Un método escalable para estudiar la supervivencia neuronal en cultivo neuronal primario con resolución unicelular y en tiempo real

Resumen

Aquí, presentamos una metodología simple, potente y versátil para investigar la supervivencia neuronal ante el estrés citotóxico en neuronas corticales primarias con resolución celular en tiempo real o en material fijo.

Resumen

La pérdida neuronal está en el centro de muchas neuropatologías, como los accidentes cerebrovasculares, la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson. Se desarrollaron diferentes métodos para estudiar el proceso de supervivencia neuronal ante el estrés citotóxico. La mayoría de los métodos se basan en enfoques bioquímicos que no permiten la resolución de una sola célula o implican metodologías complejas y costosas. Aquí se presenta un paradigma experimental versátil, barato y eficaz para estudiar la supervivencia neuronal. Este método aprovecha el escaso marcaje fluorescente de las neuronas seguido de imágenes en vivo y cuantificación automatizada. Con este fin, las neuronas se electroporan para expresar marcadores fluorescentes y se cocultivan con neuronas no electroporadas para regular fácilmente la densidad celular y aumentar la supervivencia.

El etiquetado disperso por electroporación permite una cuantificación automatizada sencilla y robusta. Además, el marcaje fluorescente puede combinarse con la coexpresión de un gen de interés para estudiar vías moleculares específicas. Aquí, presentamos un modelo de accidente cerebrovascular como modelo neurotóxico, a saber, el ensayo de privación de oxígeno-glucosa (OGD), que se realizó en una cámara hipóxica casera asequible y robusta. Por último, se describen dos flujos de trabajo diferentes utilizando IN Cell Analyzer 2200 o el ImageJ de código abierto para el análisis de imágenes para el procesamiento semiautomático de datos. Este flujo de trabajo puede adaptarse fácilmente a diferentes modelos experimentales de toxicidad y ampliarse para un cribado de alto rendimiento. En conclusión, el protocolo descrito proporciona un modelo in vitro de neurotoxicidad accesible, asequible y eficaz, que puede ser adecuado para probar las funciones de genes y vías específicas en imágenes en vivo y para el cribado de fármacos de alto rendimiento.

Introducción

El estudio de los trastornos neuronales requiere modelos experimentales que sean susceptibles de análisis genéticos, moleculares y celulares. Las neuronas corticales primarias son un modelo muy potente para estudiar la supervivencia neuronal y la toxicidad 1,2,3,4. En las condiciones adecuadas, las neuronas primarias desarrollarán progresivamente contactos sinápticos y presentarán características distintivas de neuronas maduras. Por lo tanto, este modelo es más fiable que las líneas celulares inmortalizadas para modelar la fisiología de las neuronas y más susceptible a manipulaciones que los modelos animales. Sin embargo, en comparación con las líneas celulares, las neuronas corticales primarias son difíciles de transfectar y relativamente frágiles. Además, la intrincada morfología de las neuronas corticales puede complicar la obtención de imágenes y el análisis en cultivos de alta densidad. Por el contrario, los cultivos neuronales primarios de baja densidad son más fáciles de analizar, pero tienden a ser más frágiles.

Teniendo todo esto en cuenta, este trabajo presenta un flujo de trabajo in vitro asequible, versátil y escalable para modelar e investigar la supervivencia neuronal (Figura 1). Los puntos clave de este protocolo son: i) el método de electroporación in vitro de las neuronas con un marcador fluorescente para permitir el marcaje y la obtención de imágenes dispersas de células vivas; ii) su versatilidad en diferentes modelos de citotoxicidad; y iii) el análisis semiautomatizado o automatizado.

El sistema de electroporación (ver Tabla de Materiales) proporciona un procedimiento abierto y económico que no involucra kits y soluciones específicas ^4,5,6. Además, este método se puede adaptar fácilmente para obtener una eficiencia de transformación y densidad óptimas de las neuronas transfectadas, mezclando células electroporadas con células no electroporadas. El cocultivo con neuronas ingenuas (no electroporadas) mejora significativamente la viabilidad de las células electroporadas en comparación con los cultivos de baja densidad. Además, permite un marcaje disperso con una densidad ajustable de las neuronas electroporadas, manteniendo un nivel constante de expresión génica. Es importante apuntar a un 3-5% de neuronas electroporadas en los ensayos de supervivencia.

Tener un etiquetado escaso facilita esencialmente la automatización del análisis de imágenes porque las celdas están bien separadas y se distinguen fácilmente. En particular, este paradigma experimental puede adaptarse para probar múltiples genes de interés mediante el co-cultivo simultáneo de neuronas co-electroporadas con diferentes marcadores fluorescentes citosólicos (por ejemplo, proteína fluorescente cian, proteína fluorescente roja (RFP), proteína fluorescente verde (GFP)) en el mismo pocillo. Al igual que otros ensayos de citotoxicidad (por ejemplo, yoduro de propidio o lactato deshidrogenasa), el ensayo descrito en este documento se basa en el hecho de que la muerte neuronal se acompaña de la ruptura de la membrana celular. Esto provoca la liberación de proteínas citosólicas por difusión y, en consecuencia, la pérdida de fluorescencia de GFP.

