Microscopía de hoja de luz de dinámica cardíaca rápida en embriones de pez cebra

Para descubrir los eventos complejos y las interacciones en el corazón que late temprano, se requieren imágenes in vivo de todo el órgano. Con su mínima fototoxicidad1,2,3, bajo fotoblanqueo4 y alta velocidad, la microscopía de lámina de luz ha evolucionado como la principal herramienta de imagen para el desarrollo embrionario y ^cardíaco5,6. Ha proporcionado información sobre la forma y la función cardíaca a una alta resolución espacial y ^{temporal7,8,9} y ha permitido a los investigadores obtener imágenes y rastrear partes del corazón marcadas fluorescentemente a alta velocidad, estudiar las fuerzas hemodinámicas y seguir el desarrollo del corazón directamente dentro del cuerpo de los embriones en desarrollo6,10,11,12.

Para restringir de manera precisa y reproducible el pez cebra en el campo de visión, existen una variedad de protocolos de incrustación para láminas ligeras, a corto y largo plazo, así como una sola o múltiple muestra13,14,15,16,17,18,19. El protocolo más común implica la inmovilización de tricaína y el montaje de agarosa dentro de un tubo de vidrio o plástico. Sin embargo, como la frecuencia cardíaca puede cambiar debido a la temperatura, los anestésicos y el material de incrustación utilizado20,21,22, las imágenes cardíacas del pez cebra requieren protocolos específicos y suaves para garantizar la salud de la muestra6,8,11,12,20,21,22,23 . Para imágenes a corto plazo (hasta una hora), se puede anestesiar el pescado en 130 mg / L de tricaína e incrustarlo en tubos de etileno propileno fluorado (FEP) con solución de agarosa al 0.1% y un tapón, como se describe en Weber et al. ²⁰¹⁴¹⁶. Sin embargo, como la tricaína puede conducir a defectos de ^{desarrollo20,22}, se deben utilizar diferentes protocolos para la obtención de imágenes a largo plazo.

Aquí describimos una nueva estrategia para la obtención de imágenes cardíacas a largo plazo. Si bien existen muchas implementaciones de hojas de ^luz24, recomendamos usar una muestra colgante en un microscopio T-SPIM (una detección y dos lentes de iluminación en un plano horizontal con la muestra colgando verticalmente en el foco común). Esto proporciona la libertad de movimiento y rotación necesaria para el posicionamiento preciso de la muestra. Los peces se inmovilizan inyectando 30 pg α-bungarotoxin mRNA en la etapa de una o dos células. α-bungarotoxina es un veneno de serpiente que paraliza los músculos sin afectar el desarrollo cardiovascular ni la ^{fisiología22}. Para obtener imágenes precisas y sin distorsión, recomendamos montar peces en tubos hechos de FEP, un polímero con un índice de refracción casi idéntico al agua. Discutimos cómo preparar mejor los tubos FEP enderezándolos y limpiándolos antes de la toma de imágenes. Los peces se montan en estos tubos, con la cabeza hacia abajo, en medios, y la parte inferior del tubo se sella con un tapón de agarosa al 2%, sobre el que descansan las cabezas de los peces. Los orificios de corte en el tubo FEP facilitan el intercambio de gases y aseguran el crecimiento de los peces. El pez incrustado se puede mantener en medios hasta que se monta en un soporte de muestra justo antes de la toma de imágenes. También sugerimos una canalización de adquisición y análisis de datos para imágenes reproducibles de alta velocidad. Además, discutimos el uso de líneas transgénicas de marcadores citoplasmáticos versus marcadores de membrana para el etiquetado robusto de células cardíacas, así como diferentes opciones para detener el corazón. Estas técnicas de montaje aseguran la salud de la muestra al tiempo que permiten restringir el corazón de manera precisa y reproducible en el campo de visión.

Todos los adultos y embriones de pez cebra (Danio rerio) se manejaron de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de UW-Madison.

