos los experimentos posteriores (Figura 2). Las pruebas de eficiencia de extracción se realizaron mediante la adición estándar de diferentes volúmenes de un cultivo de Methanoculleus thermophilus de buen crecimiento. Además, la comparación de diferentes muestras y variantes se basó en el área de pico de los cromatogramas.

Posteriormente, los extractos celulares se sometieron a un procedimiento de extracción en fase sólida (SPE). Para este propósito, se probaron diferentes intercambiadores de iones. Resultó que un sorbente polimérico de modo mixto de aniones débil produjo la mayor cantidad de cofactor F420 después de la elución. Además, se probaron diferentes tampones de elución y soluciones de lavado que mostraron los mejores resultados para acetato de amonio de 25 mM como tampón de lavado y una mezcla de NH3 en metanol como tampón de elución. El metanol de la etapa de elución podría intercambiarse después de la elución con agua a través de un tratamiento a temperatura de vacío.

El análisis HPLC del cofactor F420 se probó con diferentes columnas C18 con los mejores resultados para la configuración del sistema logrados durante el estudio presentado con una columna NX C18. Se utilizó un estándar que contenía una distribución conocida de derivados F420 con longitud variable de la cola de glutamato para fines de referencia. Este estándar fue amablemente proporcionado por el Prof. Colin Jackson de la Universidad Nacional de Australia. El análisis de la longitud de la cola de glutamato reveló diferencias en la concentración global del cofactor F420 y la distribución de la longitud de la cola F420 de cultivos puros metanogénicos y muestras ambientales (Figura 3).

Tabla 1: Composición de fases móviles y tampón para extracción en fase sólida (SPE) y análisis hpLC. 

Figura 1: Cultivo puro metanogénico fluorescente. Visualización de Methanosarcina thermophila mediante microscopía de contraste de fase (A) y microscopía de fluorescencia (B) cuando el cofactor F420 se excita con luz UV (excitación a 395-440 nm y emisión a 475-495 nm). Barra de escala: 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Adición estándar. Área pico del cofactor F420 recuperado después de SPE de 1,0 g de matriz con diferentes volúmenes de cultivos de M. thermophilus . Matrix se modificó con 0 μL, 250 μL, 500 μL, 750 μL y 1000 μL de cultivo y se sometió a diferentes estrategias de desintegración: beat-beating, tratamiento ultrasónico y desintegración presión-temperatura (autoclave). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Distribución de la longitud de la cola de glutamato. Distribución de la longitud de la cola del cofactor F420 de cultivos puros y muestras ambientales. De arriba a abajo: prado (suelo) utilizado agrícolamente, bosque (suelo), reactor de biogás mesófilo, cultivo puro de M. thermophilus y cultivo puro de M. thermophila. La absorbancia relativa se calculó mediante normalización en el pico más alto dentro del cromatograma mostrado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores no tienen nada que revelar.