Un modelo in vitro de accidente cerebrovascular, el modelo OGD, se presenta como ejemplo de neurotoxicidad ^7,8,9. Este protocolo consiste en exponer las neuronas primarias a un tampón de sal similar a un líquido cefalorraquídeo artificial, pero privado de oxígeno y glucosa. A pesar de que este modelo se ha presentado como un ejemplo de estrés neurotóxico, se pueden probar diferentes condiciones citotóxicas con el mismo flujo de trabajo ^8,9. Por último, el etiquetado disperso permite fácilmente el desarrollo de análisis de imágenes automatizados. En este caso, se estableció un protocolo basado en la inmunofluorescencia estándar y el análisis de ImageJ en una configuración más pequeña. A continuación, este flujo de trabajo se adaptó y amplió utilizando un sistema de imágenes celulares que permite un análisis automatizado en imágenes en vivo en modos de rendimiento medio y alto. En conclusión, este trabajo presenta una metodología flexible, asequible y escalable para estudiar la supervivencia neuronal en diferentes modelos experimentales de toxicidad utilizando imágenes en vivo y cuantificación automatizada.

Protocolo

Todos los procedimientos con animales deben ser supervisados por el comité de bioética animal del instituto y realizarse de acuerdo con las regulaciones locales. Los procedimientos aquí presentados fueron aprobados por la autoridad delegada y cumplen con la normativa vigente en España y Europa.

1. Cultivo neuronal primario

NOTA: Todos los pasos se realizan dentro de la campana de cultivo, utilizando materiales y soluciones estériles para mantener las condiciones estériles.

1. Recubrimiento de poli-L-lisina (PLL)
   1. Lave los cubreobjetos (CV, 15 mm) con etanol al 70% durante la noche (o/n) en un agitador orbital.
      NOTA: La velocidad del agitador orbital debe ser suficiente para mover el CV suavemente, pero no demasiado rápido para evitar dañar o rayar los CV. Las RPM específicas variarán según el modelo del agitador. Los CV pueden almacenarse en etanol durante largos períodos (meses).
   2. Retire el etanol y lave dos veces con agua desionizada durante 10 minutos cada uno.
   3. Deje que los CV se sequen a temperatura ambiente (RT) en una placa de Petri de 100 mm (13 CV/placa aproximadamente). Asegúrese de que los CV no se toquen entre sí ni con los bordes de la placa.
      NOTA: Los CV secos se pueden almacenar en RT durante largos períodos (meses).
   4. Prepare la solución madre de PLL de 5 mg/mL en agua, haga alícuotas y guárdelas a -20 °C. Diluir la solución madre en 1x PBS hasta una concentración de trabajo de 0,1 mg/mL.
      NOTA: Se pueden analizar concentraciones más altas de hasta 1 mg/mL de PLL.
   5. Agregue el volumen mínimo de PLL para cubrir la superficie de los CV (ver volúmenes óptimos de PLL en la Tabla 1). Agregue la solución de PLL gota a gota para facilitar la formación de una gota.
      NOTA: La siembra de neuronas en los CV es necesaria para la inmunofluorescencia. Para la obtención de imágenes de lapso de tiempo (por ejemplo, para la célula IN), las células se colocan directamente sobre el pocillo sin CV porque los CV pueden moverse durante el lapso de tiempo. En ese caso, agregue el volumen mínimo de PLL para cubrir la superficie de cada pocillo.

Superficie	Volumen PLL (mL)
Cubreobjetos 15 mm	0.2
Cubreobjetos 13 mm	0.18
Placa de 96 pocillos	0.07
Placa de 24 pocillos	0.3
Placa de 6 pocillos	2
Placa de 60 mm	4.5

Tabla 1: Volúmenes óptimos de poli-L-lisina según la superficie.

6. Incubar durante un mínimo de 1 h a 37 °C.
   NOTA: El período de incubación puede ser tan largo como o/n.
7. Retire el PLL de los CV y lávelos dos veces con agua desionizada durante 10 minutos cada uno. Deja que los CV se sequen en RT.
   NOTA: La solución de PLL puede almacenarse a 4 °C para su reutilización (3 veces como máximo).
8. Almacene los CV secos dentro de una placa de Petri a 4 °C (hasta 7-10 días) o colóquelos dentro de los pocillos con medio de recubrimiento (ver composición en la Tabla 2 y volúmenes de trabajo en la Tabla 3). Agregue el medio de recubrimiento directamente a los pocillos de las placas de 12 pocillos (Tabla 3).
   NOTA: Las neuronas son muy sensibles a la calidad del suero fetal bovino (FBS). Se deben analizar diferentes lotes de FBS para identificar el lote en el que las células se ven más saludables. Una vez identificado un buen lote de FBS, se recomienda obtener una gran cantidad y almacenarla a -80 °C. Este protocolo podría adaptarse a otros tipos de CV y placas (ver los diferentes volúmenes de trabajo en la Tabla 3).