1. Preparación del pez cebra

1. Manejar el pez cebra de acuerdo a los protocolos ^{establecidos25,26} y lineamientos institucionales. Criar peces adultos de línea transgénica deseada (ver Discusión). Recoge los embriones y mantenlos a 28 °C en una placa de Petri llena de pescado medio, por ejemplo, ^E327.
2. Elija un método de inmovilización (consulte Discusión).
   1. Si utiliza ARNm de α-bungarotoxina para inmovilizar a los peces, inyecte 30 pg ^mRNA22 en la yema de embriones en estadio de una o dos células utilizando una aguja de vidrio perforada montada en un micromanipulador y conectada a un picoinyector28.
   2. Si usa tricaína, haga una solución madre al 0.4% tamponada a pH 7.0-7.4 con 1 M de base Tris y guárdela a -20 ° C hasta la toma de imágenes.
3. Mantenga los huevos en una placa de Petri llena de E3 a 28 ° C y transfiera los huevos cada 24 h a un plato nuevo con E3 fresco hasta la toma de imágenes.
4. Para prevenir la formación de pigmentos, si el fondo del pez cebra no es albino, transfiera el pescado a las 24 h después de la fertilización (hpf) a un nuevo plato E3 con 0,2 mM inhibidor de la tirosinasa 1-fenil 2-tiourea (ver Discusión).

2. Preparación de tubos FEP

Figura 1: Limpieza y enderezamiento de tubos FEP. a) Tubos FEP en un tambor de cable. b) Tubos FEP antes de enderezarlos. c) Tubos FEP en tubos de vidrio y acero aptos para autoclaves. d) Enjuague de los tubos FEP después de enderezar y enfriar. e) Tubo FEP cortado al tamaño de un tubo centrífugo para sonicación. f) Lavado de tubos FEP después de la sonicación. g) Almacenamiento de los tubos FEP limpios y enderezados en un tubo de centrífuga. (h) Corte del tubo FEP antes de la toma de imágenes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

1. Endereza los tubos FEP (Figura 1a,b) colocándolos en un tubo de vidrio o acero seguro para autoclave (Figura 1c) con el diámetro interior correcto para adaptarse a los tubos FEP, generalmente 1.6 o 2.4 mm, y autoclave a 180 °C durante 2 h. Deje que los tubos se enfríen a temperatura ambiente durante al menos 5 h. Luego, retire de los tubos de enderezamiento.
   NOTA: Use guantes al manipular los tubos y trabaje con tubos de 50 cm a la vez.
2. Limpie los tubos FEP.
   NOTA: Se recomiendan jeringas con punta de aguja roma del tamaño del tubo FEP interno por seguridad, pero una aguja regular funcionará.
   1. Enjuague los tubos con 1 M de NaOH dos veces con una jeringa de 50 ml (Figura 1d).
   2. Corte los tubos FEP al tamaño de un tubo centrífugo de 50 ml con una cuchilla de afeitar (Figura 1e), coloque los tubos cortados en tubos de centrífuga llenos de NaOH de 0,5 M y ultrasónico durante 10 minutos.
   3. Enjuague los tubos FEP con _H2O de doble destilación, luego repita el lavado con etanol al 70% (Figura 1f).
   4. Transfiera los tubos al 70% de etanol y ultrasonido durante 10 min.
   5. Enjuague los tubos con _H2O de doble destilación y guárdelos en tubos de centrífuga en _H2O de doble destilación (Figura 1g).

3. Preparación del plato de agarosa al 2%

1. En un matraz de vidrio, disuelva el polvo de agarosa de bajo punto de fusión en E3. Calentar la solución en un microondas y removerla cada 20 s, hasta que todo el polvo se disuelva.
2. Vierta la agarosa en una placa de Petri de vidrio o plástico para hacer una capa de 1-2 mm. Espere hasta que la agarosa se solidifique.
3. Para almacenar, vierta suavemente E3 en la parte superior del agar para evitar que se seque. Envolver en película de parafina y conservar a 4 °C.

4. Preparación de medios de inserción

1. Prepare suficiente E3 para llenar la cámara de muestras.
   NOTA: Evite el uso de azul de metilo si el medio está en contacto con lentes objetivas.
2. Si usa tricaína, descongele la solución madre y agregue 0.02% de tricaína a E3.

