Definición de las funciones genéticas en la tumorigénesis mediante la ablación ex vivo de alelos floxados en células tumorales malignas de la vaina del nervio periférico

Jody  Fromm Longo; Stephanie N. Brosius; Steven L. Carroll

doi:10.3791/62740

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Artículo de método

Definición de las funciones genéticas en la tumorigénesis mediante la ablación ex vivo de alelos floxados en células tumorales malignas de la vaina del nervio periférico

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DOI:

10.3791/62740

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25 de agosto de 2021

Jody Fromm Longo¹ , Stephanie N. Brosius²^,³ , Steven L. Carroll¹

¹Department of Pathology and Laboratory Medicine, Medical University of South Carolina, ²Department of Pediatrics and Neurology, Perelman School of Medicine of the University of Pennsylvania, ³Division of Child Neurology, Children's Hospital of Philadelphia

En este artículo

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para realizar knockouts de genes que son embrionarios letales in vivo en tumores derivados de modelos de ratón genéticamente modificados y luego evaluamos el efecto que el knockout tiene sobre el crecimiento tumoral, la proliferación, la supervivencia, la migración, la invasión y el transcriptoma in vitro e in vivo.

Resumen

El desarrollo de nuevos fármacos que se dirigen con precisión a proteínas clave en los cánceres humanos está alterando fundamentalmente la terapéutica del cáncer. Sin embargo, antes de que estos medicamentos puedan ser utilizados, sus proteínas diana deben ser validadas como dianas terapéuticas en tipos específicos de cáncer. Esta validación a menudo se realiza eliminando el gen que codifica el objetivo terapéutico candidato en un modelo de cáncer de ratón genéticamente modificado (GEM) y determinando qué efecto tiene esto en el crecimiento del tumor. Desafortunadamente, los problemas técnicos como la letalidad embrionaria en los knockouts convencionales y el mosaicismo en los knockouts condicionales a menudo limitan este enfoque. Para superar estas limitaciones, se desarrolló un enfoque para ablacionar un gen letal embrionario floxed de interés en cultivos a corto plazo de tumores malignos de la vaina nerviosa periférica (MPNST) generados en un modelo GEM.

Este artículo describe cómo establecer un modelo de ratón con el genotipo apropiado, derivar cultivos tumorales a corto plazo de estos animales y luego extirpar el gen letal embrionario floxed utilizando un vector adenoviral que expresa Cre recombinasa y proteína fluorescente verde mejorada (eGFP). A continuación, se detalla la purificación de las células transducidas con adenovirus mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) y la cuantificación de los efectos que la ablación génica ejerce sobre la proliferación celular, la viabilidad, el transcriptoma y el crecimiento del aloinjerto ortotópico. Estas metodologías proporcionan un enfoque eficaz y generalizable para identificar y validar dianas terapéuticas in vitro e in vivo. Estos enfoques también proporcionan una fuente renovable de células derivadas de tumores de bajo paso con artefactos de crecimiento in vitro reducidos. Esto permite estudiar el papel biológico del gen objetivo en diversos procesos biológicos como la migración, la invasión, la metástasis y la comunicación intercelular mediada por el secretoma.

Introducción

Antes de las últimas dos décadas, el tratamiento de los cánceres humanos se basaba en gran medida en la radioterapia y los agentes quimioterapéuticos que se dirigían ampliamente a las poblaciones celulares que proliferaban rápidamente al dañar el ADN o inhibir la síntesis de ADN. Aunque estos enfoques inhibieron el crecimiento de células cancerosas, también tuvieron efectos secundarios perjudiciales en los tipos de células normales que proliferan rápidamente, como las células epiteliales intestinales y las células del folículo piloso. Más recientemente, la terapia contra el cáncer ha comenzado a utilizar agentes quimioterapéuticos que se dirigen con precisión a las pr....