Un método escalable para estudiar la supervivencia neuronal en cultivo neuronal primario con resolución unicelular y en tiempo real

Ángela Rodríguez-Prieto; Ana González-Manteiga; Yaiza Domínguez-Canterla; Carmen Navarro-González; Pietro Fazzari

doi:10.3791/62759

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Artículo de método

Un método escalable para estudiar la supervivencia neuronal en cultivo neuronal primario con resolución unicelular y en tiempo real

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DOI:

10.3791/62759

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26 de julio de 2021

Ángela Rodríguez-Prieto^*¹ , Ana González-Manteiga^*¹ , Yaiza Domínguez-Canterla¹ , Carmen Navarro-González¹ , Pietro Fazzari¹

¹Laboratory of Cortical Circuits in Health and Disease, Centro de Investigación Príncipe Felipe

^* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Aquí, presentamos una metodología simple, potente y versátil para investigar la supervivencia neuronal ante el estrés citotóxico en neuronas corticales primarias con resolución celular en tiempo real o en material fijo.

Resumen

La pérdida neuronal está en el centro de muchas neuropatologías, como los accidentes cerebrovasculares, la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson. Se desarrollaron diferentes métodos para estudiar el proceso de supervivencia neuronal ante el estrés citotóxico. La mayoría de los métodos se basan en enfoques bioquímicos que no permiten la resolución de una sola célula o implican metodologías complejas y costosas. Aquí se presenta un paradigma experimental versátil, barato y eficaz para estudiar la supervivencia neuronal. Este método aprovecha el escaso marcaje fluorescente de las neuronas seguido de imágenes en vivo y cuantificación automatizada. Con este fin, las neuronas se electroporan para expresar marcadores fluorescentes y se cocultivan con neuronas no electroporadas para regular fácilmente la densidad celular y aumentar la supervivencia.

El etiquetado disperso por electroporación permite una cuantificación automatizada sencilla y robusta. Además, el marcaje fluorescente puede combinarse con la coexpresión de un gen de interés para estudiar vías moleculares específicas. Aquí, presentamos un modelo de accidente cerebrovascular como modelo neurotóxico, a saber, el ensayo de privación de oxígeno-glucosa (OGD), que se realizó en una cámara hipóxica casera asequible y robusta. Por último, se describen dos flujos de trabajo diferentes utilizando IN Cell Analyzer 2200 o el ImageJ de código abierto para el análisis de imágenes para el procesamiento semiautomático de datos. Este flujo de trabajo puede adaptarse fácilmente a diferentes modelos experimentales de toxicidad y ampliarse para un cribado de alto rendimiento. En conclusión, el protocolo descrito proporciona un modelo in vitro de neurotoxicidad accesible, asequible y eficaz, que puede ser adecuado para probar las funciones de genes y vías específicas en imágenes en vivo y para el cribado de fármacos de alto rendimiento.

Introducción

El estudio de los trastornos neuronales requiere modelos experimentales que sean susceptibles de análisis genéticos, moleculares y celulares. Las neuronas corticales primarias son un modelo muy potente para estudiar la supervivencia neuronal y la toxicidad 1,2,3,4. En las condiciones adecuadas, las neuronas primarias desarrollarán progresivamente contactos sinápticos y presentarán características distintivas de neuronas maduras. Por lo tanto, este modelo es más fiable que las líneas celulares inmortalizadas....