Se ha presentado un protocolo para la obtención de imágenes de los microtúbulos dinámicos in vivo utilizando la proteína de unión al extremo etiquetada fluorescentemente. Describimos los métodos para etiquetar, obtener imágenes y analizar los microtúbulos dinámicos en la neurona del microtúbulo lateral posterior (PLM) de C. elegans.
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Artículo de método
In vivo Evaluación de la dinámica y orientación de los microtúbulos en las neuronas caenorhabditis elegans
En este artículo
Resumen
Resumen
En las neuronas, la orientación de los microtúbulos ha sido un evaluador clave para identificar los axones que tienen microtúbulos y dendritas de extremo superior que generalmente tienen una orientación mixta. Aquí describimos métodos para etiquetar, obtener imágenes y analizar la dinámica y el crecimiento de los microtúbulos durante el desarrollo y la regeneración de las neuronas táctiles en C. elegans. Usando reporteros fluorescentes codificados genéticamente de puntas de microtúbulos, tomamos imágenes de los microtúbulos axonales. Los cambios locales en el comportamiento de los microtúbulos que inician la regeneración del axón después de la axotomía se pueden cuantificar utilizando este protocolo. Este ensayo es adaptable a otras neuronas y antecedentes genéticos para investigar la regulación de la dinámica de los microtúbulos en diversos procesos celulares.
Introducción
Las neuronas tienen una arquitectura elaborada con compartimentos especializados como dendritas, cuerpos celulares, axones y sinapsis. El citoesqueleto neuronal está constituido por los microtúbulos, microfilamentos y neurofilamentos y su organización distinta soporta los compartimentos neuronales estructural y funcionalmente1,2,3,4,5,6,7,8,9,
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Protocolo
1. Cepa reportera: Cultura y mantenimiento
NOTA: Para medir la dinámica y orientación de los microtúbulos en las neuronas PLM, utilizamos la cepa de gusano que expresa EBP-2::GFP bajo el promotor específico de la neurona táctil mec-4 (alelo juIs338) 18,25,26. Utilizamos métodos estándar de cultivo y mantenimiento de gusanos para esta cepa27.
- Preparar el nematodo growth medium (3,0 g/L de cloruro de sodio, 2,5 g/L de peptona, 20,0 g/L de agar, 10 mg/L d....
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Resultados
Como ejemplo representativo, hemos descrito la observación in vivo de los cometas EBP en estado estacionario y los axones regeneradores de las neuronas PLM. Las neuronas PLM se encuentran en la región de la cola del gusano con un proceso anterior largo que forma una sinapsis y un proceso posterior corto. Las neuronas PLM crecen en la dirección anterior-posterior cerca de la epidermis y son responsables de la suave sensación de tacto en los gusanos. Debido a su estructura simplificada y su facilidad para la obtención de i.......
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Discusión
La comprensión de la dinámica de los microtúbulos ha sido un enfoque clave en el campo de la investigación citoesquelética a lo largo de los años. Los microtúbulos sufren nucleación y catástrofe junto con un proceso continuo de inestabilidad dinámica44,45,46,47. Gran parte de esta información se ha obtenido a través de ensayos in vitro como lecturas de dispersión de.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no hay conflictos de intereses.