Medio de recubrimiento
MEM		42.5	Ml
10% Suero de caballo o FBS*		5	Ml
30% de glucosa (0,6% concentración final)		1	Ml
PS (penicilina, 10000 U/mL; estreptomicina, 10 mg/mL);		0.5	Ml
Medio de electroporación
Opti-MEM
Medio neuronal
Medio neurobasal		48.5	Ml
B-27		1	Ml
Glutamax 200 mM		0.125	Ml
PS (penicilina, 10000 U/mL; estreptomicina, 10 mg/mL);		0.5	Ml
OGD Medio (Tasca, et al. 2014)
CaCl2		1	milímetro
Kcl		5	milímetro
NaCl		137	milímetro
KH2PO4		0.4	milímetro
Na2HPO4		0.3	milímetro
MgCl2		0.5	milímetro
MgSO4		0.4	milímetro
HEPES		25	milímetro
NaHCO3		4	milímetro

Tabla 2: Composición de los diferentes medios utilizados.

Superficie de pozos y placas			Volumen de trabajo
Placa de 96 pocillos	0.32	cm2	0.1	Ml
Placa de 24 pocillos	1.9	cm2	0.5	Ml
Placa de 12 pocillos	3.8	cm2	1	Ml
Placa de 6 pocillos	9.5	cm2	2.5	Ml
Placa de 60 mm	21.5	cm2	6	Ml

Tabla 3: Superficie de los diferentes tipos de placas y volúmenes de trabajo.

2. Preparación del cultivo neuronal
   1. Precalentar (37 °C) y equilibrar (en una atmósfera de 5% de CO₂ ) el medio de placa, el medio neuronal y el medio de electroporación (ver composición en la Tabla 2) en un frasco parcialmente abierto dentro de la incubadora de celdas durante un mínimo de 2 h. Deje que la tripsina se caliente a RT. Precaliente la 1x Solución Salina Equilibrada de Hank's (HBSS) a 37 °C en un baño de agua.
   2. Preajuste los parámetros de electroporación (Tabla 4).

CONDICIONES DE ELECTROPORACIÓN: Pulso de poring
Largura	V	Intervalo	N	D. Tarifa	Polaridad
2 ms	175	50	2	10	más
CONDICIONES DE ELECTROPORACIÓN: Pulso de transferencia
Largura	V	Intervalo	N	D. Tarifa	Polaridad
50	20	50	5	40	más/menos

Tabla 4: Ajustes de electroporación para NEPA21.