5. Montaje de la muestra

Figura 2: Montaje de embriones en tubo FEP. (a) Peces anestesiados sin pigmento en medios de montaje. b) Una jeringa con aguja de extremo romo y tubo FEP conectado. (c) Una vez que los medios y los peces estén recogidos en el tubo FEP, corte el tubo en el borde de la aguja. d) Sumergir el tubo cortado en un plato recubierto con agarosa al 2% para tapar su extremo. e) Un pez cebra en un tubo FEP enchufado. f) Cortar suavemente el tubo FEP a 30° para crear orificios de intercambio de gases. g) Tubo FEP con cuatro orificios por encima de un pez cebra incrustado. h) Esquema de un pez cebra incrustado en un tubo FEP. Se indican agujeros y tapón de agar. (i) Múltiples peces cebra incrustados listos para la obtención de imágenes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

1. Con una pipeta de vidrio desechable, transfiera el pescado a un medio de incrustación (Figura 2a). Si usa tricaína, transfiera el pescado a una placa de Petri llena de E3 que contenga tricaína, 10 minutos antes de la toma de imágenes. En ambos casos, vea bajo un estereomicroscopio para verificar que el pez dejó de moverse y que el corazón está latiendo a la misma velocidad en comparación con el control.
2. Corte el tubo FEP a la longitud ideal con una cuchilla de afeitar (Figura 1h).
   NOTA: La longitud debe ajustarse al soporte de la muestra del microscopio; la longitud típica es de unos 3 cm.
3. Prepare una jeringa con una cánula de extremo romo. Llene la jeringa con aire, luego monte el tubo FEP en la aguja y enjuague suavemente el agua restante vaciando la jeringa (Figura 2b).
   NOTA: Evite hacer burbujas eliminando lentamente el aire.
4. Con el tubo FEP montado en la jeringa, primero, tome los medios para llenar el tubo FEP, luego tome una cabeza de embrión hacia abajo. Mantenga la cabeza del pez lo más cerca posible del extremo del tubo. Evite hacer burbujas; si hay una burbuja presente, deseche la muestra.
5. Con una cuchilla de afeitar, corte cuidadosamente el tubo FEP en el borde de la cánula o aguja del extremo romo (Figura 2c).
6. Deseche cualquier líquido en la parte superior del plato recubierto de agar. Sumerja el tubo FEP directamente en el agar (Figura 2d). Gire el tubo y sáquelo para liberar el tapón de la cama de agarosa.
7. Debajo de un estereoscopio, verifique la presencia del tapón de agar en el extremo del tubo (Figura 2e).
8. Para obtener imágenes a largo plazo, corte de 3 a 5 orificios en el tubo FEP en cada dirección cardinal, al menos 5 mm por encima del extremo del pez.
   1. Debajo de un estereoscopio, use una hoja de afeitar perpendicular al eje del tubo para hacer una incisión de 30 ° en el tubo FEP hasta llegar al medio de montaje (Figura 2f).
   2. Haga un segundo corte a 180° para crear un agujero (Figura 2g,h).
9. Cabeza de embrión montada en transferencia hacia abajo en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml con medios de incrustación hasta que esté listo para la imagen (Figura 2i).

6. Posicionamiento de la muestra

Figura 3: Cámara de muestras. (a) Tubo FEP montado en un portamuestras. b) La cámara de muestra con etapas y objetivos. c) Vista superior de la cámara de muestras llena de medios, con objetivo de iluminación y detección en una configuración T-SPIM. d) Soporte de muestra montado en el microscopio, con la muestra en la cámara. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Posicionamiento embrionario para imágenes cardíacas. (a) Pez cebra 24 hpf Tg(kdrl:Hsa.HRAS-mCherry) con ojos desalineados. a') Mismo pez, con los ojos alineados. b) Los mismos peces giraron -100 ° y (b') -50 ° para obtener imágenes óptimas del corazón. c) pez cebra de 48 hpf con los ojos desalineados. c') Mismo pez, con los ojos alineados. (d) Mismo pez girado por 30° para una óptima imagen del corazón. Las flechas negras apuntan al corazón. Barra de escala 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

1. En el microscopio, monte el tubo FEP en el soporte de la muestra (Figura 3a) y llene la cámara de imágenes con medios de incrustación (Figura 3b, c). A continuación, coloque el soporte de muestra en el escenario con la muestra sumergiéndose en la cámara (Figura 3d).
2. Compruebe el estado de la muestra. Evalúe visualmente la frecuencia cardíaca para evaluar el bienestar general de los peces, ya que la frecuencia cardíaca específica depende de la etapa y la temperatura, comparándola con los peces de control no montados. Si los latidos del corazón son demasiado lentos, deseche el pescado.
   NOTA: Asegure un manejo suave de los embriones, una transferencia cuidadosa a los medios de incrustación, la obtención de imágenes inmediatamente después de la incrustación, evite los cambios rápidos de temperatura, evite la tricaína y reduzca el tiempo de exposición a la tricaína.
3. Para obtener imágenes reproducibles, utilice siempre la misma posición de la muestra. Se recomienda alinear los ojos y obtener imágenes en ángulo.
4. Gire el pez de modo que ambos ojos (Figura 4a,c) estén en el plano focal (Figura 4a',c')
5. Desde esa posición, gire aún más el pez aproximadamente 50 ° -100 ° en el sentido de las agujas del reloj para imágenes de 24 hpf (Figura 4b, b'), y aproximadamente 20 ° -30 ° en sentido contrario a las agujas del reloj para imágenes de 48 hpf (Figura 4d).
   NOTA: El corazón temprano, antes de 30 hpf, puede ser difícil de visualizar debido a su posición oculta (Figura 4b).