Agradecimientos
Agradecemos a Yishi Jin y Andrew Chisholm por el apoyo inicial y la cepa utilizada en el estudio. La cepa bacteriana OP50 fue aprovechada comercialmente del Caenorhabditis Genetics Center (CGC) financiado por la Oficina de Programas de Infraestructura de Investigación de los NIH (P40 OD010440). También agradecemos a Dharmendra Puri por la estandarización de los procedimientos experimentales. El estudio está financiado por la subvención básica del Centro Nacional de Investigación del Cerebro (apoyado por el Departamento de Biotecnología, Gobierno de la India), DBT / Wellcome Trust India Alliance Early Career Grant (Grant # IA/ E/18/1/504331) a S.D., Wellcome Trust-DBT ....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| CZ18975 cepa de gusano | Yishi Jin lab | CZ18975 | Generado por Anindya Ghosh-Roy |
| Agarosa | Sigma | A9539 | Gusanos de montaje |
| Cubreobjetos (18 mm x 18 mm) | Zeiss | 474030-9010-000 | Gusanos de montaje |
| Baño seco con bloque calefactor | Neolab | Gusanos de | |
| montaje Portaobjetos de vidrio (35 mm x 25 mm) | Blue Star | Solución de perlas de | |
| poliestireno (4,55 x 10^13 partículas/ml en medio acuoso con tensioactivo mínimo) | Polysciences Inc. | 00876 | Gusanos de montaje |
| Tubos de | Gusanos de montaje | ||
| OP50 cepa bacteriana | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | Manipulación de gusanos |
| Placas de Petri de 60 mm | Praveen Scientific | 20440 | Manipulación de gusanos |
| Aspirador/Capilar | VWR | 53432-921 | Incubadora de manipulación de gusanos |
| Panasonic | MIR554E | Manipulación de gusanos | |
| Alambre | Manipulación de gusanos | ||
| Microscopio estereoscópico con accesorio de fluorescencia | Leica | M165FC | Manipulación de gusanos |
| 0,3% Cloruro de sodio | Sigma | 71376 | de crecimiento de nematodos |
| 0,25% Peptona | T M Media | 1506 | Medio de crecimiento de nematodos |
| 10 mg/mL Colesterol | Sigma | C8667 | Medio de crecimiento de nematodos |
| 1mM Cloruro de calcio dihidratado | Sigma | 223506 | Medio de crecimiento de nematodos |
| 1mM Sulfato de magnesio heptahidratado | Sigma | M2773 | Medio de crecimiento de nematodos |
| 2% Agar | T M Media | 1202 | de crecimiento de nematodos |
| 25mM monobásico de potasio dihidrógeno fosfato | Sigma | P9791 | Medio de crecimiento de nematodos |
| 0,1M Monobásico Potasio dihidrógeno fosfato | Sigma | P9791 | 1X Tampón M9 |
| 0,04M Cloruro de sodio | Sigma | 71376 | 1X Tampón M9 |
| 0,1M Cloruro de amonio | Fisher Scientific | 21405 | 1X Tampón M9 |
| 0,2M Dibásico Hidrogenofosfato disódico heptahidratado | Sigma | S9390 | 1X Tampón M9 |
| Botellas de vidrio | Borosil | Almacenamiento en búfer | |
| láser de 488 nm | Objetivo Zeiss | Imaging | |
| 5X | Zeiss | Imaging | |
| 63X | Cámara de imágenes | Zeiss | |
| Photometrics | Evolve 512 Delta | Imaging | |
| Sistema informático para unidad de disco giratorio | HP | Intel ® Xeon CPU E5-2623 3.00GHz | Imágenes |
| Microscopio de epifluorescencia | Zeiss | Observer.Z1 | Imagen |
| Lámpara halógena | Zeiss | ||
| Imaging Lámpara de arco de mercurio | Zeiss | Imaging | |
| Unidad de disco giratorio | Yokogawa | CSU-X1 | Imaging |
| ZEN2 software Zeiss | Imaging | ||
| Image J (Fiji Versión) | Análisis y procesamiento de imágenes | ||
| Adobe Creative Cloud | Adobe | Análisis y procesamiento de imágenes | |
| Sistema informático para el análisis de imágenes | Dell | Intel ® Núcleo y comercio; i7-9700 CPU 3.00GHz | Procesamiento/Representación de imágenes |
Referencias
- Bush, M. S., Eagles, P. A. M., Gordon-Weeks, P. R. The neuronal cytoskeleton. Cytoskeleton: A Multi-Volume Treatise. 3, 185-227 (1996).
- Kapitein, L. C., Hoogenraad, C. C. Building the Neuronal Microtubule Cytoskeleton. Neuron. 87 (3), 492-506 (2015).
- Tas, R. P., Kapitein, L. C.
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Reimpresiones y permisos