3. Disección y recolección del cerebro de ratón CD-1 embryos en E15 post-coito
   1. Sacrificar a la hembra embarazada por luxación cervical sin sedación. Esterilizar el vientre con etanol al 70%; Corta y abre el abdomen con unas tijeras afiladas.
   2. Extraiga el útero y colóquelo en una placa de Petri con 1x HBSS frío. Déjelo en hielo dentro de la campana de cultivo celular con pinzas comunes.
   3. Extrae un embrión del útero con la ayuda de fórceps y tijeras y decapitalo con un solo corte con unas tijeras.
   4. Sujete la cabeza e introduzca pinzas (p. ej., pinzas finas de Dumont) en la órbita del ojo.
   5. Usando la aguja (jeringa de aguja de 30 G) como cuchilla, corte el bregma y rompa la parte posterior de la cabeza.
   6. Introduzca pinzas afiladas a través de la incisión verticalmente en el bregma y rompa la fina capa de piel de la región anterior. Tire de las pinzas para seguir la fisura longitudinal entre los dos hemisferios sin dañar la corteza.
   7. Utilice las pinzas pequeñas en un ángulo de 45°, desde la parte anterior hasta la posterior, para extraer el cerebro de la cabeza.
   8. Mueva el cerebro a una placa de Petri de 3,5 cm con HBSS 1x helado bajo un microscopio estereoscópico.
4. Disección de córticas
   NOTA: El protocolo para el cultivo neuronal es una adaptación del procedimiento descrito por Dotti y Banker¹⁰.
   1. Use las pinzas de Dumont (11 cm) para sujetar el tálamo y una aguja inclinada en un ángulo de 45° para separar la corteza de cada hemisferio del mesencéfalo. Asegurarse de que la corteza no muestre rastros de otros tejidos; Use pinzas afiladas para extirpar las meninges.
      NOTA: Las meninges forman una delgada membrana elástica que envuelve el cerebro y se reconocen fácilmente por su color rojo. Hacer movimientos suaves en zig-zag ayudará a eliminar las meninges. Asegúrese de que se hayan eliminado todas las meninges, ya que son tóxicas para el cultivo.
   2. Mueva la corteza limpia a una placa de Petri limpia de 3,5 cm con 1x HBSS helado y colóquela sobre hielo.
5. Desagregación
   1. Pica cada corteza en dos mitades y utiliza pinzas o una aguja afilada (30 G) para facilitar el efecto de la tripsina en el siguiente paso.
   2. Transfiera las piezas a 7 mL de tampón de tripsina-EDTA a temperatura ambiente en un tubo de 15 mL con una pipeta P1000 (corte 3-4 mm de la punta). Espere hasta que se hundan hasta el fondo de la punta antes de soltarlos de la punta de la pipeta. Mezclar inclinando.
   3. Incubar a 37 °C durante 12 min en un baño de agua. Mezclar inclinando cada 4-5 min.
      NOTA: El tiempo de incubación puede variar de 12 a 15 min.
   4. Deje que el tejido se hunda por gravedad y retire con cuidado la tripsina. Lave el pañuelo dos veces con 8 ml de 1x HBSS y agite suavemente inclinándolo. Retire el 1x HBSS con cuidado con una pipeta P1000 pero con una punta de pipeta sin cortar.
   5. Lave el pañuelo una vez con 5 mL de medio de recubrimiento. Agitar inclinando. Retire el medio de recubrimiento con cuidado con una pipeta P1000.
   6. Agregue 1,5 mL de medio de recubrimiento. Disocie la mezcla mecánicamente con una pipeta P1000 aspirando el medio desde el fondo del tubo y soltándolo suavemente sobre las paredes durante un máximo de 8-12 veces.
   7. Filtre a través de un filtro de células estéril (70 μm) colocado en un tubo de 50 mL. Agregue 10 mL u otro volumen deseado de medio de recubrimiento al tubo.
   8. Introduzca 5 μL de la suspensión celular en la cámara de recuento de células, agregue 5 μL de azul de tripano (0,4% p/v) y cuente las células.
   9. Coloque la placa de las células (ver sección 1.6) transfiriendo un volumen adecuado de la suspensión celular para tener el número deseado de células para la electroporación (por ejemplo, 10^{a 6} células) en un tubo de centrífuga de 15 mL. Centrifugar las células a 250 × g durante 5 min. Continúe con la sección 1.6.
6. Celdas de recubrimiento
   1. Coloque la densidad deseada de la suspensión celular no centrifugada del paso 1.5.7 en cada pocillo que contenga el medio de recubrimiento.