7. Adquisición de imágenes

1. Elija el lado de iluminación que brinde la mejor calidad de imagen y adapte la potencia del láser a cada pez.
   NOTA: Registre la potencia del láser utilizada para el análisis posterior de imágenes.
2. En cada plano z, grabe de 4 a 5 latidos cardíacos a 300 fotogramas por segundo (fps) o más.
   NOTA: El campo de visión se puede recortar para aumentar la velocidad de adquisición. Por ejemplo, a 48 hpf el corazón del pez cebra late de dos a tres veces por segundo, por lo tanto, a 300 fps, se requieren entre 300 y 600 cuadros para adquirir de cuatro a seis latidos.
3. Para grabar el corazón que late, mueva la muestra paso a paso a través de la hoja de luz. Use un espaciado z de 1-2 μm, que cubra toda la profundidad del corazón.

8. Procesamiento de imágenes

1. Sincronice la película grabada para reconstruir un corazón 4D (x, y, z, tiempo) utilizando un complemento de Fiji (Imagen ^J229,30) como se describió ^{anteriormente6}.
2. Para explorar datos y generar películas del corazón de pez cebra renderizado, cargue el archivo 4D (x, y, z, tiempo) en un software de renderizado 3D.

Figura 5: El corazón de pez cebra de 48 hpf. (a) Fotograma de un z-frame, vista ventral anterior de 48 hpf Tg(kdrl:Hsa.HRAS-mCherry; myl7:lck-EGFP) pez cebra, fotografiado con LSFM, (b) reconstrucción 3D de pilas de películas, vista cortada a través del atrio. c) Montaje de cuatro fotogramas sobre un latido cardíaco completo en un plano z. Los gráficos circulares indican el tiempo durante los latidos del corazón. Barra de escala 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Hemos registrado el corazón palpitante de 48 hpf del pez cebra Tg(kdrl:Hsa.HRAS-mCherry; myl7:lck-EGFP) de acuerdo con el protocolo detallado anteriormente (Figura 5). Una hoja de luz láser de 488 nm y una de 561 nm iluminaron la muestra simultáneamente. La fluorescencia emitida se detectó perpendicularmente utilizando una lente de objetivo de 16x/0.8 W y una cámara científica de semiconductores de óxido metálico (sCMOS).

A 48 hpf, el corazón acaba de someterse a un bucle y tiene dos cámaras, el ventrículo y la aurícula, pero aún no ha desarrollado válvulas. En nuestras películas, las diferentes estructuras cardíacas como el tracto de entrada, el ventrículo, el canal auriculoventricular (AVC), la aurícula y la pista de salida son fácilmente distinguibles (Figura 5a, b). Estos datos muestran el latido preciso y revelan interacciones complejas entre las dos capas celulares del corazón: el miocardio, una capa muscular unicelular que se contrae y genera fuerza (Figura 5c, roja), y el endocardio, una capa de una sola célula que conecta el corazón con la vasculatura (Figura 5c, cian).

La reconstrucción del latido del corazón en x,y,z (3D) + tiempo (4D) + color (5D) se realizó según Mickoleit et al.6. La reconstrucción se basa en dos hipótesis: el movimiento del corazón es repetitivo y los datos deben adquirirse con un pequeño paso z. La salida es un latido único reconstruido en 5D, que mide de 30 GB a 80 GB por latido cardíaco. Para renderizar los datos, utilizamos la herramienta gratuita de código abierto FluoRender para la representación en profundidad31 , ya que fue diseñada para manejar conjuntos de datos multidimensionales y renderiza fácilmente películas 5D tanto de capas de celdas como de capas individuales (Figura 5b).

Los autores no tienen nada que revelar.