Este protocolo presenta un método para aislar el ARN de las biopelículas de Pseudomonas aeruginosa cultivadas en portaobjetos de cámara para la secuenciación de alto rendimiento.
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Artículo de método
Este protocolo presenta un método para aislar el ARN de las biopelículas de Pseudomonas aeruginosa cultivadas en portaobjetos de cámara para la secuenciación de alto rendimiento.
Pseudomonas aeruginosa es un patógeno bacteriano oportunista que causa infecciones en las vías respiratorias de los pacientes con fibrosis quística (FQ). P. aeruginosa es conocida por su capacidad para formar biopelículas que están protegidas por una matriz de exopolisacáridos. Esta matriz permite que los microorganismos sean más resistentes a los factores externos, incluido el tratamiento con antibióticos. Uno de los métodos más comunes de crecimiento de biopelículas para la investigación es en placas de microtitulación o portaobjetos con cámara. La ventaja de estos sistemas es que permiten probar múltiples condiciones de crecimiento, pero su desventaja es que producen cantidades limitadas de biopelícula para la extracción de ARN. El propósito de este artículo es proporcionar un protocolo detallado, paso a paso, sobre cómo extraer ARN total de pequeñas cantidades de biopelícula de calidad y cantidad suficientes para una secuenciación de alto rendimiento. Este protocolo permite el estudio de la expresión génica dentro de estos sistemas de biopelículas.
La mayoría de las infecciones bacterianas crónicas, como las infecciones pulmonares en pacientes con fibrosis quística (FQ) y las infecciones relacionadas con prótesis, se caracterizan por el crecimiento de microorganismos dentro de biopelículas. Las biopelículas1 son comunidades de bacterias encerradas en una matriz compuesta principalmente por polisacáridos2. Las bacterias dentro de las biopelículas pueden ser de crecimiento lento, metabólicamente inactivas y en condiciones anaeróbicas e hipóxicas. Las biopelículas son más resistentes a los antibióticos debido a factores como la dismin....
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El Comité de Ética de la Investigación (REB) es necesario para la recolección y el procesamiento de muestras de esputo de sujetos humanos. Este estudio fue aprobado por el Hospital for Sick Children (REB#1000019444). El Comité de Ética en Investigación (REB, por sus siglas en inglés) está obligado a recolectar y almacenar muestras de esputo de sujetos humanos. Estos estudios fueron aprobados por el Hospital para Niños Enfermos REB#1000058579.
1. Formación de biopelículas
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La descripción general del método se muestra en la Figura 1. Anteriormente utilizamos portaobjetos de cámara de 8 pocillos para cultivar biopelículas de P. aeruginosa y exponerlas a antibióticos antes de examinarlas mediante microscopía confocal en diferentes puntos temporales12,13. Este método se puede utilizar para extraer ARN total directamente de biopelículas cultivadas en este sistema con el fin de estudiar los cambios .......
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El ARN total se extrae con éxito de 17 muestras diferentes de biopelícula bacteriana por triplicado, lo que produce un total de 51 muestras. Las cuarenta y nueve bibliotecas de ARN se agrupan y se secuencian con éxito. En general, esto valida nuestros criterios de calidad con una tasa de éxito del 96 %, a pesar de que más de la mitad de las muestras se consideran de baja abundancia y de calidad subóptima 34,35,36,37.
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Los autores no tienen divulgaciones que declarar.
Contribuciones de los autores: P.W., Y.Y. y V.W participaron en la conceptualización del estudio. K.G., L.J., A.M. y P.W. optimizaron los protocolos de laboratorio. La financiación de K.G. fue apoyada por el subsidio del Programa de Colocación Laboral Estudiantil a través de BioTalent Canada.
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| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2939BA | Electroforesis automatizada de biomoléculas |
| Agilent RNA 6000 pico kit | Agilent | 5067-1513 | Chip de electroforesis de ARN de alta sensibilidad para generar un |
| tampón de lisis de ADN/ARN | Zymo Research | D7001-1-50 | Un tampón de lisis a base de tiocianato de guanidinio y N-lauroilsarcosina vendido como parte de un kit de purificación de ácidos nucleicos |
| Tampón de preparación de ADN/ARN | Zymo Research | D7010-2-10 | Un tampón de guanidina HCl y etanol utilizado para la purificación de ADN y ARN |
| Escudo de ADN/ARN | Zymo Research | R1100-50 | Reactivo de conservación/protección de ADN y ARN |
| Tampón de lavado de ADN/ARN | Zymo Research | D7010-3-6 | Un tampón de sal y etanol utilizado para la purificación de ADN y ARN |
| DNBSEQ G-400RS | MGI | G-400RS | Secuenciador de alto rendimiento |
| MGIEasy RNA Directional Library Prep Set | MGI | 1000006386 | Genere bibliotecas para plataformas de secuenciación de alto rendimiento MGI a partir de ARN total. |
| Mini-Beadbeater-96 | BioSpec | 1001 | A disruptor celular de alta energía y alto rendimiento |
| NEBNext rRNA Depletion Kit (bacterias) | New England Biolabs | E7850X | Agotamiento eficiente y específico del ARNr bacteriano (5S, 16S, 23S) |
| Sistema de portaobjetos de cámara Nunc Lab-Tek II | Thermo Fisher Scientific | 154534 | portaobjetos de 8 pocillos con pocillos extraíbles |
| Fluorímetro | QubitThermo Fisher Scientific | Q33238 | Fluorómetro para ADN, ARN y proteínas |
| Qubit RNA HS Assay Thermo | Fisher Scientific | Q32852 | Ensayo fluorométrico de alta sensibilidad para medir la concentración de ARN |
| Filtros Spin-Away | Zymo Research | C1006-50-F | Columna de centrifugación a base de sílice utilizada principalmente para unir o eliminar el ADN genómico |
| Asas de inoculación estériles, 1 uL | Sarstedt | 86.1567.050 | Asas de inoculación estériles y desechables para la manipulación de microorganismos |
| ZR BashingBead Tubos de lisis Zymo | Research | S6003-50 Tubos de | 2 ml que contienen una matriz de lisis de perlas de 0,1 y 0,5 mm para homogeneizar muestras biológicas |
| Columnas Zymo Spin IIICG Zymo | Research | C1006-50-G | Columna de centrifugación a base de sílice para la purificación de ADN y ARN |
| Filtros Zymo-Spin III-HRC | Zymo Research | C1058-50 | Eliminar inhibidores como compuestos polifenólicos, ácidos húmicos/fúlvicos, taninos, melanina, etc. |
| Kit de minipreparación de ADN/ARN Zymobiomics | Zymo Research | R2002 | Kit de extracción dual de ADN y ARN |
| Zymobiomics HRC Prep solution | Zymo Research | D4300-7-30 | Para usar con los filtros Zymo-Spin III-HRC para eliminar inhibidores de PCR |
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