      NOTA: En este protocolo, se sembraron de 100.000 a 200.000 células/pocillo en una placa de 12 pocillos. Como referencia, coloque al menos 3 CV por condición experimental para tener en cuenta la variabilidad experimental. Un entorno experimental típico puede implicar la obtención de imágenes de 4 a 5 campos por CV (por ejemplo, utilizando un objetivo de 20x, se esperaría que cada campo tuviera ~1,3^mm2 de ancho).
   2. Mueva la placa en la campana de cultivo celular en todas las direcciones cardinales para distribuir las células de manera uniforme.
7. Electroporación
   NOTA: Se pueden utilizar otros sistemas de transfección. El sistema NEPA21 utilizado en este protocolo tiene la ventaja de ser un "sistema abierto". El protocolo puede ser modificado por el usuario, y no requiere reactivos específicos para la transfección de cubetas especiales utilizadas para la electroporación. Este protocolo fue modificado de ⁵.
   1. Continúe desde el paso 1.5.9. Vuelva a suspender el pellet de celda con 5 mL de medio de electroporación en un tubo de 15 mL. Centrifugar el tubo a 250 × g durante 5 min.
   2. Repita el paso 1.7.1. Resuspender con medio de electroporación para obtener una concentración de 10⁶ células/mL en cada una de las cubetas de electroporación. Mezcle las células con la cantidad deseada de ADN en la cubeta.
      NOTA: Para la expresión de GFP, se utilizaron 3 μg de plásmido por millón de células. Debido a la alta variabilidad, se recomienda probar la concentración óptima para cada plásmido. Se han analizado entre 2 y 24 μg de plásmido por millón de células. Se pueden combinar diversos plásmidos en la misma cubeta para realizar una doble transfección. En el caso de la co-transfección, transfecte el gen de interés en exceso en comparación con GFP (por ejemplo, 3:1 es una proporción óptima que debe probarse) para asegurar que la mayoría de las células que expresan GFP co-expresan el gen de interés.
   3. Coloque la cubeta en la cámara de la cubeta (Figura 2). Presione el botón Inicio para ejecutar el programa preestablecido (consulte las condiciones de electroporación en la Tabla 4). Registre los valores de las corrientes y los julios que se muestran en el cuadro Mediciones .
      NOTA: El usuario puede cambiar las condiciones específicas. Por ejemplo, la disminución del voltaje puede reducir la eficiencia de la transfección, pero aumentar la supervivencia neuronal.
   4. Saca la cubeta de la cámara. Añada 500 μL del medio de recubrimiento en la cubeta inmediatamente después de la electroporación y transfiera la muestra de la cubeta a un tubo de centrífuga de 1,5 mL con una pipeta.
      NOTA: Cuanto más rápida sea la adición de medio, mejor será la supervivencia después de la electroporación, ya que ayuda a evitar el daño celular.
   5. Coloque el número deseado de celdas electroporadas en cada pocillo.
      NOTA: Placa de 20,000 a 100,000 celdas en una placa de 12 pocillos. Dependiendo de las condiciones, solo el 5-10% de las células electroporadas pueden sobrevivir. El número exacto debe ser probado y adaptado por el usuario.
   6. Incubar durante 2-4 h en condiciones estándar (37 °C, 5% CO₂, humedad saturada).
      NOTA: Después del período de incubación, observe las células bajo el microscopio. Si el cultivo está sano, la mayoría de las células se habrían adherido a la superficie y habrían comenzado a brotar extensiones de neuritas visibles.
   7. Cambie el medio de recubrimiento a medio neuronal (volúmenes y composición en Tabla 1 y Tabla 2, respectivamente).
8. Mantenimiento de las células
   1. Para refrescar el medio, retire la mitad del medio y agregue un volumen igual de medio fresco preequilibrado después de 7 días de cultivo.
   2. En el día 10 de cultivo, reemplace la mitad del volumen con medio neuronal fresco sin el suplemento de glutamina (ver la Tabla de Materiales). Repita este paso cada dos días después del día 10.
      NOTA: Después de 10 días de cultivo, las células producen glutamato por sí mismas.

2. Construcción de la cámara hipóxica

1. Utilice cualquier recipiente hermético con tapa de rosca o un sistema de sellado equivalente para este propósito (Figura 3A). Perfora dos agujeros en la pared del recipiente de plástico e introduce un tubo de plástico en cada uno. Séllalos con silicona para que el recipiente quede herméticamente cerrado (Figura 3).
   NOTA: Aquí, se utilizó un recipiente cilíndrico de plástico (tamaño 1 litro) con una tapa de rosca para construir la cámara. Asegúrese de que el contenedor sea lo suficientemente grande como para acomodar los CV necesarios para el experimento. Para tratar más CV en el mismo espacio, las plataformas de plástico se pueden apilar una encima de la otra (Figura 3A).
2. Para preparar la cámara de burbujeo (véase 3.2), perfore un agujero en la tapa de un matraz, utilizando cualquier taladro mecánico estándar con un taladro ligeramente más pequeño que el tubo, e introduzca un tubo de plástico a través del orificio en el matraz. Selle el orificio con parafilm para mantener el sello hermético (Figura 3B).
3. Esterilizar el recipiente y el matraz con etanol al 70% e irradiar con luz ultravioleta durante un ciclo antes de usarlos.

3. Privación de oxígeno-glucosa (OGD)

NOTA: El protocolo para OGD es una adaptación de Tasca et ^al.7

1. Preparar la solución de OGD con solución de fosfato (Tabla 2) que haya sido previamente suplementada con antibióticos.
   NOTA: Por cada placa de 35 mm, use 5 mL; para una placa de 100 mm, use 10 mL.
2. Agregue la solución de OGD dentro de la cámara de burbujeo (Figura 3B) y colóquela dentro de un baño de agua (ya precalentado a 37 °C). Conecte el matraz con la fuente de nitrógeno (N₂, 100%).
   NOTA: Tenga en cuenta que debido a que la solución OGD contiene HEPES como tampón, no requiere CO₂. Si la solución OGD se basa en un sistema tampón de bicarbonato, utilice un 5% de CO₂ y un 95% de N₂ para saturar la solución hipóxica y la cámara.
3. Sature la solución de OGD con nitrógeno que burbujee suavemente. Deje la solución en un estado ligeramente burbujeante durante 20-30 minutos.
4. Transfiera inmediatamente el matraz a la campana de cultivo celular y agregue 5 mL de la solución de OGD sin oxígeno en placas de 35 mm o 10 mL en placas de cultivo de 100 mm.
5. Mover los CVs con las células cultivadas a las placas con OGD. Sin cubrir las placas, muévalas a la cámara de hipoxia y ciérrelas con firmeza pero con cuidado.
   NOTA: Los pasos 3.4 y 3.5 deben completarse lo más rápido posible. Mantener los CVs de control (Medio Neuronal en normoxia) en las placas de pocillos dentro de la incubadora. Alternativamente, exponga las neuronas de control al medio OGD normóxico suplementado con glucosa (10 mM) para examinar los efectos de la hipoxia y la privación de glucosa de manera más selectiva.
6. Conecte el sistema de nitrógeno a la cámara de hipoxia y verifique que los tubos estén abiertos. Sature la cámara con N₂ durante unos minutos a una presión de 2-3 bares (por ejemplo, 2-3 min; 1 bar = 750 mmHg) (Figura 3C).
   NOTA: No olvide burbujear la solución OGD nuevamente durante 15 minutos entre varios puntos de tiempo.
7. Reduzca la presión de nitrógeno a 1,3-1,5 bares y cierre ambos tubos de la cámara de hipoxia (Figura 3C). Deje la cámara en la incubadora durante el tiempo requerido (por ejemplo, 60 min) a 37 °C, 5% de CO₂.
   NOTA: La duración de la OGD puede requerir un ajuste dependiendo de la condición experimental y los objetivos de la investigación. Un tiempo de incubación corto (por ejemplo, 30 minutos) simularía una hipoxia leve. Dos horas de OGD suelen ser muy duras para las neuronas. Se recomienda probar una duración de OGD de 45 a 90 min antes de comenzar el estudio. Por supuesto, la duración de la OGD tendrá un impacto en la supervivencia total y el inicio relativo de la muerte neuronal después de la recuperación de la OGD. Si el objetivo es analizar la muerte neuronal en tiempo real, trate de lograr condiciones de OGD que provoquen la muerte celular unas horas después de la recuperación de OGD para un análisis más efectivo.
8. Abra la cámara y mueva los CV a su placa multipocillo original para su recuperación. Después de este paso, considere dos alternativas: 1) para experimentos a pequeña escala, proceda a la sección 4 para inmunofluorescencia y análisis de imágenes; 2) Para el cribado de alto contenido, pase a la sección 5 para el análisis en el analizador de células (o plataforma equivalente).
   NOTA: Las imágenes en vivo proporcionan un enfoque más flexible porque permiten el monitoreo en tiempo real de los diferentes puntos experimentales.

4. Análisis por inmunofluorescencia estándar e ImageJ

NOTA: El tiempo de recuperación puede variar de 1 a 24 h dependiendo de las condiciones.

1. Lavar las neuronas con 1x PBS durante 10 min.
   NOTA: Este paso es opcional ya que hay varias formas de proceder y analizar las imágenes.
2. Fije las neuronas con paraformaldehído al 4% durante 10 min en RT. Lávelas tres veces con 1x PBS durante 10 min cada lavado.
   NOTA: Como el paraformaldehído es tóxico, trabaje bajo una cubierta química.
3. Permeabilizar las neuronas añadiendo 1x PBS que contenga 0,1% de Triton X-100 durante 10 min. Lave las celdas rápidamente con 1x PBS. Repita el paso de lavado dos veces durante 10 minutos en cada lavado.
4. Añadir 350 μL de solución bloqueante (1x PBS que contenga un 2% de albúmina sérica bovina) a los CV y dejarlos actuar durante al menos 30 min. Centrifugar el stock de anticuerpos primarios (AB) (5 × g durante 30 s) y mezclarlo con la solución bloqueante a la dilución requerida, por ejemplo, anti-GFP a 1:600.
   1. Transfiera los cubreobjetos al parafilm en una cámara humidificada (una caja con pañuelos empapados en agua para mantener la humedad y evitar la evaporación). Dependiendo del tamaño de los CV, agregue cuidadosamente 60 u 80 μL de la dilución del anticuerpo primario a cada CV y asegúrese de que las células estén en contacto con el anticuerpo. Incubar los CVs o/n a 4 °C.
      NOTA: Se debe formar una gota en la superficie del CV para cubrir toda la superficie del CV. Evite perturbar las células mientras pipetea la solución de anticuerpos en los CV. El tiempo de incubación podría reducirse a 2 h en RT.
5. Lave los CV con 1x PBS durante 10 minutos sobre el parafilm. Repita el paso de lavado dos veces.
6. Diluya el AB secundario, por ejemplo, Alexa 488 (1:500) y 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, 1:2.000) en solución de bloqueo. Dependiendo del tamaño de los CV, agregue una gota de 60-80 μL de la solución AB secundaria en las celdas. Incubar los CVs durante 1 h en la oscuridad a RT. Lavar los AB secundarios y DAPI de las neuronas con 1x PBS durante 10 min y repetir este paso dos veces.
7. Monte los CV en un medio de montaje (consulte la tabla de materiales) para el análisis de inmunofluorescencia y guárdelos en la oscuridad a 4 °C después del secado.
8. Captura y análisis de imágenes.
   NOTA: Se utilizó un microscopio invertido para tomar las imágenes a 20x (Figura 4A, ver la Tabla de Materiales).
   1. Utilice el software de código abierto ImageJ para analizar las imágenes y obtener la máscara para el canal GFP (Figura 4C).
      NOTA: Existen varias formas de obtener imágenes y analizar las neuronas, dependiendo de la disponibilidad de equipos y del formato experimental. El siguiente flujo de trabajo se proporciona como un ejemplo básico en el que el objetivo es identificar el soma de las neuronas individuales que expresan GFP presentes en la imagen. Los valores específicos presentados aquí, como el valor umbral y el tamaño de partícula, deben ser probados por el usuario en función de sus condiciones experimentales específicas. Además, se pueden agregar diferentes filtros y pasos de procesamiento. Por ejemplo, los filtros ImageJ Restar fondo y Eliminar manchas a menudo ayudan a limpiar la imagen al comienzo del procesamiento. La optimización del flujo de trabajo para condiciones experimentales específicas requiere experiencia previa en el análisis de imágenes y el conocimiento de los conceptos básicos del análisis cuantitativo de imágenes. Dado que una guía detallada sobre el análisis de imágenes está fuera del alcance del protocolo actual, recomendamos los siguientes recursos: Guía del usuario de ImageJ, https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/; Para ejemplos y tutoriales, https://imagej.nih.gov/ij/docs/examples/index.htm; Paquete MBF ImageJ, https://imagej.net/mbf/index.htm.
   2. Para la segmentación, seleccione la segmentación de intensidad con los parámetros necesarios para aislar el soma, que es la región más brillante de las neuronas.: Menú | Imagen | Ajustar | Umbral | Establecer umbral mínimo (por ejemplo, 100) | haga clic en Aplicar.
   3. Repita el umbral de 4.8.2. a todas las imágenes para ver la máscara (es decir, la imagen segmentada) para los somas de las neuronas (Figura 4E).
   4. Para obtener el número de celdas supervivientes en cada imagen y exportar los resultados a una hoja de cálculo para realizar cálculos, seleccione Menú | Analizar | Analice las partículas e introduzca los valores de los parámetros necesarios (por ejemplo, Tamaño: 50-píxel infinito; Circularidad: 0,5-1,00). Considere que en t = 0 h, el número de celdas contadas es el número total de celdas identificadas y calcule el porcentaje de celdas que sobrevivieron en los diferentes puntos de tiempo.
      NOTA: Un umbral de tamaño más bajo es útil para filtrar objetos más pequeños que el soma (por ejemplo, 60-80 μm²).
   5. Utilice la función Grabar macro de ImageJ para automatizar y repetir el análisis: Menú | Complementos | Macros | Récord | haga clic en Crear para generar la macro.

5. Análisis en tiempo real con IN Cell Analyzer 2200

1. Inserte la placa de 12 pocillos en el analizador de celdas, conecte el sistema de CO₂ y ajuste la temperatura a 37 °C.
   NOTA: Este paso se puede escalar fácilmente en esta plataforma, realizando un experimento similar en neuronas plateadas en una placa de 96 pocillos.
2. Seleccione el objetivo 20x, seleccione aleatoriamente 5 campos por pocillo (cubriendo el 2,33% del pocillo en este ejemplo) y enfóquelos automáticamente para cada canal de fluorescencia (isotiocianato de fluoresceína [FITC] en este caso). Seleccione los parámetros de adquisición (time-lapse de 30 min durante 16 h). Presione Inicio y espere.
   NOTA: El número de campos de imagen debe ser determinado por el investigador y debe ser suficiente para tener en cuenta la variabilidad dentro de un solo pozo.
3. Utilice IN Cell Developertoolbox v1.9 para configurar el flujo de trabajo adecuado para el análisis.
4. Analice las imágenes de las neuronas (canal FITC) para generar una máscara para el soma de las neuronas (Figura 4).
   NOTA: El objetivo es identificar el soma de las neuronas individuales presentes en la imagen. Este análisis sigue pasos que son equivalentes a los descritos en la sección 4 para ImageJ. Consulte la sección 4 para conocer el flujo de trabajo y las consideraciones generales. El umbral de intensidad se determina para seleccionar el soma, que es la región más brillante de las neuronas.
   1. Para la segmentación, seleccione la segmentación de intensidad con los parámetros necesarios (en este caso, un umbral mínimo de 20005.40).
   2. Para el posprocesamiento, seleccione la opción Tamizar , manteniendo los objetivos con un área mayor que un valor predeterminado (aquí, 189 píxeles (~80 μm²)).
   3. Seleccione el parámetro Suma para contar y sumar todas las neuronas identificadas en la máscara (neuronas supervivientes) para cada campo y para todos los campos de un pozo en cada punto temporal del curso temporal.
   4. Exporta los resultados a una hoja de cálculo. En t = 0 h, considere que el número de celdas contadas es el total de celdas identificadas y calcule el porcentaje de celdas que sobrevivieron en los diferentes puntos de tiempo. Calcule el tiempo en el que el 50% de las células están muertas para facilitar la comparación entre condiciones.
      NOTA: Los parámetros para los pasos de segmentación y postprocesamiento deben ser ajustados por el usuario para diferentes canales fluorescentes dependiendo de las estructuras a identificar.

Resultados

Este protocolo tiene como objetivo establecer un modelo in vitro de ictus. Es importante obtener una densidad neuronal adecuada, que permitirá el reconocimiento de neuronas individuales electroporadas para analizarlas individualmente. La etapa del cultivo neuronal después de la siembra también es crucial. La maduración de las neuronas en cultivo es progresiva. La dependencia de los factores de crecimiento, el crecimiento de neuritas, la conectividad y la actividad electrofisiológica variarán mucho según la etapa...

Discusión

Este protocolo muestra una forma eficaz de modelar un ictus in vitro. Para lograr este objetivo, propusimos el marcaje disperso de las neuronas corticales utilizando el sistema de electroporación NEPA21⁵. Se trata de un sistema abierto que permite la personalización del protocolo con un coste operativo mínimo en comparación con otros sistemas que emplean kits o dispositivos específicos. El cultivo mixto de neuronas naïve y electroporadas permite una mayor...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Placas de Petri de 10 cm	FISHER SCIENTIFIC, S.L.	1130-9283
Placas de Petri de 3,5 cm	Sterilin
Matraz de 75 cm2	Corning	430641U
B-27	Life Technologies	17504-044
Placas de cultivo celular	Incorporación de Corning Costar®	3513
Incubadora de células	Thermo Electron Corporation	Modelo 371
Colador de células 70 µ m	Falcon	352350
Luces frías	Schott	223488	KL 1500
Fundas LCD (15 mm)	Marienfeld	111530
CU500 Cámara de Cubeta	Nepa Gene
CU600 Soporte de soporte para cubetas	Nepa Gene
DAPI	Sigma-Aldrich Quimica, S. L.	D9542-10MG	1:2000
DMSO	Panreac	A3672
Pinzas finas Dumont	FST	11254-20
Pinzas finas Dumont	FST	11252-00
EC-002S Cubetas de electroporación NEPA, espacio de 2 mm	Nepa
	Falcon	352350
Tijeras finas-afiladas-romas	FST	14028-10
Tijeras finas-ToughCut r	FST	14058-09
GFP pollo IgY	Aves Labs	GFP-1010	1:600
Glucosa	Sigma	68769-100ml
GlutaMAX-I Suplemento 200 mM 100 mL	Fisher Scientific	35050-061
HBSS	Thermofisher	14175-095	https://www.thermofisher.com/es/es/home/technical-resources/media-formulation.156.html
Hepes 1 M	ThermoFisher	15630-080
Suero de caballo	Invitrogen	26050088
MEM	Thermofisher	11095080	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11095080#/11095080
portaobjetos de microscopio (polilisina)	VWR	631-0107	Dimensión: 25 x 75 x 1 mm
Mowiol 4-88	Sigma-Aldrich Química, S. L.	81381-250G
Agujas amarillas, calibre 30	BD Microlance™ 3	304000
NEPA21 electroporador	Nepa Gene
Neubauer cámara	Blau Marca 717805
Neurobasal	Medio ThermoFisher	21103-49
Opti-MEM	Invitrogen	31985-062
Parafilm	Cole-Parmer	PM996
Paraformaldehído (PFA), 95%	Sigma-Aldrich Química, S. L.	158127-500G	Solución de uso: 4%
PEI	Polysciences	23966-1
Plásmido para GFP			pCMV-GFP-ires-Cre, descrito en Fazzari et al., Nature, 2010
Poly-L-Lysine	SIGMA	P2636
PS ( Penicilina, Estreptomicina)	ThermoFisher	15140122
Pinzas de sierra	FST	11152-10
Microscopio estereoscópico	WORLD PRECISION INSTRUMENTS
Jeringas	BD Plastipak 1ml	303176
Triton X-100	Sigma-Aldrich Quimica, S. L.	Número MDL: MFCD00128254
Tripsina-EDTA		ThermoFisher
Tubos 15 mL	Fisher	05-539-4
Tubos 50 mL	VWR	21008-242
Tupperware	-	-	Tupper hermético con tapa de rosca. SP Berner - Taper 1 L Redondo con Rosca. Cualquier Tupperware hermético equivalente se puede comprar en cualquier supermercado.
Baño de agua	SHELDON LABORATORY MODELO 1224	1641951

Colador de filtro genético no iónica 25300054